安徽省稻瘟病菌生理小種鑒定分析

周坤能，夏加發(fā)，王元壘，云 鵬，張彩娟，馬廷臣，張愛芳，李澤福*

（1安徽省農業(yè)科學院水稻研究所/安徽省水稻遺傳育種重點實驗室，安徽 合肥 230001；2安徽省農業(yè)科學院植物保護與農產品質量安全研究所，安徽 合肥 230001）

0 引言

【研究意義】稻瘟病是水稻主要病害之一，每年均有大面積發(fā)生，嚴重威脅水稻生產（王才林等，2008；阮宏椿等，2017）。選育抗病品種是防治稻瘟病最經濟有效的措施，抗病基因和材料是稻瘟病抗性育種的前提和基礎（張禮霞等，2017；張柱堅等，2018；徐志健等，2020）。然而，稻瘟病屬真菌性病害，生理小種易發(fā)生變異，且不同區(qū)域的稻瘟病菌結構差異顯著，導致品種間的抗性差異較大（曹妮等，2019）。因此，明確稻瘟病菌生理小種類型對抗病基因挖掘和品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】利用7個水稻鑒別品種對江蘇省2001—2010年的稻瘟病菌進行分析研究得出江蘇省稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZG和ZB群（劉永鋒等，2010）；相同的方法研究表明廣西稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZB群，優(yōu)勢生理小種為ZB9和ZB13（陳小林等，2017）。湖北省稻瘟病重發(fā)區(qū)優(yōu)勢種群為ZA、ZC和ZB群，優(yōu)勢生理小種為ZA1和ZB1；但湖北隨州地區(qū)稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZB群，優(yōu)勢生理小種為ZB15（楊小林等，2016；吳堯等，2021）。黑龍江省稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZA和ZD群，優(yōu)勢小種為ZA49、ZD1和ZA1（高紅秀等，2017）。廣東省稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZB和ZC群，優(yōu)勢生理小種為ZB13、ZB15和ZC15（鐘寶玉等，2018）。福建省稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZA群，ZB、ZC和ZD群亦存在較高的分布頻率（鄧云等，2020；2021）。山東省稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZA和ZC群，其次為ZB和ZE群，優(yōu)勢生理小種為ZE3和ZG1（房文文等，2020）。遼寧省稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZA和ZB群，優(yōu)勢生理小種為ZA1和ZB1（劉偉等，2020）。湖南省桃江病圃稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZB群，優(yōu)勢生理小種為ZB15和ZB1（李杰等，2021）。水稻抗稻瘟病品種在種植幾年后出現(xiàn)抗性減弱或喪失現(xiàn)象，可能與稻瘟病菌生理小種的變異有關（肖丹鳳等，2013）。因此，明確不同地區(qū)稻瘟病菌生理小種結構和致病力，解析抗性基因與生理小種之間的關系，有助于不同稻瘟病抗性基因的功能研究并應用于育種利用（Rathour et al.，2016；Deng et al.，2017；潘存紅等，2021；Liu et al.，2021）。沈樂融等（2019）利用江蘇省稻瘟病菌生理小種與10個稻瘟病抗性基因進行致病力分析，發(fā)現(xiàn)供試菌株對Pizt、Piz、Pita、Pita2和Pii表現(xiàn)為弱毒力；黑龍江省稻瘟病致病性分化研究表明，含有Pi9和Piz5的單基因系抗性較好（馬軍韜等，2020）。安徽省稻瘟病菌生理小種分離鑒定研究工作相對緩慢，陳莉等（2007）對2002年安徽省稻區(qū)稻瘟病菌進行生理小種鑒定，結果顯示ZA～ZH群小種在安徽均有分布，優(yōu)勢種群為ZB群，優(yōu)勢生理小種為ZB13和ZB15。【本研究切入點】安徽省地理位置復雜，地勢由平原、丘陵、山地構成，早晚稻、秈粳糯等類型品種均有種植，依據耕作制度、耕作方式和生產條件等將安徽省水稻種植區(qū)劃分為5個稻作區(qū)，包括沿淮淮北單季稻作區(qū)，江淮丘陵單、雙季稻過渡區(qū)，沿江雙、單季稻作區(qū)，大別山地單、雙季稻作區(qū)和皖南山地單、雙季稻作區(qū)（萬建民等，2018），各稻作區(qū)的稻瘟病菌生理小種結構差異較大，且各稻作區(qū)的稻瘟病菌優(yōu)勢種群和生理小種尚不明確。【擬解決的關鍵問題】利用7個水稻鑒別品種，采用苗期人工噴霧接種法對2019—2020年收集的安徽省不同稻作區(qū)稻瘟病菌進行鑒定，分析安徽省稻瘟病菌優(yōu)勢種群和生理小種類型以及不同稻作區(qū)稻瘟病菌結構分布，并分析優(yōu)勢生理小種的致病力，篩選抗稻瘟病優(yōu)異種質資源，為稻瘟病抗性基因挖掘、品種選育和推廣布局提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病穗樣本采集及試驗鑒別品種

