唾液酸的制備和生物活性研究進展

王夢花，林小仙，琚萌萌，陰佳璐，王東亮*，王姝麒*

(1.山東大學藥學院，山東 濟南 250012；2.北京小仙燉生物科技有限公司,北京 100020;3.河北省燕窩鮮燉技術創(chuàng)新中心,河北 廊坊 065700)

唾液酸是含9個碳的α-酮酸，因其存在的位置和形式不同，唾液酸具有多種活性。位于大腦中的唾液酸，對大腦的發(fā)育中起著重要的作用，能夠提高記憶力和促進腦部發(fā)育，唾液酸在細胞保護、免疫、抗病毒和抗腫瘤等過程中也發(fā)揮著重要作用。唾液酸的主要來源有母乳、乳制品和燕窩，其中燕窩的營養(yǎng)價值巨大，是食物中唾液酸的主要來源。近5年來對燕窩的研究大多與唾液酸有關，燕窩中的唾液酸主要以結合態(tài)存在，游離態(tài)僅占2%左右[1]，結合態(tài)的唾液酸即唾液酸與細胞表面復雜的多糖結合進而發(fā)揮作用。唾液酸的制備方法很多，其中微生物發(fā)酵和全細胞合成制備唾液酸用到的原料便宜、能源消耗低且對環(huán)境影響小。本文研究并總結了唾液酸的來源、制備方法、檢測方法以及其生物活性，對進一步的針對唾液酸的開發(fā)利用提供了理論基礎和參考。

1 唾液酸的來源

唾液酸，又稱為神經(jīng)氨酸，通常由不同的糖苷鍵(α-2,3-、α-2,6-、α-2,8-或α-2,9-)[2]連接在糖蛋白和糖脂的非還原端。唾液酸家族現(xiàn)已超50種以上化合物，其中N-乙?；窠?jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)這兩種最為豐富和重要(結構圖見圖1)。N-乙酰基神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)不僅是人體中的內(nèi)源性唾液酸，還是神經(jīng)系統(tǒng)不可或缺的結構和功能成分[3]。唾液酸最早由Blix等[4]采用弱酸水解的方法從牛的唾液腺粘蛋白中提取分離得到。研究發(fā)現(xiàn)，在動物、植物、真菌、細菌中都可以發(fā)現(xiàn)唾液酸的存在，隨著生物進化程度的增加，唾液酸的種類和含量也在增加，如人類及其他哺乳動物等高等動物體內(nèi)的唾液酸含量要高于低等動物[5]。唾液酸的食物來源主要是燕窩、母乳、乳制品和雞蛋。研究表明，唾液酸在雞蛋和牛奶中的含量分別為0.07%和0.01%[6]。母乳和燕窩中的唾液酸含量很高，Wang等[7]測得母乳初乳中的唾液酸含量可高達2 201.4 mg·L-1，Huang等[8]用高效液相色譜法測定了馬來西亞和印度尼西亞所產(chǎn)燕窩中的唾液酸的含量，含量均在10%左右。

圖1 唾液酸的結構

2 唾液酸的制備

唾液酸的制備方法主要包括天然產(chǎn)物提取、化學法與酶法合成、微生物發(fā)酵法、全細胞合成。天然產(chǎn)物中唾液酸的含量較低，不易進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)?；瘜W法與酶法合成結合使用要求酶是純化的，制備過程較煩瑣。微生物發(fā)酵和全細胞合成與其他方法相比具有環(huán)境友好性、操作簡單、成本低等優(yōu)點，相比微生物發(fā)酵法，全細胞合成縮短了生產(chǎn)周期，提高了底物轉(zhuǎn)化率，降低了能耗。

