建蘭組織培養(yǎng)再生體系培養(yǎng)基優(yōu)化

李文建,韓宵林,李芳菲,李蕾蕾,武振江,劉瑞芳,謝朝暉

(河南城建學院 生命科學與工程學院，河南 平頂山 467036)

建蘭的繁殖方式主要有3種，分別為種子繁殖、分株繁殖和組織培養(yǎng)。種子繁殖常敗育，繁殖系數和培養(yǎng)效率均較低。分株繁殖需母株長至一定程度及大量前期芽體培育方可實現，不易實現規(guī)?；a。傳統(tǒng)雜交育種周期長，且成功率較低，不利于實現規(guī)?；a。而組織培養(yǎng)能夠有效應對以上難題，在園藝植物生產中應用越來越廣泛[1-2]。

近年來，關于國蘭組織培養(yǎng)再生快繁的研究報道很多。許申平等[3]以成熟墨蘭種子誘導根狀莖為材料，研究其根狀莖增殖、芽分化及生根等不同階段的誘導情況。付秀芹等[4]以蕙蘭種子、根狀莖及無菌苗為試材，對種子萌發(fā)、根狀莖增殖及其分化等階段的適宜培養(yǎng)基進行研究，并探討了無菌苗的移栽基質，初步優(yōu)化建立了蕙蘭組培的快繁體系。孫玉芬等[5]以春蘭與大花蕙蘭雜交后代根狀莖為材料進行培養(yǎng)，篩選適合根狀莖增殖與分化的條件，研究比較不同基本培養(yǎng)基、植物生長調節(jié)物質和有機添加物等對根狀莖增殖與分化的影響。李玉萍等[6]以春蘭與大花蕙蘭雜交種原球莖和無根幼苗為材料，研究激素對原球莖分化的影響以及激素與香蕉泥對誘導生根狀況的影響。

而關于建蘭組織培養(yǎng)再生快繁的研究報道較少。賈勇炯等[7]以建蘭腋芽為外植體，用B5和MS為基本培養(yǎng)基，優(yōu)化激素條件，成功地誘導了簇生原球莖、假根莖及其分化的營養(yǎng)芽和花芽；通過連續(xù)光照，花芽可在試管內開花；并探討了椰乳對原球莖誘導的正向作用以及活性炭對防止褐化、促進根系生長等方面的影響。賈勇炯等[8]以彩心建蘭花芽為材料，選取幼嫩花枝上部莖節(jié)切段，用MS為基本培養(yǎng)基，通過器官發(fā)生直接分化出了花芽和營養(yǎng)芽。葉秀仙等[9]以素心建蘭種子為外植體，研究不同的培養(yǎng)基(1/2MS、花寶1號、改良MS)和激素(6-BA、TDZ、NAA)等關鍵因子對種子萌發(fā)、根狀莖增殖、分化等階段的影響，研探了素心建蘭無菌播種快繁關鍵技術。李承秀等[10]用正交試驗研究基本培養(yǎng)基、激素用量以及不同附加物對瓶苗誘導根分化生長的影響，通過無菌播種培養(yǎng)獲得了原球莖，優(yōu)化生根培養(yǎng)基，并以水苔為基質完成了煉苗試驗。

本文從基本培養(yǎng)基和植物激素組合處理等方面，查閱相關研究文獻，開展建蘭再生體系培養(yǎng)基激素條件優(yōu)化，篩選建蘭不同培養(yǎng)階段所需的最佳培養(yǎng)基配方，為建蘭組織培養(yǎng)快繁技術應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

建蘭植株品種為“龍福星蝶”，取材時正值盛花期，研究所需花芽、莖尖組織較為充足。本研究所用建蘭植株均源于同一植株及其芽分化子代，減少生理活性差異引起的組織脫分化與再分化速率不同步效應。

基本培養(yǎng)基組成：MS培養(yǎng)基+蔗糖(30 g/L)+瓊脂粉(6 g/L)。

1.2 外植體獲取、預處理及消毒

本研究用建蘭花莖和莖尖作為試驗材料。

(1)花莖：取建蘭幼嫩花莖，長度約為3～7 cm，用自來水沖洗，通過無菌操作剝去外層苞葉，將所取花莖切成多個小段，長度約1～3 cm，每個切段帶一莖節(jié)。

(2)莖尖：取葉片未展開的健壯新芽，自來水下沖洗，通過無菌操作剝去外層葉片，切除莖尖基部傷口褐變部分，切取頂端新芽，長度約2～5 mm。

(3)材料消毒：以上2種材料經預處理，再依照設計用量放入無菌小燒杯，在超凈工作臺上進行如下操作：75 %酒精浸泡15 s，再用0.05%的升汞消毒7 min，最后用無菌水沖洗4～5次。

1.3 接種培養(yǎng)

(1)原球莖誘導：用2種材料進行起始培養(yǎng)，每處理外植體接種個數120個，每瓶接種6個，共接種20瓶，分別于30 d、40 d及50 d觀察其誘導分化情況。

(2)不定芽誘導：上步獲得的培養(yǎng)材料，每處理接種個數為12個，每瓶接種4個，共接種3瓶，分別于20 d、30 d及40 d觀察其不定芽誘導情況。

(3)生根誘導：每處理接種12個，每瓶接種4個，共接種3瓶，分別于10 d、15 d及20 d觀察其生根誘導情況。

1.4 不同培養(yǎng)基對建蘭不同再生階段誘導效果的影響

針對建蘭組織培養(yǎng)不同再生階段，并結合不同培養(yǎng)階段處理數，進行培養(yǎng)基及激素條件的配比組合設計[1,2,7-10](表1)。

表1 建蘭再生不同培養(yǎng)階段不同激素濃度培養(yǎng)基組成

1.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件主要是溫度和光照控制。其中溫度：白天(25±2) ℃，夜間(20±2) ℃；而光照條件為14 h/d。

