色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在T2DM發(fā)生發(fā)展、中醫(yī)證候相關(guān)生物標(biāo)志物及中藥代謝通路識(shí)別中的應(yīng)用進(jìn)展

李娜芬，陳學(xué)勤

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)B門中醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建 廈門 361001；2 福建中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院；3 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科

2型糖尿?。═2DM）是一種代謝紊亂的慢性高血糖疾病，其特征在于糖類、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝的改變。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)IDF最新發(fā)布的全球糖尿病地圖（第10版）顯示：目前有5.37億成年糖尿病患者，其中有2.4億為未診斷的糖尿?。?4.7%），絕大多數(shù)為T2DM。在我國(guó)T2DM占糖尿病人群的90%以上［1］。除了極高的發(fā)病率和漏診率，T2DM還會(huì)導(dǎo)致多種并發(fā)癥，如糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變及糖尿病周圍神經(jīng)病變等［2-5］，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人民健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在T2DM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，患者體內(nèi)往往出現(xiàn)一系列復(fù)雜的代謝變化，以往對(duì)于T2DM的研究方法主要以系統(tǒng)生物學(xué)和生物化學(xué)為主，忽視了患者體內(nèi)整體代謝水平的變化。代謝組學(xué)技術(shù)可以對(duì)生物體內(nèi)所有的內(nèi)源性小分子（MW＜1 000 Da）代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，將代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化與生理病理相關(guān)聯(lián)［6］，目前已廣泛應(yīng)用于心血管疾病、腎病、腫瘤等領(lǐng)域的研究［7-9］。常用的代謝組學(xué)技術(shù)包括：液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）、高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、核磁共振氫譜（IH-NMR）。不同的代謝組學(xué)技術(shù)特點(diǎn)各異，因此要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相宜的技術(shù)。IH-NMR技術(shù)可以檢測(cè)含有碳、氮或氧的化合物，具有前處理簡(jiǎn)便性、無(wú)損傷性、無(wú)偏向性等優(yōu)勢(shì)，但其靈敏度低、檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍窄、檢測(cè)的化合物數(shù)量有限。質(zhì)譜技術(shù)具有較高的專屬性及靈敏度，可以同時(shí)快速檢測(cè)和分析多種化合物，有效地解析樣本中的化合物成分；色譜技術(shù)具有超高的分離能力，配合質(zhì)譜的高靈敏度及強(qiáng)特異性的特點(diǎn)，色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用［10］。近年，色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在T2DM的相關(guān)性研究中被廣泛應(yīng)用，且取得不少研究成果，現(xiàn)就色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在T2DM發(fā)生發(fā)展早期、不同中醫(yī)證候生物標(biāo)志物及中藥代謝通路識(shí)別中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行以下綜述。

1 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在T2DM發(fā)生發(fā)展相關(guān)生物標(biāo)志物識(shí)別中的應(yīng)用

T2DM是一個(gè)慢性發(fā)展的過(guò)程，從臨床癥狀的出現(xiàn)到生化指標(biāo)的異常，再到相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，往往涉及多種代謝紊亂。通過(guò)色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以了解患者體內(nèi)代謝物的異常特征，識(shí)別T2DM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的潛在生物標(biāo)志物，有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)T2DM的生理病理機(jī)制。既為臨床診斷提供新途徑，也利于指導(dǎo)臨床及早介入干預(yù)手段、控制疾病發(fā)展。