2.1 天然產(chǎn)物提取 天然產(chǎn)物提取是從含有唾液酸的天然資源中提取唾液酸，如燕窩、禽蛋、雞蛋、茄子、牛奶，常用的提取方法有水提法、酸提法和酶提法。20世紀70年代Martin等[9]用熱水在燕窩中提取到了唾液酸，Wong等[10]使用鹽酸模擬胃液將燕窩中的糖蛋白水解成較小的肽，N-乙酰神經(jīng)氨酸從其結合形式中釋放出來。酸法提取的過程中產(chǎn)物容易發(fā)生降解，酶法提取相對溫和，產(chǎn)物比較穩(wěn)定，因此研究者嘗試用唾液酸酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶對唾液酸進行提取。陳昕露[11]用木瓜蛋白酶提取燕窩中的唾液酸，并對其加工條件進行了優(yōu)化，產(chǎn)物提取率較傳統(tǒng)水提法提高了38.58%。李敬等[12]采用超聲輔助酶法提取燕窩中的唾液酸，用響應面法優(yōu)化燕窩唾液酸的提取工藝，在最佳優(yōu)化工藝參數(shù)下，測得燕窩唾液酸的提取率為84.76%。由于天然產(chǎn)物中唾液酸的含量較低，分離純化的過程比較復雜，回收率低，因此不易進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 化學法與酶法合成 唾液酸的化學合成法第一步N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)與二叔丁基氧代丁二酸的鉀鹽進行縮合，第二步堿的催化下脫羧，生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。此方法不僅需要高溫、高壓這些苛刻的條件，且催化劑銦有毒，產(chǎn)物后處理也非常的復雜且收益較低，因此不能滿足大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。酶法合成通常用N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NanA)催化N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)生產(chǎn)唾液酸，其缺點就是底物價格較貴。在實際應用中化學合成與酶合成法一般結合使用[13]。Hu等[14]使用親和色譜法純化了大腸桿菌中的N-乙酰差向異構酶(AGE)和NanA，將這兩種酶固定化在樹脂上，在反應器中將N-乙酰葡萄糖胺生產(chǎn)為唾液酸，轉(zhuǎn)化率達到了73%。

2.3 微生物發(fā)酵法 與化學法以及酶法合成相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)唾液酸具有環(huán)境友好性，能源消耗低，不需要添加酶，工藝操作簡單，原料易得等優(yōu)點。但是微生物發(fā)酵法具有產(chǎn)物濃度低，且常伴有副產(chǎn)物的缺點，可以通過減少分解代謝、改變合成途徑和平衡前體物的供應來提高其產(chǎn)率[15]。由于合成唾液酸的細菌大多是致病菌，因為大腸桿菌是生物安全的，且其代謝工程遺傳工具系統(tǒng)功能強大，且發(fā)酵工藝成本低[16]，所以常被作為合適的細菌合成唾液酸。過去主要在發(fā)酵罐中生產(chǎn)唾液酸，de Vries等[17]用大腸桿菌在一次性袋式反應器中生產(chǎn)聚唾液酸，改善了發(fā)酵工藝，其濃度達到了245 mg·L-1。隨著對發(fā)酵機制和代謝工程深入研究，研究人員通過調(diào)節(jié)唾液酸的生物合成途徑來提高產(chǎn)率，如Chen等[18]通過敲除編碼NanA的基因，過量表達唾液酸胞苷單磷酸酯合成酶(NeuA)、N-乙酰神經(jīng)氨酸7-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(NeuD)和聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NeuS)，構建了高效的重組大腸桿菌菌株，減少了唾液酸的分解代謝，聚唾液酸的產(chǎn)量提高了85%?？莶菅挎邨U菌也可發(fā)酵生產(chǎn)聚唾液酸，李思杰等[19]優(yōu)化了Pholin啟動子，構建質(zhì)粒具有能夠編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(NeuB)和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構酶(NeuC)的基因，在枯草芽孢桿菌中生產(chǎn)唾液酸，其產(chǎn)量達到了0.226 g·L-1。Zhang等[20]對枯草芽孢桿菌中合成唾液酸的3條途徑的關鍵酶的來源進行了比較和優(yōu)化，并對這些途徑進行了組合和優(yōu)化，分批補料進行發(fā)酵，唾液酸的產(chǎn)量達到了30.10 g·L-1，且這一方法不需要構建質(zhì)粒。Zhang等[21]用模塊化路徑工程對N-乙酰葡萄糖胺和磷酸烯醇式丙酮酸的供應進行了平衡，唾液酸在枯草芽孢桿菌中的產(chǎn)率提高了5倍。

