一種提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的大豆胞囊線蟲抗性鑒定方法

練云， 周揚(yáng),2， 雷晨芳， 武永康， 李海朝， 王仕偉， 王金社， 盧為國(guó)*

(1.河南省作物分子育種研究院國(guó)家大豆改良中心鄭州分中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海油料作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河南省油料作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 2.漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 漯河 462000)

大豆是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，我國(guó)大豆需求量近年急劇增加。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)大豆胞囊線蟲病(soybean cyst nematode，SCN)、癥青、根腐病等病害對(duì)大豆造成嚴(yán)重減產(chǎn)、甚至絕產(chǎn)[1-3]，因此，培育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)大豆品種迫在眉睫。大豆胞囊線蟲病是一種世界性大豆病害，世界范圍內(nèi)各個(gè)大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，伴隨近年來(lái)關(guān)于大豆產(chǎn)區(qū)SCN優(yōu)勢(shì)生理小種致病性的升級(jí)[4-6]，具有超強(qiáng)致病力的大豆胞囊線蟲新小種被發(fā)現(xiàn)的報(bào)道[7]越來(lái)越多，應(yīng)對(duì)SCN病害措施的相關(guān)研究有待加強(qiáng)。SCN相關(guān)研究中的抗性資源鑒定、抗病品種培育、生理小種鑒定為提出應(yīng)對(duì)SCN策略提供技術(shù)支撐[1,8-10]，而以上研究均是以胞囊指數(shù)為判定依據(jù)，因此，準(zhǔn)確、可靠的抗性鑒定方法尤其重要。盡管SCN抗性鑒定相關(guān)研究工作多是在溫室內(nèi)開展，但在實(shí)際操作過(guò)程中，由于胞囊受溫度、濕度影響較大，不同重復(fù)間胞囊數(shù)目差異大仍是十分普遍的現(xiàn)象。基于通過(guò)控制小環(huán)境提高大豆胞囊線蟲侵染效率的抗性鑒定對(duì)SCN研究工作具有重要意義。

已有研究表明，大豆胞囊線蟲優(yōu)勢(shì)生理小種出現(xiàn)了致病能力升級(jí)的現(xiàn)象，比如在2016年報(bào)道的中國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)—黃淮地區(qū)和美國(guó)密蘇里大豆產(chǎn)區(qū)，優(yōu)勢(shì)生理小種均由1號(hào)生理小種(1號(hào)生理小種僅能侵染Riggs鑒定模式中的PI 88788)升級(jí)到了2號(hào)生理小種(2號(hào)生理小種能侵染Riggs鑒定模式中的Peking、Pickett和PI88788 3個(gè)寄主)[11]；在中國(guó)，前期還發(fā)現(xiàn)了具有超強(qiáng)致病力的新小種X12(X12小種能夠侵染目前常用的所有抗病資源)[7,12]，且大豆胞囊線蟲仍在擴(kuò)散[13]。因此，亟需一套穩(wěn)定的SCN抗性資源鑒定方法，篩選新抗源并將篩選到的抗源有效用于生產(chǎn)實(shí)踐。近年來(lái)，在SCN表型鑒定方面，取得了一定的研究進(jìn)展，尤其是在計(jì)數(shù)大豆胞囊的方法方面。2005年報(bào)道了一種基于熒光成像系統(tǒng)的胞囊計(jì)數(shù)方法[14]，可將胞囊拍成照片，輸入電腦后在電腦上人工計(jì)數(shù)，此方法不需要在胞囊成熟一周內(nèi)就完成對(duì)胞囊的計(jì)數(shù)，把人們從統(tǒng)計(jì)胞囊的時(shí)間限制中解脫了出來(lái)，但是不適于高通量計(jì)數(shù)；2010年報(bào)道了一種適于高通量計(jì)數(shù)胞囊的計(jì)數(shù)方法[15]，利用一種組裝、改造的熒光成像系統(tǒng)并配合計(jì)數(shù)軟件，實(shí)現(xiàn)了一次拍攝6棵植株上的胞囊并自動(dòng)計(jì)數(shù)的高通量統(tǒng)計(jì)方法，但該機(jī)器功能單一，部分配件需特殊定制，有些配件目前市場(chǎng)上難以采購(gòu)且市場(chǎng)需求量小，至今在SCN研究領(lǐng)域未得到推廣應(yīng)用；2014年，報(bào)道了植物病蟲害表型數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)[16]，此方法不需要熒光環(huán)境，直接把從根系上沖洗下來(lái)的胞囊均勻分散在黑色背景布上，利用計(jì)數(shù)軟件對(duì)普通相機(jī)拍攝的胞囊圖像計(jì)數(shù)，但是根系、沙子、蛭石、胞囊黏連等情況會(huì)影響計(jì)數(shù)結(jié)果；2018年報(bào)道了褐化大豆胞囊自動(dòng)計(jì)數(shù)方法[17]，該方法適于統(tǒng)計(jì)褐化胞囊數(shù)目，但是在抗性鑒定及資源篩選中，多是統(tǒng)計(jì)褐化前處于顯囊盛期的胞囊數(shù)目。以上技術(shù)更新，均提升了胞囊數(shù)目統(tǒng)計(jì)的準(zhǔn)確性及效率，已經(jīng)不同程度地被應(yīng)用到了大豆胞囊抗性鑒定過(guò)程中。

