基于HPLC-MS代謝組學(xué)法對羊肚菌菌湯成分的分析

魯 鐵，李 登，蘇正嫻，鄧立情，宋煜歐，劉 靜，吳凡鴿，姬曉娜，謝朝暉

(河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036)

羊肚菌(Morchellaspp.)又稱麻子菌、狼肚、羊肚菜、羊肚蘑、羊蜂窩蛾子等，是世界公認(rèn)的一種珍貴、稀有的食藥用真菌，因其菌蓋表面凹凸不平、狀如羊肚而得名。羊肚菌分類上隸屬于真菌界子囊菌門(Ascomycota)盤菌綱(Pezizomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)。羊肚菌[Morchellaesculenta(L.)Pers.]是羊肚菌屬的模式種[1-3]。我國明代《本草綱目》中就有“甘寒無毒，益腸胃，化痰利氣” 的記載[4]。近年來羊肚菌栽培技術(shù)得到迅速發(fā)展，羊肚菌菌湯深受消費(fèi)者喜愛。羊肚菌菌湯富含豐富的營養(yǎng)成分，但由于采取的烹飪炊具、烹飪方式不同，導(dǎo)致羊肚菌菌湯的口感千差萬別。

代謝組學(xué)作為新近發(fā)展起來的一門學(xué)科，通過高通量化學(xué)分析技術(shù)對生物樣品進(jìn)行檢測，篩選出具有重要生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的代謝物。李小琳等[5]使用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析包括羊肚菌在內(nèi)的4種野生食用菌干品的揮發(fā)性香氣成分；李翔等[6]使用HS /SPME-GC /MS 法比較分析野生與人工栽培羊肚菌揮發(fā)性成分，檢測出野生和人工栽培羊肚菌揮發(fā)性成分的差異。但目前尚無使用HPLC-MS對羊肚菌菌湯進(jìn)行研究的報(bào)道。

本研究基于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對不同炊具烹飪的羊肚菌菌湯進(jìn)行HPLC-MS代謝組學(xué)分析，同時(shí)對羊肚菌菌湯進(jìn)行總糖及總蛋白的測定，以確定不同炊具烹飪羊肚菌菌湯對其化學(xué)成分的影響，為羊肚菌菌湯成分的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為羊肚菌菌湯的內(nèi)在質(zhì)量綜合評價(jià)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮羊肚菌，采購于寶豐源泉生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。

1.1.2 試劑

考馬斯亮藍(lán)G250、氯化鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇、乙醚、石油醚、濃鹽酸、濃硫酸、苯酚：洛陽市化學(xué)試劑廠；乙腈：Merck,1499230-935；乙酸銨：Honeywell,17836-50G；色譜純正己烷、色譜純甲醇：Fisher公司；色譜純氯仿：沃凱公司；色譜純吡啶：Aladdin公司；甲氧胺鹽酸鹽、L-2氯苯丙氨酸：Damas-beta公司；三氟乙酰胺，含1%三甲基氯硅烷：Regis公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

石墨鍋：平頂山市信瑞達(dá)石墨制造有限公司；琺瑯鍋、不銹鋼鍋、鑄鐵鍋：市售；AB Triple TOF 5600/6600質(zhì)譜儀：AB SCIEX；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀、8890B-5977B單四極桿氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀、HP-5MS UI毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)：美國Agilent公司；SBL-10DT型超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；低速離心機(jī)：安徽嘉文儀器裝備有限責(zé)任公司；PE Eenspire型酶標(biāo)儀：美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

選取新鮮的羊肚菌子實(shí)體，用清水將子實(shí)體表面污物沖洗干凈，并用剪刀將子實(shí)體剪成2 cm×2 cm塊狀大小，將其放入冰箱中4 ℃冷藏備用。

1.3.2 菌湯制備

本實(shí)驗(yàn)中羊肚菌菌湯制備采用傳統(tǒng)熬制工藝水煮法。參考王英、段麗麗等[7-8]研究食用菌菌湯制備的結(jié)果，高溫和長時(shí)間熬制菌湯會降低其營養(yǎng)物質(zhì)的含量。故采用熬制時(shí)間60 min、水煮熬制溫度95 ℃及料液比140 (g:ml)進(jìn)行羊肚菌菌湯的熬制。取出預(yù)處理好的冷藏鮮菌，分別放入石墨鍋、琺瑯鍋、不銹鋼鍋、鑄鐵鍋中；加入蒸餾水，進(jìn)行熬制，蒸煮冷卻，過濾除去殘?jiān)?，得到濾液。隨后每種濾液分別取30 mL放于4支50 mL離心管中；4種樣液分別編號為1-I、2-I、3-I、4-I，置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 LC-MS分析羊肚菌菌湯代謝組分

樣液預(yù)處理：-20 ℃取出樣液，稱取60 mg，分別加入200 μL水勻漿，渦旋60 s，加入800 μL甲醇乙腈溶液(11)，渦旋60 s；低溫超聲30 min，重復(fù)2次，-20 ℃放置1 h沉淀蛋白，過濾管過濾后14 000 rcf，4 ℃離心20 min，取上清液冷凍干燥，-80 ℃保存樣液。

