姜黃素對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的穩(wěn)定作用及其機(jī)制

于悅卿，苑可心，李永輝，王潔，趙培，，，路永剛，帖彥清

1 河北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050051；2 河北省人民醫(yī)院心內(nèi)一科；3 河北省疾病預(yù)防控制中心

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是引起冠心病、高血壓等疾病的危險(xiǎn)因素之一［1］。近年，隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，高糖、高脂及炎癥反應(yīng)所致的代謝紊亂在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［2］。當(dāng)體內(nèi)發(fā)生損傷應(yīng)激、免疫紊亂或血脂代謝紊亂時(shí)，斑塊內(nèi)壞死脂核比例增加，促血管新生因子聚集及基質(zhì)金屬蛋白酶活性增強(qiáng)，可造成AS斑塊穩(wěn)定性降低，形成易損斑塊（VP）［3］，VP的破裂會(huì)促進(jìn)局部血栓形成，一旦脫落將會(huì)隨著血流阻塞血管管腔，相應(yīng)組織缺血閉塞，形成心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病。VP的發(fā)展與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理狀態(tài)密不可分。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是細(xì)胞內(nèi)具有的將蛋白質(zhì)加工合成修飾與折疊并兼有鈣離子儲(chǔ)存和脂類合成之功能的最大細(xì)胞器。缺氧、ER的錯(cuò)誤折疊或未折疊大量積聚、ATP損耗或Ca2+紊亂可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）［4］，最終導(dǎo)致缺血—再灌注損傷、糖尿病等代謝異常疾病。有研究［5］用高膽固醇飼料飼養(yǎng)ApoE–/–小鼠及ApoE–/–并CHOP–/–小鼠，結(jié)果顯示，與ApoE–/–小鼠比較，ApoE–/–并CHOP–/–小鼠的AS斑塊破裂的概率降低，這表明由ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與AS易損斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)。姜黃素是從中藥姜黃中提取的重要活性成分，具有抗氧化、抗各種病原微生物、抗風(fēng)濕、抗腫瘤以及改善免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能的功效［6］。COBAN等［7］研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可使斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)減少37%，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率降低32%，最終導(dǎo)致AS病變減輕，其作用機(jī)制可能與IκB蛋白表達(dá)增加、TNF-α誘導(dǎo)的核因子κB/DNA結(jié)合以及核因子κB轉(zhuǎn)錄活性降低有關(guān)。目前姜黃素對(duì)AS作用的具體機(jī)制還不清楚。為進(jìn)一步揭示姜黃素在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其機(jī)制，本研究以ERS-PERK-CHOP通路為切入點(diǎn)，通過(guò)高脂飲食建立鼠AS模型，觀察姜黃素是否通過(guò)ERS信號(hào)通路對(duì)巨噬細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響，影響AS斑塊的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及 儀 器14只SPF級(jí)7～8周齡C57BL/6J-ApoE雄性小鼠，20～25 g，購(gòu)自卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（中國(guó)常州）［生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2016-0010］，小鼠均飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（冀）2015-0065］SPF級(jí)環(huán)境中，室溫（22±2）℃，濕度45%～55%，每籠6～7只，用高脂飲食（含21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%膽固醇）喂養(yǎng)16周后進(jìn)行分組及處理。Movat五色染色法試劑盒購(gòu)自Servicebio；TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；galectin-3、α-SMA免疫組化IgG購(gòu)自Abcam公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司等等。光學(xué)顯微鏡（上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司）；石蠟切片機(jī)（紹興譜爾儀器設(shè)備有限公司）；低溫離心機(jī)（貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；Epoch CHS酶標(biāo)儀（BioTek公司）；石蠟包埋機(jī)（恒松科技有限公司）；Western電泳儀（柏奧易杰科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理及分組隨機(jī)選擇高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE–/–小鼠2只，對(duì)主動(dòng)脈進(jìn)行HE及油紅O染色，觀察主動(dòng)脈竇處有明顯斑塊生成，即AS小鼠模型建立成功。將14只建立成功的ApoE–/–AS小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各7只，實(shí)驗(yàn)組將姜黃素配成100 mg/kg的混懸液1 mL，每天灌胃1次，連續(xù)4周；對(duì)照組以等量生理鹽水每天灌胃1次，連續(xù)4周。

1.3 兩組ApoE–/–AS小鼠主動(dòng)脈根部病變組織內(nèi)斑塊面積的測(cè)量采用Movat五色染色法。按照Movat五色染色法的操作步驟，取上述制備好的主動(dòng)脈根部切片，阿利新藍(lán)染色15 min，沖洗干凈，預(yù)熱的堿性乙醇分化數(shù)秒，Weigert蘇木精避光染色30 min，分化液分化數(shù)秒，流水沖洗，番紅O-酸性品紅染色5 min，水洗并行磷鉬酸溶液處理，切片入冰醋酸溶液5 min，天狼猩紅染液2 min，乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。觀察染色結(jié)果，以染色面積評(píng)估斑塊大小。