rhg1和Rhg4是抗SCN的2個(gè)主效位點(diǎn)[18-20]，借助與rhg1和Rhg4緊密連鎖的KASP標(biāo)記[21-22]，在現(xiàn)有大豆資源中篩選到了含有SCN抗性位點(diǎn)且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的資源[8]。開發(fā)的KASP標(biāo)記不僅能從資源中篩選出來(lái)自rhg1、Rhg4位點(diǎn)的SCN抗性基因型信息，而且能夠從絕大部分抗性資源中區(qū)分Peking類型和PI88788類型，這些標(biāo)記用于高通量分子標(biāo)記輔助育種[1,8,21-22]。篩選SCN抗性種質(zhì)資源主要依靠在溫室內(nèi)開展表型鑒定，其中最重要的表型依據(jù)就是接種一定濃度蟲卵后，統(tǒng)計(jì)根系上的胞囊數(shù)目，并對(duì)待鑒定材料抗性水平進(jìn)行劃分。寄生在根系中的線蟲容易受到溫度、濕度的影響，接種操作不規(guī)范、接種濃度不一致以及接種時(shí)蟲卵活性的干擾等因素都會(huì)導(dǎo)致抗性鑒定需要多次重復(fù)。由于諸多因素的干擾，在溫室內(nèi)開展的表型抗性鑒定，勞動(dòng)強(qiáng)度大、運(yùn)行成本高，導(dǎo)致抗性資源篩選效率仍然比較低。目前已有的改進(jìn)措施多是基于提高統(tǒng)計(jì)胞囊數(shù)目的準(zhǔn)確性，目前尚未見(jiàn)到在抗性鑒定過(guò)程中提高大豆胞囊線蟲侵染效率、提升有效重復(fù)的表型鑒定技術(shù)。

開展SCN相關(guān)工作的研究在大環(huán)境上多利用培養(yǎng)室進(jìn)行控溫、控濕，但在實(shí)際操作中，由于散熱性差、線蟲侵染效率不一致等小環(huán)境的影響，往往重復(fù)性差。針對(duì)溫室內(nèi)由小環(huán)境引起的溫度、濕度、侵染效率不一致等引起的誤差，我們研究一種通過(guò)調(diào)控小環(huán)境和提高大豆胞囊線蟲侵染效率的抗性鑒定方法，提高接種植株間的有效重復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)條件

感病材料Lee和具有不同抗性水平的大豆材料來(lái)自河南省作物分子育種研究院種質(zhì)資源保存室。溫室培養(yǎng)條件為光照16 h/8 h(白天/黑夜)，溫度(27±1) ℃/(24±1) ℃(白天/黑夜)，濕度(70±5)%。