2 結果與分析

2.1 原球莖誘導

分別將建蘭莖尖和花莖(帶節(jié))外植體材料接種于1～6號培養(yǎng)基，篩選原球莖最佳誘導培養(yǎng)基，試驗結果見表2。

表2 建蘭原球莖誘導

從表2可知，在6種培養(yǎng)基中，莖尖組織原球莖誘導率從高到低依次為1號、2號、3號、5號、4號、6號，而花莖組織誘導率從高到低依次為2號、1號、5號、3號、4號、6號。故1、2號培養(yǎng)基誘導2種組織的原球莖更為適宜，其中1號培養(yǎng)基來培養(yǎng)建蘭莖尖組織獲得了最高誘導率(85%)，即1號培養(yǎng)基可作為建蘭原球莖最佳誘導培養(yǎng)基。

在6種培養(yǎng)基中，莖尖組織原球莖誘導率平均為61%，而花莖組織誘導率平均為51%，故建蘭莖尖比花莖更適合作為原球莖誘導的試驗材料。

2.2 不定芽誘導

用1號培養(yǎng)基莖尖組織誘導獲得的原球莖材料，開展不定芽誘導試驗，篩選不定芽最佳誘導培養(yǎng)基，試驗結果見表3。

表3 建蘭不定芽誘導

由表3可知：隨著培養(yǎng)時間的延長，4種培養(yǎng)基均能誘導出較多的莖芽，并展現出較好的生長誘導效果；40 d時，9號培養(yǎng)基增殖倍數(3.67)最低，不定芽誘導效率較低，而8號培養(yǎng)基增殖倍數為4.67，獲得了最高的不定芽誘導效率；故8號培養(yǎng)基可作為建蘭不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基。

2.3 生根誘導

用8號培養(yǎng)基獲得的建蘭不定芽，進行建蘭生根培養(yǎng)，篩選適宜的生根培養(yǎng)基，試驗結果見表4。

表4 建蘭生根誘導

由表4可知：4種培養(yǎng)基生根誘導率均高于90%，表明4種培養(yǎng)基均具有很好的出根誘導效率，其中11～13號3種培養(yǎng)基出根率均達到100%；在11～14號培養(yǎng)基中，12號培養(yǎng)基于第15 d即達100%誘導率，可作為最適宜用于建蘭生根誘導的培養(yǎng)基。

3 結論與討論

3.1 結論

(1)與花莖組織材料相比，建蘭莖尖組織更適宜作為原球莖誘導的試驗材料；

(2)針對不同培養(yǎng)階段培養(yǎng)物誘導效果方面，原球莖誘導最佳培養(yǎng)基是1號培養(yǎng)基，不定芽誘導最佳培養(yǎng)基為8號培養(yǎng)基，而生根誘導最佳培養(yǎng)基為12號培養(yǎng)基。

本研究結果發(fā)現，相比于建蘭花莖，莖尖更具發(fā)育活性，在提供的不同培養(yǎng)基上，原球莖誘導率及增殖效率均有相應提高[7-8]。不同激素種類及濃度的培養(yǎng)基對組織培養(yǎng)再生有重要的影響，適宜的激素種類組合及濃度比例能夠有效地促進原球莖、不定芽與根的分化發(fā)育[9-11]。

3.2 討論

建蘭組培相關文獻鮮有報道，精摘幾篇結合本研究結果展開討論。

劉翠華等[12]以建蘭小桃紅品種根狀莖為外植體，研究激素對根狀莖增殖、分化和生根的影響，結果表明：根狀莖增殖最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.5 mg/L，根狀莖分化最佳培養(yǎng)基MS+NAA 0.6 mg/L+TDA 1.0 mg/L，分化率為93.1%；生根最佳培養(yǎng)基1/2MS+NAA 1.0 mg/L+AC 0.05%。其根狀莖分化率與本研究原球莖分化率均較高，顯示兩者雖然來源于不同品種及不同器官部位的外植體材料，均有很好的再分化能力，再生較為容易。其生根率為96.3%，表明生根容易，與本研究結果一致。

葉秀仙等[9]關于建蘭無菌苗的快繁技術研究，王濟紅等[13]關于建蘭新品種黃金小神童組培育苗的集成技術優(yōu)化研究，均突顯了TDZ激素在根狀莖增殖等階段的重要作用。而本研究結果顯示，建蘭組培再生過程各階段的優(yōu)化培養(yǎng)基可不必添加TDZ激素，僅使用6-BA和NAA 2個激素組合并優(yōu)化其配比濃度即可達到較好的誘導效果。

李麗等[14]以線藝建蘭莖尖、腋芽為外植體，研究得出原球莖誘導最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3 mg/L，并長成根狀莖。根狀莖分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+PP333 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L，分化率達46.3%。生根培養(yǎng)基為MS+IBA 1.0mg/L+GA 0.5mg/L+香蕉泥100 g/L，生根率達100%。其以上幾個階段優(yōu)選培養(yǎng)基激素濃度與本研究結果較為接近，其中再分化效果不如本研究結果，而生根效果與本研究十分吻合。本研究未涉及植物生長調節(jié)劑PP333與GA的使用，也未設計添加香蕉泥、椰汁等天然的有機營養(yǎng)物質，各階段培養(yǎng)物誘導與生長狀態(tài)均較為良好，可作為以后進一步深化探索研究的參考內容。