1.4 兩組ApoE–/–AS小鼠主動(dòng)脈根部病變組織內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量及凋亡情況觀察采用免疫組化染色法。治療4周后，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，開胸快速分離主動(dòng)脈根部，10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片，厚度設(shè)定5 μm，置烤箱烤片，常規(guī)脫蠟至水，按照免疫組化法的染色步驟進(jìn)行操作，分析兩組小鼠主動(dòng)脈根部病變組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量，以胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。于200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其均值以個(gè)/μm2表示。

采用TUNEL法觀察巨噬細(xì)胞的凋亡情況。取上述制備好的主動(dòng)脈根部切片，按照TUNEL試劑盒操作步驟檢測(cè)凋亡細(xì)胞，切片常規(guī)脫臘至水，PBS洗3次，置于蛋白酶K工作液中37℃反應(yīng)30 min，PBS洗3次，室溫固定30 min，PBS洗3次，室溫封閉10 min，PBS洗3次，并觀察易損斑塊中巨噬細(xì)胞的凋亡情況。顯微鏡下細(xì)胞呈綠色熒光者為凋亡細(xì)胞。每例切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，平均每100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)為細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。

1.5 兩組ApoE–/–AS小鼠主動(dòng)脈根部易損斑塊中PERK、CHOP、Caspase-9、Caspase-3的檢測(cè)采用Western boltting法。將主動(dòng)脈根從液氮中取出，稱取重量相近的組織，加入組織裂解液并研磨，使其裂解，置4℃環(huán)境中12 000 r/min離心15 min，上清液即為蛋白液。制備蛋白標(biāo)準(zhǔn)品并測(cè)定蛋白濃度，制備SDS-PAGE凝膠，上樣后調(diào)電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下5% BSA封閉，TBST洗3次，一抗孵育過(guò)夜，TBST洗3次，二抗孵育100 min，TBST洗3次，最后于暗室下曝光顯影拍照。以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算PERK、CHOP、Caspase-9和Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.2統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組斑塊面積、巨噬細(xì)胞數(shù)量、AI比較對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞大量增生變厚，彈力纖維連續(xù)性降低；實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈根部脂質(zhì)沉積明顯減少，易損斑塊變?。≒＜0.05）。光鏡下觀察到對(duì)照組主動(dòng)脈根部有大量巨噬細(xì)胞沉積，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈根部巨噬細(xì)胞數(shù)量減少。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈根部凋亡的巨噬細(xì)胞減少（P＜0.05），AI降低（P＜0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 兩組斑塊面積、巨噬細(xì)胞數(shù)量及AI（±s）

表1 兩組斑塊面積、巨噬細(xì)胞數(shù)量及AI（±s）

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組n 7 7斑塊面積（μm2）14 205.61±280.37 15 981.31±747.66巨噬細(xì)胞含量（個(gè)/μm2）751.69±33.86 575.62±38.37 AI 52.73±5.54 73.22±5.65

2.2 兩組小鼠主動(dòng)脈根部病變組織內(nèi)P-PERK、CHOP、Caspase-3、Caspase-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈根部病變組織內(nèi)P-PERK、CHOP、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.01、0.64±0.01、0.67±0.01、0.92±0.02，對(duì)照組 分 別為1.17±0.03、0.76±0.02、0.83±0.03、1.21±0.04，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈根部PERK、CHOP、Caspase-9、Caspase-3蛋白 相 對(duì) 表 達(dá) 量 低（t分 別 為15.900、14.198、13.386、17.156，P均＜0.05）。