1.2 胞囊的繁殖

胞囊的繁殖參考練云等[5]實(shí)驗(yàn)方法，將受大豆胞囊線蟲感染的病土分裝到一次性塑料杯中，移栽子葉出土期(萌發(fā)3～5 d)的Lee幼苗至病土中，每杯1株。溫室培養(yǎng)，適時(shí)澆水管理。

1.3 控溫改善

降低筐高：將規(guī)格為638 mm×420 mm×139 mm(內(nèi)部尺寸長(zhǎng)×寬×高)的筐改用為530 mm×341 mm×70 mm(內(nèi)部尺寸長(zhǎng)×寬×高)。加濕：在筐底部墊4 cm高的底濾網(wǎng)，并于光照時(shí)間在底濾網(wǎng)里注入0.3～0.5 cm深的水，用于光照時(shí)通過(guò)蒸發(fā)達(dá)到局部降溫，而在黑夜溫度較低時(shí)盡量使筐底部干燥，同時(shí)防止根系伸長(zhǎng)至筐底的水中。

1.4 純化胞囊

將在病土中生長(zhǎng)約25 d的Lee從病土中倒出，采用淘洗、過(guò)篩法依次用25目、60目、100目篩網(wǎng)從根系上分離胞囊，并搜集胞囊至100目篩網(wǎng)上。純化步驟如下：依次用100目、200目、500目篩網(wǎng)，用橡皮塞破碎胞囊，搜集蟲卵至500目篩網(wǎng)上，借助洗瓶和漏斗，將蟲卵轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，體積控制在20 mL以內(nèi)；加等體積的40%蔗糖溶液，輕輕顛倒混勻；2 000 r·min-1離心5 min，如看到分層，則吸取中間層，棄掉上清和底部沉淀；若看不到分層，則吸取上清，棄掉底部沉淀，并將吸取的上清液在600目篩網(wǎng)上過(guò)濾，用流水沖洗以去除蔗糖，蟲卵留在600目篩網(wǎng)上；借助洗瓶和漏斗，將蟲卵轉(zhuǎn)移至燒杯中，稀釋到一定體積，混勻后取10 μL在顯微鏡下計(jì)數(shù)，即為接種液。

1.5 接種孔的孔徑改善

緊挨著待鑒定材料根系旁邊扎孔，用于注入接種液，原方法使用1 mL槍頭扎孔，本研究改用3 mm×75 mm螺絲刀或3 mm直徑的竹簽扎孔，孔的直徑是原來(lái)的1/3～1/6，接種分兩次進(jìn)行，每次每株接種約1 250個(gè)蟲卵，每株兩次共接種2 500個(gè)蟲卵，兩次接種間隔24 h。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

在條件改善前后，各待鑒定植株上胞囊數(shù)目取平均值，利用方差分析不同重復(fù)間的數(shù)值，統(tǒng)計(jì)數(shù)值變化區(qū)間，比較條件改善前后重復(fù)實(shí)驗(yàn)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 控溫改善

傳統(tǒng)方法中的筐內(nèi)溫度31.9 ℃、濕度49%(圖1)，培養(yǎng)架表面溫度41.3 ℃、濕度28%，改進(jìn)后方法(降低了筐的高度，鋪設(shè)底濾網(wǎng)且加水)的筐內(nèi)溫度27.6 ℃、濕度68%(表1)。胞囊最佳生長(zhǎng)條件為白天(27±1)℃，夜晚(24±1)℃，濕度70%±5%，改進(jìn)后的條件更接近胞囊的最佳生長(zhǎng)條件。

A—傳統(tǒng)方法的筐內(nèi)溫、濕度；B—培養(yǎng)架表面溫、濕度；C—改進(jìn)后方法的筐內(nèi)溫、濕度。

表1 在不同時(shí)間點(diǎn)的溫、濕度比較

2.2 蔗糖梯度離心純化接種蟲卵

未經(jīng)蔗糖梯度離心的蟲卵溶液中有破碎的根系、沙子、土壤等雜質(zhì)(圖2)，影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，經(jīng)過(guò)純化后的蟲卵，在4倍顯微鏡下雜質(zhì)明顯減少，計(jì)數(shù)相對(duì)準(zhǔn)確，接種到每一個(gè)待鑒定材料里的蟲卵數(shù)目一致性更高。