1.1 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)T2DM發(fā)生相關(guān)生物標(biāo)志物的識(shí)別T2DM的發(fā)生涉及糖類、脂質(zhì)、氨基酸等代謝途徑的紊亂。當(dāng)患者出現(xiàn)臨床癥狀或生化指標(biāo)出現(xiàn)異常時(shí)，糖尿病可能已經(jīng)存在很長(zhǎng)時(shí)間了，故尋找反映其發(fā)生變化的潛在生物標(biāo)志物可以作為本病的早期診斷指標(biāo)。LONG等［11］采用超高效液相色譜—高分辨質(zhì)譜（UPLC-HRMS）技術(shù)對(duì)空腹血糖受損患者的血清進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了23種有差異的代謝產(chǎn)物，其中2-乙酰乳酸、2-羥基-2，4-戊二酸鹽、l-谷氨酰胺和l-阿拉伯糖水平與空腹血糖受損具有顯著的相關(guān)性。肖繼等［12］基于HPLC-MS的代謝組學(xué)方法分析糖耐量異?；颊叩难宕x產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)甘氨酸、賴氨酸和反式肉桂酸水平相對(duì)于健康人均呈下降趨勢(shì)，可能是T2DM前期的潛在生物標(biāo)志物。寧萌等［13］采用HPLC-MS技術(shù)對(duì)初發(fā)T2DM大鼠模型的血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)乳酸、尿素、甘油、L-異亮氨酸、L-絲氨酸等含量顯著上升，而氨基丙酸、β-羥基丁酸、磷酸、蘇氨酸、甘油酸等含量降低，并隨著病情發(fā)展而產(chǎn)生明顯變化，可作為T2DM早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。PORCU等［14］基于人群列隊(duì)的縱向數(shù)據(jù)和2樣本孟德爾隨機(jī)化（MR）的研究揭示了纈氨酸、亮氨酸、肉堿、谷氨酸、丙氨酸、甜菜堿、賴氨酸、甘露等代謝產(chǎn)物的反向因果效應(yīng)，表明T2DM的遺傳易感性可能觸發(fā)這些代謝產(chǎn)物的早期變化，可作為T2DM早期研究的微代謝指標(biāo)。谷艷等［15］采用GC-MS技術(shù)對(duì)T2DM患者的血清代謝物譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、半乳糖、甘油、游離脂肪酸（FFA C16：0、FFA C18：1、FFA C18：2）、纈氨酸及其代謝物2-酮戊二酸、亮氨酸、異亮氨酸及其代謝物2-酮異己酸濃度顯著升高，而甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺的濃度顯著降低。一項(xiàng)基于LC-MS技術(shù)的病例對(duì)照研究［16］通過(guò)對(duì)泰國(guó)T2DM患者的氨基酸譜進(jìn)行分離、鑒定和評(píng)估，證實(shí)了血漿谷氨酸濃度與T2DM的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)。

以上研究表明，從糖尿病前期到T2DM的發(fā)生，通過(guò)色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)均可檢測(cè)多種有差異的生物標(biāo)志物，這些有差異的生物標(biāo)志物可以預(yù)測(cè)人們患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)趨勢(shì)，為臨床早期診斷提供新途徑。此外，全方位的代謝譜分析還可以指導(dǎo)臨床對(duì)無(wú)癥狀的個(gè)體進(jìn)行早期干預(yù)手段的介入，實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。

1.2 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)T2DM并發(fā)癥發(fā)生相關(guān)生物標(biāo)志物的識(shí)別T2DM后期可引起的一系列慢性并發(fā)癥，正是這些慢性并發(fā)癥導(dǎo)致T2DM致殘率及病死率增加。由于早期臨床癥狀不明顯，很難對(duì)其進(jìn)行早期干預(yù)。目前多依賴于患者自覺(jué)定期體檢篩查，但具有很高的漏診率?！凹炔》雷儭保瑢ふ铱梢灶A(yù)測(cè)T2DM發(fā)展的生物標(biāo)志物，早期干預(yù)，對(duì)于控制疾病發(fā)展具有重大意義。

TAN等［17］采用LC-MS技術(shù)對(duì)糖尿病腎病患者的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺、苯乙酰谷氨酰胺、3-氨氧基硫酸、乙酰苯丙氨酸、黃嘌呤、二甲基尿酸和不對(duì)稱二甲基精氨酸等代謝產(chǎn)物水平明顯增加。SHAO等［18］則基于氣相色譜儀結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC-TOFMS）代謝組學(xué)方法分析糖尿病腎病患者的尿液，發(fā)現(xiàn)了9種有差異的代謝產(chǎn)物，主要涉及12種代謝途徑，其中4-羥基苯甲酸、腺苷、1-阿拉伯糖、1-天冬氨酸及加拉基酸可作為糖尿病腎病的潛在生物標(biāo)志物。朱曉蓉等［19］基于LC-MS代謝組學(xué)方法分析增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的血清，發(fā)現(xiàn)137種有差異的代謝產(chǎn)物，主要涉及硫代謝、鞘脂代謝、半胱氨酸以及蛋氨酸代謝通路。SUN等［20］采用超高性能液體-Q-Exactive-質(zhì)譜（UPLC-QE-MS）技術(shù)分析糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的血漿，發(fā)現(xiàn)了22種屬于不同代謝途徑的代謝產(chǎn)物，認(rèn)為假尿苷、谷氨酸鹽、亮氨酰、亮氨酸和N-乙酰色氨酸可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變的特異性生物標(biāo)志物。任繁棟等［21］采用超高效液相色譜—高分辨質(zhì)譜（UPLC-HRMS）技術(shù)對(duì)T2DM合并冠心病患者的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了37種有差異的代謝產(chǎn)物，認(rèn)為脂肪酸代謝在T2DM合并冠心病患者的代謝紊亂中起重要作用。