2.4 全細胞合成 全細胞合成是介于酶法合成和微生物發(fā)酵中間的一種合成方法，與酶法合成相比，全細胞合成過程相對簡單，不需要純化的酶，降低了成本。以往通常用兩種不同的宿主偶聯(lián)生產(chǎn)唾液酸。Tao等[22]構建了大腸桿菌的突變體，將AGE和NanA催化的兩個反應包裝在突變體的單細胞中，安全的溫度誘導載體降低了副反應和傳質(zhì)阻力，生物轉(zhuǎn)化效率比偶聯(lián)細胞生產(chǎn)高10倍。Gao等[23]從人腸道中的多形擬桿菌屬中鑒定了一個編碼AGE的基因BT0453，構建了能表達AGE和NanA的大腸桿菌生產(chǎn)唾液酸，產(chǎn)率可高達53.6%。丙酮酸在相關酶的催化下能生成副產(chǎn)物乙偶姻，Zhao等[24]優(yōu)化了控制AGE和NanA的啟動子，敲除編碼乙酰乳酸合成酶的基因alsS和編碼乙酰乳酸脫羧酶的基因alsD，丙酮酸的副產(chǎn)物減少，原料增加，相應的GlcNAc的摩爾轉(zhuǎn)化率達到了55.57%，這同時也證明了枯草芽孢桿菌和大腸桿菌一樣是可以生產(chǎn)唾液酸的全細胞催化劑。

3 唾液酸的檢測方法

高效液相色譜法是檢測唾液酸最常用的方法，常與不同的檢測技術結合來檢測衍生化的唾液酸，其靈敏度和準確性較高。相比高效液相色譜法，傳感器檢測法一般不需要對樣品進行預處理，具有選擇性強和檢測快速的優(yōu)點。

3.1 高效液相色譜法 高效液相色譜一般與不同的檢測技術結合來檢測唾液酸，HPLC-MS具有高靈敏度和高準確性的優(yōu)勢，但由于昂貴的試劑和難以獲得穩(wěn)定的衍生分子，阻礙了該方法應用。王天嬌等[25]應用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法來檢測人血清中的唾液酸，并測得回收率為87.9%～100.4%，相對標準偏差分別為1.2%～3.0%，此方法的回收率、重現(xiàn)性、靈敏度均很好，對于定性或定量檢測血清中唾液酸的含量非常有效。徐柳柳等[26]用4,5-亞甲二氧基-1,2鄰苯二胺鹽(DMB)試劑衍生化唾液酸，利用液相-熒光檢測器檢測酸奶中的唾液酸含量，克服了雜質(zhì)干擾，靈敏度也較高。Li等[27]通過使用吉拉德試劑P對唾液酸進行衍生化，在電噴霧正離子模式下的選擇性離子檢測對唾液酸進行定量分析，此方法靈敏高、穩(wěn)定且通用，滿足了游離唾液酸(FSA)和總唾液酸(TSA)檢測的臨床需要。

3.2 傳感器檢測法 傳感器檢測法之前研究的傳感器大多數(shù)是酶生物傳感器，由于酶的活性具有易發(fā)生變化、不穩(wěn)定、成本比較高等缺點，研究者開始致力于尋找更加穩(wěn)定、簡單、靈敏的傳感器，目前比色傳感器、分子印跡傳感器、熒光傳感器、電化學傳感器都廣泛用于唾液酸的檢測。

電化學發(fā)光生物傳感器的靈敏很高，但易受環(huán)境、儀器波動的干擾，為了解決這一問題，有研究者提出了電化學發(fā)光比率傳感器的策略，Cao等[28]首次提出以Ru(bpy)32+摻雜二氧化鈦納米粒子[TiO2-Ru(bpy)32+NPs]和聚乙烯亞胺(PEI)修飾的硫化鎘(CdS)量子點(PEI-CdS QDS)作為電化學發(fā)光單元，分子印跡聚合物(MIP)作為識別元件，得到了一種高性能的抗干擾的電化學發(fā)光比率傳感器。唾液酸中含有一個甘油側鏈，硼酸可以與甘油側鏈中的二醇結構發(fā)生反應。Chen等[29]用有機電化學晶體管作為傳感平臺，該晶體管有漏極、源極、柵極三個電極，柵電極用羧基化的多壁碳納米管修飾，共價結合3-氨基苯硼酸，3-氨基苯硼酸特異性識別唾液酸，從而使柵電極的電壓發(fā)生改變，在0.1～7 mmol·L-1范圍內(nèi)非常靈敏，且非常便捷，這種基于晶體管的生物傳感器在唾液酸的檢測中具有潛在的巨大價值。