A—未經(jīng)蔗糖梯度離心的蟲卵；B—經(jīng)過(guò)蔗糖梯度離心的蟲卵。

2.3 接種孔徑改善

傳統(tǒng)方法中，使用1 mL的槍頭扎孔，3 000個(gè)蟲卵注入一個(gè)孔內(nèi)，因槍頭上部直徑較大，扎入土內(nèi)導(dǎo)致杯內(nèi)土壤產(chǎn)生裂紋，接種液易擴(kuò)散到遠(yuǎn)離根系的地方，導(dǎo)致孵化后的幼蟲不能及時(shí)接觸到寄主；改善后，注入接種液的孔直徑是原來(lái)的1/3～1/6，由于扎孔的孔徑小，不易在扎孔時(shí)產(chǎn)生裂紋，而且接種液分兩次注入，每次注入一個(gè)孔內(nèi)(圖3)。條件改善后有效縮小了蟲卵與根系的接觸空間，孵化后的幼蟲更容易接觸到寄主。

A—用直徑為5 mm的竹簽扎孔；B—用直徑為3 mm的螺絲刀扎孔；C—用1 mL移液器槍頭扎孔。

傳統(tǒng)方法中，每株一次接種3 000個(gè)蟲卵，條件改善后，每株一次接種1 500個(gè)蟲卵，接種兩次。采用分兩次接種可以減少因蟲卵活性差異或人為漏接種引起的誤差。改用螺絲刀/竹簽扎孔后，由于孔徑小，不容易注入1 mL接種物，借用1 mL槍頭輔助接種。

2.4 分離胞囊并計(jì)數(shù)

培養(yǎng)25 d后，將大豆植株從病土中倒出，采用淘洗、過(guò)篩法從根系中分離胞囊，利用計(jì)數(shù)軟件及體式顯微鏡，通過(guò)計(jì)算機(jī)掃描、分析，自動(dòng)計(jì)數(shù)每張照片上的大豆胞囊數(shù)目，計(jì)數(shù)軟件具體使用方法見(jiàn)專利2018SR477328[16]。

通過(guò)以上在溫濕度、純化接種蟲卵、接種方式等方面的改善，使得每個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的胞囊數(shù)目差異較小，標(biāo)準(zhǔn)差減小(表2)。從條件優(yōu)化前后接種的大豆材料Lee來(lái)看，條件優(yōu)化后，標(biāo)準(zhǔn)差由133.9減小到25.1，數(shù)值變化范圍由35～347優(yōu)化為102～166。條件優(yōu)化后，不同重復(fù)間標(biāo)準(zhǔn)差和數(shù)值變化范圍均有較明顯變化(表1)。

表2 大豆胞囊線蟲抗性鑒定結(jié)果比較

從表2可以看出，采用改善條件后的方法使得每個(gè)重復(fù)胞囊數(shù)目一致性較好，標(biāo)準(zhǔn)差減小。其次，在鑒定過(guò)程中，利用傳統(tǒng)的鑒定方法，會(huì)遇到初次鑒定為中感或中抗的品種，但在重復(fù)鑒定后分別是感病或中感的現(xiàn)象。使用傳統(tǒng)方法對(duì)鑒定為中抗、中感的品種需要進(jìn)行2～4次重復(fù)，對(duì)于鑒定為免疫和抗病的材料，需要進(jìn)行4次或更多次重復(fù)才能下結(jié)論。采用改進(jìn)后的方法，鑒定結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)鑒定為中感的材料一般不再重復(fù)，對(duì)鑒定為免疫、抗病、中抗的材料，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求重復(fù)1～2次即可下結(jié)論。