3 討論

心腦血管疾病在全球非傳染性慢性疾病中死亡率高居第一位［8］，高脂血癥是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的一大危險(xiǎn)因素［9］。AS是一種炎癥性疾病，不同結(jié)構(gòu)組成的AS斑塊穩(wěn)定性也不同。斑塊內(nèi)大量的炎癥細(xì)胞分泌的趨化因子會(huì)逐漸降低斑塊的穩(wěn)定性；脂質(zhì)壞死核心的主要成分是泡沫細(xì)胞等粥樣物，由于單核巨噬細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)中關(guān)鍵成員之一，可吞噬體內(nèi)產(chǎn)生的代謝廢物和異物，再隨血液循環(huán)流經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)膜時(shí)因吞噬沉積于此的膽固醇而促進(jìn)了泡沫細(xì)胞的形成，進(jìn)而影響了斑塊的穩(wěn)定性。在AS晚期會(huì)出現(xiàn)大量泡沫細(xì)胞的凋亡或成簇積聚，加速了壞死核心的擴(kuò)大，使得VP的穩(wěn)定性降低。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最大的細(xì)胞器，在Ca2+儲(chǔ)存、蛋白質(zhì)調(diào)控及脂質(zhì)合成過(guò)程中發(fā)揮了舉足輕重的作用，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能重度紊亂或非正確折疊蛋白長(zhǎng)期大量積聚時(shí)可引發(fā)ERS［4］。為了應(yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境的輕度刺激，機(jī)體便誘導(dǎo)出細(xì)胞保護(hù)機(jī)制［10］，適應(yīng)性的激活未折疊蛋白反應(yīng)來(lái)抑制新蛋白質(zhì)的合成、加速錯(cuò)誤折疊蛋白的降解并誘導(dǎo)分子伴侶促進(jìn)蛋白折疊，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，恢復(fù)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)；但當(dāng)損傷性刺激長(zhǎng)期存在并超過(guò)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自我修復(fù)能力時(shí)，過(guò)度激活的ERS是引發(fā)細(xì)胞凋亡程序的主要誘因［11］。ERS中有3種主要的跨膜受體：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK），活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6），肌醇酶Iα（IREIα），正常情況下處于未激活的睡眠狀態(tài)，當(dāng)外部因素作用時(shí)，此3種受體便被激活，觸發(fā)具有自我保護(hù)的未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）［12］，其中PERK信號(hào)是ERS在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控的重要途徑之一。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡的下游通路中，最先活化ERS的信號(hào)感受蛋白PERK，即I型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感受蛋白，其為UPR的起始蛋白，正常情況下活性被抑制；而應(yīng)激狀態(tài)下，磷酸化的PERK激活真核啟動(dòng)因子2α（eIF2α），eIF2α可靈敏地感受到ER內(nèi)信號(hào)的變化，抑制蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)上調(diào)ATF4的表達(dá)，最終誘導(dǎo)CHOP基因的轉(zhuǎn)錄，并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Caspase-12，進(jìn)一步活化Caspase-9、Caspase-3等凋亡因子引起細(xì)胞凋亡。抑制Caspse-12可減少細(xì)胞凋亡［13］。CHOP是ERS中特異性轉(zhuǎn)錄因子，生理?xiàng)l件下，其于胞質(zhì)內(nèi)并處于低表達(dá)狀態(tài)，在受到重度應(yīng)激性刺激時(shí)表達(dá)明顯上調(diào)。門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中介導(dǎo)凋亡的特異性關(guān)鍵蛋白，ERS發(fā)生時(shí)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)，并磷酸化其下游蛋白Caspase-9，進(jìn)而激活執(zhí)行蛋白Caspase-3，啟 動(dòng) 細(xì) 胞 凋 亡。研 究［14］顯 示，ERS通 路 與ApoE–/–小鼠AS引起的巨噬細(xì)胞凋亡有著密不可分的關(guān)系。

姜黃素是姜黃發(fā)揮藥理作用最重要的活性成分。近年研究［15］發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗炎、抗氧化和清除氧自由基等作用；可通過(guò)減少炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-6、IL-8、前列腺素E2（PGE2）的合成來(lái)減輕炎癥過(guò)程［16］；可直接去除過(guò)量的自由基，防止ROS的產(chǎn)生，并可以增加抗氧化酶的活性［17］；可顯著增加對(duì)氧磷酶1芳基酯酶（PON1）的活性，降低LDL氧化的易感性，還能夠抑制巨噬細(xì)胞M1型極化，從而達(dá)到抗炎的作用［18］。本研究中，通過(guò)高脂飼料飼養(yǎng)ApoE–/–模型小鼠構(gòu)建AS模型，并探討了姜黃素對(duì)模型小鼠易損斑塊穩(wěn)定性的改善作用。結(jié)果表明，對(duì)照組主動(dòng)脈根部易損斑塊內(nèi)壞死核心增大，巨噬細(xì)胞凋亡顯著增多，誘導(dǎo)ERS的下游凋亡蛋白CHOP、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平增加；實(shí)驗(yàn)組在姜黃素灌胃處理4周后，小鼠主動(dòng)脈根部易損斑塊的壞死核心明顯減小，易損斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡減少，PERK、CHOP、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明姜黃素可通過(guò)抑制ERS通路來(lái)抑制巨噬細(xì)胞凋亡從而穩(wěn)定ApoE–/–小鼠AS易損斑塊，并防止其破裂。

綜上所述，姜黃素對(duì)AS易損斑塊有穩(wěn)定作用，其可能是通過(guò)抑制與凋亡相關(guān)的ERS-PERK-CHOP通路，減少巨噬細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而改善動(dòng)脈血管的形態(tài)學(xué)變化。但本研究采用的姜黃素濃度主要依據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道，在下一步工作中，需要繼續(xù)研究不同濃度姜黃素對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響，使得姜黃素在抗AS中的應(yīng)用更科學(xué)，更高效。