熒光法測定唾液酸，具有操作簡單、靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點。Yu等[30]設計并合成了一種新的有機金屬框架UiO-66-NH2@B(OH)2，UiO-66-NH2@B(OH)2中的硼酸官能團識別唾液酸，使其熒光減弱甚至淬滅，通過小鼠實驗驗證，此法的檢出限低至0.025 mmol·L-1，線性范圍為0.05～2.5 mmol·L-1，具有靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點。

4 唾液酸的生物活性

唾液酸的生物活性主要與其存在的形式和位置有關。細胞表面的唾液酸具有介導免疫黏附、細胞識別和信號傳導等作用，生物體內(nèi)的唾液酸具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、促進腦部發(fā)育等作用。

4.1 促進腦部發(fā)育和提高記憶力 腦組織的中唾液酸含量比身體其他組織都要高，大腦組織中70%結合態(tài)唾液酸以神經(jīng)節(jié)苷脂的形式存在[31]，神經(jīng)節(jié)苷脂是一種酸性鞘糖脂，參與突觸的形成和神經(jīng)的傳遞，而記憶力形成結構基礎是穩(wěn)定的突觸連接[32]，有研究證明缺乏了唾液酸的嬰兒出現(xiàn)了嚴重的發(fā)育遲緩[33]，Xie等[34]發(fā)現(xiàn)在妊娠期或哺乳期給予母鼠燕窩(EBN)，可以改善其后代的學習和記憶功能，表明了唾液酸在神經(jīng)元發(fā)育中的作用。有研究表明在哺乳期提供唾液酸和唾液酸化寡糖，可以增強大鼠的長時程增強作用(LTP)和改善大鼠的記憶力[35]。唾液酸還可以與其他藥物協(xié)同使用治療神經(jīng)疾病，如成亞渝等把更昔洛韋和單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)聯(lián)合起來治療疾病，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著減輕病毒性腦炎伴精神行為異?；純旱陌Y狀，提高患者的神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平，這都證實了唾液酸起著促進腦部發(fā)育和提高記憶力的作用[36]。

帕金森是一種神經(jīng)退行性疾病，臨床研究表明GM1可用于治療帕金森[37]，為了探討其治療機制，蔣暐卿等[38]將魚藤酮注射到小鼠中，誘導其產(chǎn)生帕金森，進而對GM1的治療機制研究，最終證實GM1能保護神經(jīng)元細胞，抑制神經(jīng)元細胞的凋亡，減緩帕金森大鼠的行為學改變。Careena等[39]通過實驗證明燕窩提取物可以對抗內(nèi)毒素誘導的神經(jīng)炎癥，并逆轉(zhuǎn)內(nèi)毒素誘導的神經(jīng)損害，因此燕窩可以作為預防帕金森的一種食物。