進(jìn)樣條件：樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC) HILIC色譜柱進(jìn)行分離；柱溫25 ℃；流速0.3 mL/min；流動相組成A：水+25 mM乙酸銨+25 mM氨水，B：乙腈。

梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：分別采用電噴霧電離(ESI)正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。樣品經(jīng)UHPLC分離后用Agilent 6550 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。ESI源條件為：離子源溫度250 ℃，干燥氣體流速16 L/min，離子化電壓3 300 V，質(zhì)量掃描范圍50～1 200，循環(huán)時(shí)間250 ms。

1.3.4 總糖的測定

羊肚菌菌湯中的固體物主要指羊肚菌多糖或其他可溶性物質(zhì)，對其總多糖的含量進(jìn)行測定，可以反映出其固體物的含量[9]，以便對羊肚菌菌湯的成分進(jìn)行深度剖析?？偠嗵呛康臏y定采用苯酚-硫酸法[10-12]，在波長490 nm處測定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度值(y)為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.692 7x+0.006 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 8。按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣液中多糖含量。將冰箱中保存待用的樣液融化，4 500 r/min離心10 min，取上清液1 mL與0.1 mL 5%的苯酚溶液混合均勻，加入0.5 mL的濃硫酸，振搖5 min混勻，然后放置沸水浴中加熱15 min。結(jié)束后放置于冷水中冷卻30 min，在490 nm處測定其吸光度。

1.3.5 總蛋白的測定

總蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[13]，在波長595 nm處測定吸光度值。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度值(y)為縱坐標(biāo)繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.257 4x-0.004 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 2。按照蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣液中總蛋白含量。將冰箱保存待用的樣液融化，4 500 r/min離心10 min，取上清液1 mL于干凈試管中，加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)-G250混勻。取混勻液200 μL加入酶標(biāo)板中，重復(fù)3次，酶標(biāo)儀測595 nm處吸光值。將測得的樣品液吸光值代入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件和 Office Excel 2010，并使用軟件Origin 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS分析羊肚菌菌湯代謝組分的結(jié)果

采用電噴霧電離(ESI)正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，樣本質(zhì)譜峰的保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致，曲線重疊性高，表明質(zhì)譜儀對同一樣品不同時(shí)間檢測時(shí)，信號穩(wěn)定性好，同時(shí)儀器的高穩(wěn)定性為數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性提供了重要保障[14]。4種待測樣液1-I、2-I、3-I和4-I經(jīng)UHPLC分離后用Agilent 6550質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。獲得的色譜圖見圖1，色譜分離后，質(zhì)譜裂解得到每個(gè)色譜峰的質(zhì)譜圖。通過峰面積歸一化法計(jì)算出各化合物的峰面積相對含量，篩選出代表性的化合物成分，結(jié)果見表2和表3。

(a)1-I陽離子色譜圖 (b)2-I陽離子色譜圖

(c)3-I陽離子色譜圖 (d)4-I陽離子色譜圖

(e)1-I陰離子色譜圖 (f)2-I陰離子色譜圖

(g)3-I陰離子色譜圖 (h)4-I陰離子色譜圖圖1 基于4種鍋具烹飪羊肚菌菌湯的LC-MS色譜圖(注：橫坐標(biāo)為代謝物檢測的保留時(shí)間，縱坐標(biāo)為離子檢測的粒子流強(qiáng)度)

表2 羊肚菌樣液陽離子化合物組分及相對含量

續(xù)表2

表3 羊肚菌樣液陰離子化合物組分及相對含量

續(xù)表3

2.2 主成分分析

本研究共檢測出442種化合物及揮發(fā)物成分，分為9個(gè)大類，以核苷酸及其衍生物(nucleotides and derivatives)、氨基酸及其衍生物(amino acids and derivatives)、酚酸類(phenolic acids)、糖及醇類(saccharides and Alcohols)、脂質(zhì)(lipids)、萜類(terpenoids)、黃酮類(flavonoids)、酯類(esters)和其他類(others)為主(見圖2)。選用不同的鍋具，采用傳統(tǒng)工藝熬煮法烹飪羊肚菌菌湯，檢測發(fā)現(xiàn)其化合物高度相似，無明顯的差異性。表明選用不同的鍋具來熬制羊肚菌菌湯，其菌湯的風(fēng)味及營養(yǎng)成分無明顯差異。在陽離子物質(zhì)含量對比中顯示，在相同烹煮條件下，石墨鍋(1-I)中嘌呤化合物含量、糖類化合物含量較少，酯類化合物、酸類化合物、核苷類化合物含量較高。核苷類化合物及酯類化合物是食用菌中的主要增鮮物質(zhì)[15]。在陰離子物質(zhì)含量對比中顯示，酸類代謝物含量最多?？偤可咸穷惢衔锖俊⒋碱惢衔锖孔钌?，酯類化合物、酮類化合物含量相對較高。