依據(jù)傳統(tǒng)方法操作的抗性鑒定，由于參試材料重復(fù)間數(shù)值差異大，常常需要多次重復(fù)才能確定抗性。推測(cè)重復(fù)間數(shù)值差異大的可能原因是同一個(gè)品種間接種濃度不一致、溫度差異大。因此，為保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，每一個(gè)品種的鑒定都會(huì)重復(fù)3次以上，尤其是對(duì)于抗性材料，需在不同時(shí)間多次重復(fù)，才能下結(jié)論。這也是大豆胞囊線蟲抗性鑒定工作進(jìn)展緩慢的原因之一，而經(jīng)過(guò)對(duì)控溫、純化胞囊、接種方式、接種孔隙等關(guān)鍵步驟的優(yōu)化，有效提高了抗性鑒定接種效率，使得重復(fù)間數(shù)值差異明顯降低。這一技術(shù)的改進(jìn)對(duì)推進(jìn)大豆胞囊線蟲相關(guān)研究，包括抗性資源篩選、大豆胞囊線蟲生理小種鑒定、大豆胞囊線蟲抗病基因挖掘、大豆胞囊線蟲抗病品種培育及大豆-大豆胞囊線蟲互作研究有極大的促進(jìn)作用。

3 小結(jié)與討論

隨著科技進(jìn)步和科研條件改善，較多單位能夠在培養(yǎng)室有效控制溫度和濕度，開展SCN相關(guān)研究[9,23-26]。但多年抗性鑒定結(jié)果表明，由于SCN易受溫度、濕度的影響，同一批次重復(fù)間的胞囊數(shù)目差異較大，導(dǎo)致SCN表型鑒定需要多次重復(fù)。Zhou等[27-28]在溫室內(nèi)循環(huán)水浴條件下培養(yǎng)大豆胞囊線蟲，能夠較好地控制溫度，并開展大豆胞囊QTL定位研究。目前，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)用循環(huán)水浴培養(yǎng)大豆胞囊線蟲的報(bào)道，多是在溫室培養(yǎng)架上進(jìn)行培養(yǎng)，還有一些抗性鑒定是利用自然溫度在田間病圃開展，溫度、濕度較難控制。

本研究降低筐的高度，有助于散熱，保證杯子間溫度一致；墊底濾網(wǎng)并在筐底部加少量的水，有助于散熱，溫度可控制在光照時(shí)間(27±1)℃、夜晚時(shí)間(24±1)℃，且能夠有效避免根系通過(guò)杯子底部的孔伸長(zhǎng)到水里，并保證濕度在70%±5%?？鸬某叽绺纳魄?，每個(gè)筐內(nèi)可放6×9個(gè)杯子，每個(gè)種質(zhì)材料重復(fù)3～6次；筐的尺寸改善后，每個(gè)筐內(nèi)可放4×8個(gè)杯子，每個(gè)種質(zhì)材料重復(fù)4次，使得設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)間的重復(fù)更加方便。

據(jù)了解，國(guó)內(nèi)目前在SCN抗性鑒定中，室內(nèi)接種條件多不經(jīng)過(guò)純化，將胞囊收集，用研缽輕輕研磨把胞囊破碎后，將釋放出來(lái)的卵沖洗入燒杯內(nèi)，用清水將蟲卵懸浮，取10 μL在顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵密度后，直接用于接種。在直接用于接種的條件下，由于蟲卵溶液里含有砂土、蛭石、根系等殘留物，接種物比較臟，計(jì)數(shù)欠準(zhǔn)確。經(jīng)過(guò)純化程序的蟲卵，由于經(jīng)過(guò)利用蔗糖梯度離心之后，去除了顯微鏡下可視的殘留物，蟲卵比較干凈，計(jì)數(shù)相對(duì)準(zhǔn)確。另外，孔徑減小后，有效縮小了蟲卵與根系的接觸空間，孵化后的幼蟲更容易找到寄主；而且有效減小了扎孔時(shí)根系周圍出現(xiàn)裂紋的現(xiàn)象，更容易讓接種的蟲卵聚集在根系周圍，采用兩次接種可以有效避免因蟲卵活性不好或一次鑒定量大時(shí)人為漏接種導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。本研究結(jié)果可以為開展SCN相關(guān)研究提供參考依據(jù)。