近年研究［22-25］表明，在DM進(jìn)展過(guò)程中也會(huì)影響腦代謝，最終導(dǎo)致糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)代謝紊亂。糖尿病腦病是指糖尿病引起的認(rèn)知障礙和大腦的神經(jīng)生理及結(jié)構(gòu)改變，特別是阿爾茨海默?。ˋD）和抑郁癥［26-28］。CHEN等［29］基于LC-MS代謝組學(xué)方法分析糖尿病伴輕度認(rèn)知障礙大鼠模型的血清，發(fā)現(xiàn)了94種差異表達(dá)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，主要參與鞘脂代謝、色氨酸代謝、甘油磷脂代謝，認(rèn)為血清中的PE、PC、L-色氨酸和1-磷酸鞘氨醇可作為糖尿病伴輕度認(rèn)知障礙早期診斷的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。SONG等［30］采用超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF-MS）技術(shù)分析糖尿病認(rèn)知功能障礙前期小鼠模型的尿液，認(rèn)為C8H9N、5-羥基-l-色氨酸、煙酰胺、惰性乙醛、鞘氨酸、焦谷氨酸和n-乳酰纈氨酸可作為糖尿病認(rèn)知功能障礙的早期生物標(biāo)志物。一項(xiàng)對(duì)來(lái)自巴爾的摩衰老縱向研究和尸檢隊(duì)列的腦組織樣本進(jìn)行定量和靶向代謝組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，鞘脂代謝的紊亂與尸檢時(shí)AD病理學(xué)的嚴(yán)重程度及前驅(qū)期和臨床前階段的AD進(jìn)展相關(guān)，認(rèn)為鞘脂類可能是AD早期的潛在生物標(biāo)志物，糾正鞘脂代謝紊亂可作為AD新的治療策略。

由上，我們可以看到無(wú)論是糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變還是糖尿病腦病等，通過(guò)色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)均可以識(shí)別與之相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。由于T2DM的預(yù)后取決于其并發(fā)癥的發(fā)展，故控制并發(fā)癥的發(fā)展在T2DM的診療中至關(guān)重要。但臨床上大多關(guān)注患者血糖情況，往往忽略T2DM后期引起的一系列慢性并發(fā)癥。通過(guò)色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以鑒定T2DM并發(fā)癥發(fā)展過(guò)程中的潛在生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物不僅可以輔助疾病進(jìn)行分級(jí)診斷，還可以指導(dǎo)臨床進(jìn)行早期干預(yù)、控制疾病發(fā)生，從而降低致殘率及病死率。

2 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在T2DM不同中醫(yī)證候生物標(biāo)志物及T2DM相關(guān)中藥代謝通路識(shí)別中的應(yīng)用

中醫(yī)學(xué)作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在T2DM的治療中具有舉足輕重的地位。因證立法、隨法選方、據(jù)方施藥是中醫(yī)臨床診療的環(huán)節(jié)，缺一不可。雖然蘊(yùn)含著豐富而寶貴的臨床經(jīng)驗(yàn)，但在中醫(yī)理論方面存在著主觀性、模糊性及不確定性等方面的不足。因此，需要利用現(xiàn)代技術(shù)建立客觀的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，使中醫(yī)理論更加客觀、更加科學(xué)。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以鑒定不同中醫(yī)證候的潛在生物標(biāo)志物，識(shí)別中藥代謝通路，從而為中醫(yī)現(xiàn)代化研究提供有力工具。

2.1 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)T2DM不同中醫(yī)證候生物標(biāo)志物的識(shí)別中醫(yī)以辨證論治為核心，準(zhǔn)確化、規(guī)范化的辨證不僅是論治的前提，還是提高臨床療效的關(guān)鍵。“證”是疾病過(guò)程中某一階段或某一類型的病理概括，“證候”是病理狀態(tài)的宏觀表現(xiàn)，對(duì)中醫(yī)證候分類的客觀化研究有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)中醫(yī)證的本質(zhì)。代謝組學(xué)的整體性和動(dòng)態(tài)性符合中醫(yī)的“整體觀”和“辨證法”的特征，近年來(lái)在中醫(yī)證候分類研究中也取得了不少成果。

楊宇峰等［31］采用超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)T2DM脾氣虛證大鼠模型的血清進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)2-羥基丁酸、赤蘚糖、L-絲氨酸、苯丙氨酸、尿苷二磷酸、L-高絲氨酸等代謝產(chǎn)物水平顯著上調(diào)，這些物質(zhì)與體內(nèi)糖類、脂類、蛋白質(zhì)等代謝紊亂息息相關(guān)。孫思怡采用LC-MS技術(shù)分析T2DM上熱下寒證患者的血漿，發(fā)現(xiàn)了37種有差異的代謝產(chǎn)物，主要涉及11個(gè)代謝途徑，認(rèn)為乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿可作為T2DM上熱下寒證的特異性生物標(biāo)志物。YANG等［32］對(duì)T2DM血瘀證大鼠模型的血漿進(jìn)行超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了46種有差異的代謝產(chǎn)物，主要與脂質(zhì)代謝、半乳糖代謝、亞油酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、糖酵解和花生四烯酸代謝等代謝途徑相關(guān)。汪曉娟采用LC-MS技術(shù)對(duì)2型糖尿病腎?、笃跉怅巸商撟C患者的血清進(jìn)行代謝組學(xué)研究，鑒定出17種有差異的代謝產(chǎn)物，主要以脂代謝紊亂為主，其中磷脂酰甘油、鞘磷脂和溶血磷脂酰乙醇胺可作為2型糖尿病腎?、笃跉怅巸商撟C的潛在生物標(biāo)志物。