2019—2020年，收集安徽省5個稻作區(qū)21個市（縣、區(qū)）主栽秈稻和粳稻品種的穗頸瘟病穗樣本，并記錄品種名稱、采集地等信息，4 ℃保存?zhèn)溆谩?個水稻稻瘟病菌鑒別品種分別為特特普、珍龍13、四豐43、東農363、關東51、合江18和麗江新團黑谷。

1.2 稻瘟病菌分離和培養(yǎng)

對采集的稻瘟病病穗利用ddH2O輕微沖洗，放置于含有濕潤濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)24～48 h，顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，待長出足夠孢子后，將孢子依次振落到2～3個馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，挑選單菌落于滅菌大麥中培養(yǎng)8～10 d，待菌絲長出后，用ddH2O洗脫菌落（周坤能等，2022）。

1.3 人工接種鑒定

制備濃度為1×105個/mL的稻瘟病菌菌液，對生長至3葉期的7個水稻鑒別品種進行噴霧接種鑒定，遮光保濕24 h后，每1 h噴水2 min保濕，3次重復。7～10 d后按照NY/T 2646—2014《水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術規(guī)程》記錄稻瘟病發(fā)病情況。

1.4 調查與分析

根據稻瘟病菌生理小種對鑒別品種的抗感反應分別記錄為抗?。≧）和感?。⊿）。小種分類時先分群，根據小種對特特普、珍龍13、四豐43、東農363、關東51、合江18和麗江新團黑谷的感病情況，分為ZA～ZG群，如對特特普感病的屬于ZA群，對特特普抗病、對珍龍13感病的屬于ZB群，以此類推，對7個鑒別品種均抗病的則列為ZH群。將7個鑒別品種按照特特普、珍龍13、四豐43、東農363、關東51、合江18 和麗江新團黑谷的順序分別給以64、32、16、8、4、2、1的固定號碼，小種編號時取分群品種后面各鑒別品種中顯示抗病反應的號碼相加，再加1即為該小種編號（全國稻瘟病菌生理小種研究協(xié)作組，1980）。

1.5 生理小種致病力測定

將775份水稻資源進行浸種催芽，播于秧盤，3次重復，待幼苗生長至3葉期采用1.3中描述的方法分生理小種進行接種鑒定，記錄苗瘟發(fā)病等級，3次重復以發(fā)病最重進行統(tǒng)計。高抗為0級，抗病為1級和2級，中抗為3級，感病為4級以上。根據以下公式計算致病力（鄧云，2021）。

1.6 統(tǒng)計分析

利用Excel 2010分別對來源于不同市（縣、區(qū)）的稻瘟病菌生理小種進行分析，統(tǒng)計安徽省各稻作區(qū)稻瘟病菌生理小種類型，分析安徽省稻瘟病菌優(yōu)勢種群和優(yōu)勢生理小種以及各稻作區(qū)優(yōu)勢生理小種類型。

2 結果與分析

2.1 安徽省稻瘟病菌樣本來源

2019—2020年對安徽省5個稻作區(qū)21個市（縣、區(qū)）的水稻稻瘟病樣本進行收集和小種分離，對其中367個稻瘟病菌小種進行鑒定分類。主要包括沿淮淮北單季稻作區(qū)的鳳臺縣、懷遠縣和謝家集區(qū)，病穗品種為中秈和中粳，鑒定的稻瘟病菌單孢菌株73株；江淮丘陵單、雙季稻過渡區(qū)為全椒縣、壽縣和肥西縣，病穗品種為中秈和中粳，稻瘟病菌單孢菌株33株；沿江雙、單季稻作區(qū)為青陽縣、無為市、宣州區(qū)、當涂縣、貴池區(qū)、南陵縣和懷寧縣，病穗品種為早秈、中秈、中粳和晚粳，稻瘟病單孢菌株112株；大別山地單、雙季稻作區(qū)為金寨縣、潛山市和岳西縣，病穗品種為中秈和中粳，稻瘟病菌單孢菌株56株；皖南山地單、雙季稻作區(qū)為石臺縣、休寧縣、寧國市、黃山區(qū)和歙縣，病穗品種為中秈、中粳和晚粳，稻瘟病菌單孢菌株93株（表1）。