4.2 抗病毒 唾液酸不僅是細菌的受體，還是病毒的常見的受體，由此可以通過對唾液酸進行研究探尋抗病毒的新方法。病毒包膜主要由血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種物質(zhì)組成，血凝素與唾液酸受體結合，病毒在靶細胞中進行增殖，通過神經(jīng)氨酸酶裂解唾液酸殘基，使病毒從宿主細胞中釋放出去，因此可以靶向宿主唾液酸和靶向病毒與受體結合的區(qū)域來抗病毒。DAS-181通過裂解宿主細胞上的唾液酸來抑制宿主細胞和病毒的結合，Danziger-Isakov等[40]用DAS-181成功治療了2019年冠狀病毒繼發(fā)性呼吸窘迫的10個月大的嬰兒。有研究用一種小分子化合物CM9與血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白相互作用，改變?nèi)诤系鞍?F)的構象，能夠使病毒感染受阻[41]。Eveno等[42]用唾液酸的衍生物BCX-2798作為抑制劑與HN蛋白的關鍵成分共價結合，有效地抑制了病毒的復制。唾液酸的功能與酶的作用密切相關，乙?；巧窠?jīng)氨酸最常見的修飾，Huang等[43]發(fā)現(xiàn)人類冠狀病毒(hCoV-HKU1)的決定受體是9-O-乙?；僖核?，hCoV-HKU1能夠編碼蛋白血凝素酯酶蛋白(HE)，HE主要作為冠狀病毒的受體破壞酶(RDE)促進病毒子代釋放。唾液酸酶抑制劑的抗病毒作用在抗流感病毒領域得到廣泛應用，因為唾液酸酶的活性是從宿主細胞上釋放新形成的病毒所必需的，抑制該酶可以阻止病毒感染的傳播，奧司他韋是該酶的常見抑制劑，Zhao等[44]設計了一種酰腙類神經(jīng)氨酸酶抑制劑，其IC50要低于奧司他韋。

燕窩是唾液酸的主要食物來源。Guo等[45]的研究表明燕窩提取物可以抑制流感病毒的感染。Haghani等[46]研究燕窩抗流感病毒的機制，發(fā)現(xiàn)燕窩可促進溶酶體的降解、減少自噬小體的積累，從而有效地減少甲型流感病毒的復制，且活性與唾液酸的含量正相關。

4.3 抗炎 近年來對唾液酸的研究主要集中在抗腫瘤功能和神經(jīng)發(fā)育功能，對抗炎的功能研究較少。陳斯瑋等[47]的研究發(fā)現(xiàn)唾液酸能夠提高小鼠的免疫功能，且與劑量成正相關。白細胞介素-4(IL-4)和白細胞介素-10(IL-10)在炎癥和免疫中均起主要作用，具有抗炎的特性，Payazdan等[48]通過研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸可以增強IL-4和IL-10基因的表達，IL-4和IL-10增多，抗炎作用增強。劉偉等[49]通過研究也發(fā)現(xiàn)唾液酸能夠降低白介素-6、腫瘤壞死因子等致炎因子的釋放，增加前列腺素E2釋放，從而發(fā)揮抗炎作用。唾液酸的濃度還可用來區(qū)分炎癥的類別，Gruszewska等[50]的研究表明可以通過測定總唾液酸的濃度來區(qū)分慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎。

4.4 抗腫瘤 唾液酸在腫瘤細胞中高度表達，因此唾液酸可以作為腫瘤標志物來診斷腫瘤，有助于腫瘤的治療。Achalli等[51]通過研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，口腔癌患者的血清和唾液中的唾液酸的平均水平顯著增加，因此血清和唾液中的唾液酸可作為生物標志物來診斷口腔癌。Li等[52]開發(fā)了一種新的試劑盒，可以同時檢測血清中唾液酸和羥脯氨酸的濃度，結果表明，與傳統(tǒng)的腫瘤標志物人附睪蛋白4和碳水化合物抗原125相比，唾液酸和羥脯氨酸的聯(lián)合檢測具有更高的診斷價值，可用于卵巢癌的診斷和動態(tài)檢測。

5 總結

唾液酸的來源廣泛，可通過天然產(chǎn)物提取、微生物發(fā)酵、全細胞合成、化學法和酶法合成制備。微生物發(fā)酵和全細胞合成具有環(huán)境友好性、操作簡單和成本低等優(yōu)點，一些合理的設計方法(改變合成路徑，減少分解代謝、基因重組)都可以提高其產(chǎn)量，是兩種非常具有研究前景的制備技術。檢測唾液酸最常用的方法是高效液相色譜法，相比高效液相色譜法，傳感器檢測法一般不需對樣品進行預處理，且檢測快速、準確性高。唾液酸具有多種生物活性，如促進腦部發(fā)育、抗炎、抗病毒、抗腫瘤。未來的研究可能集中于探索唾液酸的新的生理功能以及其作用機制，并需要開發(fā)新的分析方法來探索其作用。隨著分析方法和合成方法的不斷完善、生理功能的不斷發(fā)現(xiàn)，唾液酸在未來會更好地造福人類。