(a)陽離子物質(zhì)含量對比 (b)陰離子物質(zhì)含量對比圖2 LC-MS陽、陰離子物質(zhì)含量對比

2.3 4種鍋具烹飪羊肚菌菌湯的組分分析及相對含量

根據(jù)質(zhì)譜峰的保留時(shí)間和相對含量，共篩選出了76種具有代表性的化合物及其代謝產(chǎn)物，其中包括氨基酸及其衍生物10類、核苷酸類3類、酸類物質(zhì)12類、糖及醇類5類、黃酮類13類以及炔烴類化合物33類。氨基酸類包括谷氨酸、天冬氨酸、麥角硫因和其他氨基酸衍生物。谷氨酸和天冬氨酸是具有活性的鮮味物質(zhì)，也是重要的鮮甜味呈味氨基酸，可有效提高菌湯滋味，豐富營養(yǎng)成分。麥角硫因是一種天然抗氧化劑，在人體內(nèi)可以對細(xì)胞起到保護(hù)作用，是機(jī)體內(nèi)的重要活性物質(zhì)，同時(shí)也能起到清除自由基的功效。核苷酸類中包括鳥苷酸和腺苷酸等，鳥苷酸可與谷氨酸鈉或5′-肌苷酸二鈉合用，有顯著的協(xié)同作用，從而進(jìn)一步地增加羊肚菌菌湯的口感。酸類物質(zhì)中包括對氯苯乙酸、5-羥基吲哚-3-乙酸、3-羥基苯丙烯酸、肌酸、5,6,7,8-四羥基-2-萘甲酸2-萘羧酸、蓖麻油酸、3-吲哚丁酸、亞葉酸、3-(3-甲氧基苯基)丙酸以及?；撬岬?。糖及醇類中包括蔗糖、D-水蘇糖、四甘醇、3-甲基-1-苯基-3-戊醇和赤霉醇。黃酮類中包括2-吡咯烷酮、二氫茉莉酮、甲喹酮、2-哌嗪酮、雄烯二酮、2-甲基-3-(2-戊烯基)-2-環(huán)戊烯酮、異丁基苯基酮、金雀異黃酮和3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮等，其中：二氫茉莉酮[16]是一種天然的香料，能增加羊肚菌菌湯的香氣，豐富口感；金雀異黃酮具有抗氧化作用，對多種腫瘤細(xì)胞株有抑制作用。

2.4 總糖和總蛋白的測定結(jié)果分析

選用石墨鍋(1-I)、琺瑯鍋(2-I)、不銹鋼鍋(3-I)和鑄鐵鍋(4-I)4種材質(zhì)不同的鍋具，采用傳統(tǒng)熬制工藝水煮法，控制熬制條件：熬制時(shí)間60 min、水煮熬制溫度95 ℃及料液比140 (g:mL)。探究不同鍋具烹飪羊肚菌菌湯后，菌湯中總糖和蛋白含量的差異，結(jié)果見圖3。在相同條件下烹煮羊肚菌，琺瑯鍋中總糖含量最少，為0.413 μg/mL；石墨鍋次之，鑄鐵鍋中羊肚菌菌湯總糖含量最高，為0.676 μg/mL。在對羊肚菌菌湯總蛋白的測定中，結(jié)果顯示，選擇石墨鍋烹飪羊肚菌菌湯時(shí)，其總蛋白含量最高，為3.500 μg/mL；琺瑯鍋和不銹鋼鍋中的總蛋白含量與石墨鍋中的總蛋白含量無明顯差異；選用鑄鐵鍋烹飪羊肚菌菌湯時(shí)，其總蛋白含量最低，為1.855 μg/mL，遠(yuǎn)小于石墨鍋中的總蛋白含量。

圖3 羊肚菌菌湯總糖和總蛋白的含量

3 結(jié)論與討論

通過HPLC-MS共檢測出442種化合物及揮發(fā)物成分，分為9個(gè)大類，主要以氨基酸及其衍生物和核苷酸類化合物為主。LC-MS陽離子分析發(fā)現(xiàn)石墨鍋中嘌呤類化合物、糖類化合物含量較少，酯類化合物、氨基酸類化合物、核苷類化合物含量較高；陰離子分析發(fā)現(xiàn)酯類含量最多?？偤可咸穷惢衔锖?、醇類化合物含量最少，酯類化合物、酮類化合物含量相對較高。酯類化合物、酸類化合物、氨基酸類化合物、核苷酸類化合物對羊肚菌菌湯的風(fēng)味物質(zhì)有較大貢獻(xiàn)。根據(jù)保留時(shí)間和相對含量篩選了76種化合物及其代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)谷氨酸、麥角硫因、鳥苷酸和二氫茉莉酮等代表性的特征香味物質(zhì)。在總糖和總蛋白的測定中，發(fā)現(xiàn)采用不同鍋具熬制羊肚菌菌湯對其總糖和總蛋白的含量有一定影響，并檢測了石墨鍋的性能。石墨鍋?zhàn)鳛閺N房用具，有一定的優(yōu)勢，能進(jìn)一步應(yīng)用于食材的烹飪。