表1 安徽省主要稻作區(qū)稻瘟病樣本采集信息Table 1 Collection information of rice blast samples from main rice growing areas in Anhui Province

2.2 安徽省稻瘟病菌生理小種類型

通過鑒定分類，分離獲得的稻瘟病菌為7個種群25個生理小種，主要為ZA、ZB、ZC、ZE、ZF、ZG和ZH，沒有ZD群小種出現(xiàn)，優(yōu)勢種群為ZB群，出現(xiàn)頻率為58.58%，次優(yōu)勢種群為ZC群，出現(xiàn)頻率為22.62%，其他種群分別為ZG群9.26%、ZH群4.90%、ZA群3.00%、ZE群0.82%和ZF群0.82%（圖1）。優(yōu)勢生理小種為ZB13、ZB15和ZC15，出現(xiàn)頻率分別為32.43%、17.98%和17.98%，ZG1、ZH1、ZC13、ZB29、ZB31、ZB9和ZB11生理小種亦有相對較高的出現(xiàn)頻率，依次為9.26%、4.90%、3.54%、1.91%、1.91%、1.36%和1.36%，其他15個生理小種出現(xiàn)頻率較低，共7.36%（圖2）。

圖1 安徽省主要稻作區(qū)稻瘟病菌種群出現(xiàn)頻率Fig.1 Frequency of M. oryzae populations in main rice growing areas of Anhui Province

圖2 安徽省主要稻作區(qū)稻瘟病菌生理小種出現(xiàn)頻率Fig.2 Frequency of physiological races of M.oryzae in main rice growing areas of Anhui Province

優(yōu)勢種群ZB群中有9個生理小種，分別為ZB1、ZB5、ZB7、ZB9、ZB11、ZB13、ZB15、ZB29和ZB31，其中ZB13出現(xiàn)頻率最高，占ZB群小種的55.35%，ZB15次之，占30.70%，ZB29和ZB31分別占3.26%，其他ZB小種共占7.43%（表2）。優(yōu)勢種群ZC群中有4個生理小種，分別為ZC1、ZC11、ZC13和ZC15，其中ZC15出現(xiàn)頻率最高，占ZC群小種的79.52%，ZC13次之，占15.66%，ZC1 和ZC11 分別占1.20%和3.61%（表3）。

表2 ZB群中各小種的出現(xiàn)頻率Table 2 Frequency of physiological races in ZB population

表3 ZC群中各小種的出現(xiàn)頻率Table 3 Frequency of physiological races in ZC population

2.3 安徽省不同稻作區(qū)稻瘟病菌生理小種分布

安徽省地處暖溫帶與亞熱帶的過渡地帶，依據地理位置、光溫水土資源、耕作制度、品種類型及生產條件等，安徽水稻種植區(qū)域可劃分為5個稻作區(qū)。對不同稻作區(qū)稻瘟病菌生理小種的鑒定，可為水稻品種的選育和推廣布局提供參考。

對沿淮淮北單季稻作區(qū)鳳臺縣、懷遠縣和謝家集區(qū)進行稻瘟病菌生理小種鑒定，鳳臺縣鑒定出4群7個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB15、ZC15和ZB13；懷遠縣4群9個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13和ZB9；謝家集區(qū)2群4個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13和ZG1（圖3）。

圖3 沿淮淮北單季稻作區(qū)稻瘟病菌小種分布Fig.3 Physiological race distribution of M.oryzae in single-season rice growing area along the Huaihe River

對江淮丘陵單、雙季稻過渡區(qū)全椒縣、壽縣和肥西縣進行稻瘟病菌生理小種鑒定，全椒縣鑒定出3群4個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB15；壽縣3群8個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13、ZC15和ZB15；肥西縣2群5個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13和ZB15（圖4）。

圖4 江淮丘陵單、雙季稻過渡區(qū)稻瘟病菌小種分布Fig.4 Physiological race distribution of M.oryzae in single-and double-season rice growing areas of the Jianghuai hilly area