中醫(yī)講究四診合參，通過(guò)“望、聞、問(wèn)、切”收集患者臨床資料，從而進(jìn)行辨證論治、遣方用藥。然而中醫(yī)證候分類在實(shí)際應(yīng)用中主要依賴醫(yī)生的主觀判斷，缺乏客觀證據(jù)支持，而對(duì)中醫(yī)證候分類的不合理或不正確的判斷可能導(dǎo)致處方不正確，直接影響臨床治療。通過(guò)色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以識(shí)別出不同中醫(yī)證型的潛在生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物可以為中醫(yī)證候分類提供客觀化、科學(xué)化的參數(shù)指標(biāo)，從而指導(dǎo)中醫(yī)臨證，提高臨床療效。

2.2 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)T2DM相關(guān)中藥代謝通路的識(shí)別色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不僅為中醫(yī)證候分類的客觀化需求提供了理論上和技術(shù)上的可能，也為下一步通過(guò)中藥干預(yù)代謝機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。時(shí)正媛等［33］采用超高效液相色譜—串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)金芪降糖片（黃芪、黃連、金銀花組成的中藥復(fù)方制劑）可以使溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）（18∶0）和LysoPC（16∶1）等9種代謝物下調(diào)，LysoPC（18∶1）和LysoPC（20∶0）等6種代謝物上調(diào)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝紊亂而緩解T2DM的進(jìn)程。周元等［34］發(fā)現(xiàn)，黃芩對(duì)T2DM大鼠糞便中的三羥基三甲基吲哚酮、白三烯、亮氨酰脯氨酸和雌二醇等含量具有調(diào)節(jié)作用，主要干預(yù)鞘脂類代謝和脂肪酸代謝。周子妍等［35］發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、磷脂代謝以及腸道菌群代謝從而降低T2DM胰島素抵抗大鼠模型的胰島素抵抗指數(shù)，同時(shí)預(yù)防血糖升高。孫麗麗等［36］對(duì)給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)的T2DM小鼠模型的血清進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了16種潛在的生物標(biāo)志物，涉及7個(gè)主要的代謝途徑，從而推測(cè)當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過(guò)提高機(jī)體對(duì)胰島素敏感性、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、減輕炎癥反應(yīng)等緩解T2DM的進(jìn)程。以上研究表明，運(yùn)用色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可識(shí)別藥物代謝通路、監(jiān)測(cè)藥物作用途徑，使得藥物在人體的作用機(jī)制更加可視化、微觀化，這對(duì)于實(shí)現(xiàn)臨床精準(zhǔn)用藥具有重要意義。

綜上所述，色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在T2DM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中已經(jīng)識(shí)別了大量的潛在生物標(biāo)志物，這使得對(duì)T2DM的生理病理機(jī)制認(rèn)識(shí)更加系統(tǒng)化、微觀化。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)識(shí)別不同中醫(yī)證候分類生物標(biāo)志物，使得中醫(yī)辨證論治更加客觀化、科學(xué)化，從方法論的層面為中醫(yī)辨證論治的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。此外，色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥代謝通路識(shí)別中的應(yīng)用，既為臨床精準(zhǔn)用藥提供了可能，也為未來(lái)挖掘具有降糖作用的中藥或中成藥提供有力工具。但目前的研究仍存在一些不足：T2DM是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展的異常變化過(guò)程，目前的研究多從靜態(tài)角度切入研究，忽略疾病過(guò)程中代謝標(biāo)志物的整體動(dòng)態(tài)變化。未來(lái)若能著眼于動(dòng)態(tài)角度的研究，對(duì)T2DM的生理病理機(jī)制將會(huì)有更加深入的認(rèn)識(shí)；在T2DM及相關(guān)并發(fā)癥方面已取得一些研究成果，但對(duì)糖尿病前期的研究尚少，論據(jù)不足，未來(lái)可針對(duì)糖尿病前期開展相關(guān)性研究，“未病先防”也是臨床工作的重要著眼點(diǎn)；目前只針對(duì)個(gè)別中醫(yī)證型進(jìn)行代謝組研究，若能深入開展中醫(yī)證候的系統(tǒng)生物學(xué)研究，完善中醫(yī)辨證論治體系的證候?qū)W基礎(chǔ)，不失為中醫(yī)現(xiàn)代化研究的新突破口。