對沿江雙、單季稻作區(qū)青陽縣、無為市、宣州區(qū)、當涂縣、貴池區(qū)、南陵縣和懷寧縣進行稻瘟病菌生理小種鑒定，青陽縣鑒定出3群4個生理小種，優(yōu)勢小種為ZC15；無為市4群6個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13和ZG1；宣州區(qū)4群10個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13、ZB15和ZC15；當涂縣2群4個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13、ZC13和ZC15；貴池區(qū)2群3個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB15和ZC15；南陵縣4群9個生理小種，優(yōu)勢小種為ZC15、ZB13和ZB15；懷寧縣1群1個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13（圖5）。

圖5 沿江雙、單季稻作區(qū)稻瘟病菌小種分布Fig.5 Physiological race distribution of M.oryzae in double-and single-season rice growing areas along Yangtze River

對大別山地單、雙季稻作區(qū)金寨縣、潛山市和岳西縣進行稻瘟病菌生理小種鑒定，金寨縣鑒定出3群5個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13和ZG1；潛山市2群4個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13和ZB15；岳西縣3群5個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13和ZH1（圖6）。

圖6 大別山地單、雙季稻作區(qū)稻瘟病菌小種分布Fig.6 Physiological race distribution of M.oryzae in single-and double-season rice growing areas of Dabie Mountains

對皖南山地單、雙季稻作區(qū)石臺縣、休寧縣、寧國市、黃山區(qū)和歙縣進行稻瘟病菌生理小種鑒定，石臺縣鑒定出6群12個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB15、ZB13和ZC15；休寧縣5群7個生理小種，優(yōu)勢小種為ZC15、ZG1、ZB15和ZH1；寧國市5群6個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13和ZG1；黃山區(qū)2群3個生理小種，優(yōu)勢小種為ZB13、ZC13和ZC15；歙縣1群1個生理小種，優(yōu)勢小種為ZC15（圖7）。

圖7 皖南山地單、雙季稻作區(qū)稻瘟病菌小種分布Fig.7 Physiological race distribution of M.oryzae in single-and double-season rice growing areas of mountains in south Anhui

2.4 稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種致病力分析及抗苗瘟資源篩選結果

為進一步弄清安徽省優(yōu)勢生理小種的致病力，選取休寧縣和金寨縣的ZB13生理小種、休寧縣和潛山縣的ZB15生理小種以及休寧縣和南陵縣的ZC15生理小種分別對775份水稻種質資源進行苗瘟接種鑒定，并分析各小種的致病力。結果（圖8）顯示，休寧縣和金寨縣ZB13 的致病力分別為59.68%和62.06%，平均為60.87%；休寧縣和潛山縣ZB15的致病力分別為61.16%和64.84%，平均為63.00%；休寧縣和南陵縣ZC15的致病力分別為71.29%和66.26%，平均為68.78%。

圖8 優(yōu)勢生理小種致病力分析Fig.8 Pathogenicity analysis of dominant physiological races

通過對775份水稻種質資源鑒定篩選，共獲得10份對安徽省稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種表現(xiàn)為高抗或抗病的優(yōu)異種質材料（表4），為稻瘟病抗性新基因的挖掘和育種利用提供材料基礎。

表4 抗苗瘟優(yōu)異種質資源篩選Table 4 Screening of excellent germplasms with seedling blast resistance

3 討論

陳莉等（2007）對2002年收集的安徽省稻瘟病菌生理小種鑒定發(fā)現(xiàn)，ZA～ZH等8個種群均有分布，優(yōu)勢種群為ZB群，出現(xiàn)頻率為77.2%，優(yōu)勢生理小種為ZB13和ZB15，出現(xiàn)頻率分別為43.2%和25.0%。本研究通過對2019—2020年收集的安徽省主要稻作區(qū)的367個稻瘟病菌進行分離鑒定，共鑒定出ZA、ZB、ZC、ZE、ZF、ZG和ZH等7個種群，未檢測到ZD群，其中優(yōu)勢和次優(yōu)勢種群為ZB和ZC群，優(yōu)勢生理小種為ZB13、ZB15和ZC15。研究發(fā)現(xiàn)，近年來安徽省稻瘟病菌種群結構與陳莉等（2007）的研究結果相比發(fā)生了顯著變化，優(yōu)勢種群ZB群出現(xiàn)頻率由77.2%下降至58.58%，ZC種群由3.5%上升至22.62%；優(yōu)勢生理小種ZB13出現(xiàn)頻率由43.2%下降至32.43%，ZB15由25.0%下降至17.98%，優(yōu)勢生理小種ZC15顯著上升，其出現(xiàn)頻率增加至17.98%；其他種群的出現(xiàn)頻率亦發(fā)生較大變化，ZA群由5.2%降至3.00%，ZD群由1.7%降至0，ZE群由1.7%降至0.82%，ZF群由1.7%降至0.82%，ZG群由5.2%上升至9.26%，ZH群由3.5%上升至4.90%；生理小種中ZG1、ZH1和ZC13亦有較高的出現(xiàn)頻率，分別為9.26%、4.90%和3.54%。此次收集的稻瘟病病穗包括早中晚稻、秈粳糯稻、常規(guī)稻和雜交稻等，幾乎涵蓋了安徽省所有水稻種植類型，同時病穗來源地包括安徽省5個稻作區(qū)的主要市（縣、區(qū)），稻瘟病菌菌株的收集在品種和地理位置上均較全面。本研究對安徽省不同市（縣、區(qū)）的稻瘟病菌生理小種進行分離和鑒定，得出安徽省主要稻作區(qū)稻瘟病菌生理小種結構分布。研究結果表明稻瘟病菌在相同稻作區(qū)的不同市（縣、區(qū)）差異明顯，為安徽省水稻抗性品種的推廣布局提供參考。

通過與各省稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種比較發(fā)現(xiàn)，安徽省稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種與廣東省極為相似，均 為ZB13、ZB15 和ZC15，廣 東 省 優(yōu) 勢 生 理 小 種ZB13、ZB15 和ZC15 的 出 現(xiàn) 頻 率 分 別 為32.47%、18.05%和12.14%（鐘寶玉等，2018）；與湖北隨州地區(qū)和湖南桃江病圃均存在相似的優(yōu)勢小種，為ZB15，湖北隨州地區(qū)優(yōu)勢生理小種ZB15出現(xiàn)頻率為60.53%，湖南桃江病圃優(yōu)勢生理小種為ZB15 和ZB1，出現(xiàn)頻率分別為39.6%和15.1%（李杰等，2021；吳堯等，2021）；與廣西區(qū)存在相似的優(yōu)勢小種，為ZB13，廣西區(qū)優(yōu)勢生理小種為ZB9和ZB13，出現(xiàn)頻率均為19.01%（陳小林等，2017）。與江蘇、山東、福建、黑龍江和遼寧地區(qū)的稻瘟病菌結構差異較大。研究結果為稻瘟病菌群體結構分析和水稻品種的推廣布局提供依據和指導。

稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種的致病力對水稻種質資源挖掘和品種選育至關重要，辛威等（2016）在研究黑龍江省2013—2014年稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種的致病力時發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢小種ZD5和ZD7均具有較強的致病力；福建省優(yōu)勢生理小種ZB5和ZA5在不同地區(qū)亦具有較強的致病力（鄧云，2021）。本研究選取不同市（縣、區(qū)）的ZB13、ZB15和ZC15為優(yōu)勢生理小種代表進行致病力分析，結果表明這些優(yōu)勢小種的致病力均在50.00%以上，暗示安徽省稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種不僅分布廣泛且具有較強的致病力。對長江中下游地區(qū)粳稻稻瘟病菌基因型與優(yōu)勢混合生理小種的研究發(fā)現(xiàn)Pi5和Pia基因對抗性貢獻較大，基因組合Pi5+Pia、Pi5+Pia+Pik+Pikm和Pita+Pik+Pikm+Pb1具有重要的應用價值（周坤能等，2022）。陳晴晴等（2022）研究結果表明長江中下游區(qū)試秈稻品種稻瘟病抗性最佳基因組合為Pi9+Pikh、Pi9+Pik+Pikh和Pi9+Pik+Pi1+Pikh。這些結果為長江中下游水稻品種選育及安徽省水稻品種推廣布局提供指導。

4 結論

通過對2019—2020年安徽省不同稻作區(qū)稻瘟病菌進行鑒定，結果表明安徽省稻瘟病菌優(yōu)勢種群為ZB和ZC群，優(yōu)勢生理小種為ZB13、ZB15和ZC15，同時分析安徽省5個稻作區(qū)不同市（縣、區(qū)）稻瘟病菌生理小種類型，明確其優(yōu)勢種群和生理小種的結構分布，為稻瘟病抗性育種和品種推廣布局提供參考。