毛酸漿果提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

王健，王萍

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150000）

巨噬細(xì)胞是機(jī)體最重要的免疫細(xì)胞類型之一[1]。在胞外微環(huán)境、內(nèi)分泌、異源物質(zhì)和衰老等條件刺激下，巨噬細(xì)胞具有免疫防御、監(jiān)視、調(diào)節(jié)等免疫功能，它通過(guò)吞噬作用[2]和分泌多種細(xì)胞因子，如炎性介質(zhì)一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PEG2）、腫瘤因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）等[3]調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答，適度調(diào)控巨噬細(xì)胞的活化對(duì)于提高機(jī)體的免疫力也有重要意義[4]。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，免疫細(xì)胞功能或活性增強(qiáng)，則機(jī)體免疫力相應(yīng)有所提高[5]。RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，繁殖效果好，已有較多研究通過(guò)體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，研究植物提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[6]。

毛酸漿（Physalis pubescensL.）是茄科酸漿屬的一年生草本植物，又名洋菇娘，其成熟果實(shí)呈金黃色[7]。酸漿作為一種北方地區(qū)特有的漿果，具有很高的食用和藥用價(jià)值[8]，含有人體必需的18種氨基酸、21種微量元素、大量的礦物質(zhì)、維生素及不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9-11]，毛酸漿中的黃酮類、甾體類、苯丙素類、生物堿類、脂肪酸類等多種化學(xué)成分具有抗腫瘤[12]、抗菌[13]、抗氧化[14]、降血糖[15]、免疫調(diào)節(jié)[16]等多種藥理活性。張英蕾[17]研究毛酸漿果漿對(duì)小鼠非特異性免疫有顯著影響，且醇提物的淋巴細(xì)胞增殖免疫活性大于水提物。Wang等[18]研究毛酸漿果中的醉茄內(nèi)酯具有很好的抗炎潛力。由此可知，毛酸漿果具有良好的免疫潛力。因此，本文以毛酸漿果提取物（Physalis pubescensL.Fruit Extract，PPFE）為原料，建立巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫模型，測(cè)定一氧化氮、細(xì)胞因子、吞噬功能及活性氧等指標(biāo)，進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期以及凋亡的影響，最后測(cè)定TNF-α、IFN-γ、IL-6的mRNA表達(dá)，以分析毛酸漿果提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響，擬為毛酸漿在營(yíng)養(yǎng)和保健食品、生物化學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RAW264.7細(xì)胞，上海吉滿生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS磷酸鹽緩沖溶液、胰蛋白酶-EDTA消化液、脂多糖、MTT、活性氧檢測(cè)試劑盒、DNA含量檢測(cè)測(cè)試劑盒（細(xì)胞周期），北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，浙江天航生物科技有限公司；TNF-α、IL-6、IFN-γ等ELISA試劑盒，泉州科諾迪生物技術(shù)有限公司；RNAeasyTMPlus動(dòng)物RNA抽提試劑盒、BeyoFastTMProbe One-Step qRT-PCR試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠；N-1-萘乙二胺鹽酸鹽，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；磷酸，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；中性紅染色液，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海佑科儀器儀表有限公司；CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)有限公司；熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀，貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；激光共聚焦顯微鏡，日本NiKon公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 毛酸漿果提取物的制備

稱取毛酸漿果100 g，以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇為提取溶劑，料液比1:10（m/V，g/mL）在室溫下浸提4 h后過(guò)濾，收集濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，低溫烘干脫去水分，再經(jīng)真空冷凍干燥后得提取物，提取物儲(chǔ)存在-20 ℃以備進(jìn)一步分析使用[17]。

1.3.2 活性成分的測(cè)定

1.3.2.1 總多酚含量測(cè)定

參考張洋婷等[19]的方法，并略作修改。移取樣品液0.5 mL于25 mL容量瓶中，加入5 mL蒸餾水，混勻后加入1 mL福林酚試劑，靜置1 min后加入8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至刻度，25 ℃恒溫水浴中避光反應(yīng)30 min后，在765 nm處測(cè)定吸光度，以沒(méi)食子酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.098 8x-0.092 6（R2=0.999 3）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得其總酚含量，毛酸漿果提取物中總酚含量以毛酸漿果（干重）中總酚的毫克數(shù)表示，表示為mg/g。

1.3.2.2 總黃酮含量測(cè)定

參考王晶晶[20]的方法，并略作修改。移取樣品液2 mL于10 mL具塞比色管中，補(bǔ)充體積分?jǐn)?shù)30%乙醇至5 mL，隨后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液0.6 mL搖勻，靜置6 min，再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，定容至10 mL，在510 nm處檢測(cè)吸光度，以蘆丁溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.015x+0.002 3（R2=0.999 5）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得其總酚含量，毛酸漿果提取物中總酚含量以毛酸漿果（干重）中總酚的毫克數(shù)表示，表示為mg/g。

1.3.2.3 多糖含量測(cè)定

多糖采用苯酚-硫酸法測(cè)得[21]。

1.3.2.4 活性成分分析

活性成分采用UPLC-Q-TOF-MS分析。色譜條件：色譜柱：BEH C18（100×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1% FA-H2O(A)-MeOH(B)，洗脫梯度為：體積分?jǐn)?shù)2% B（0～1 min），2%～98% B（1～12 min），98%～2% B（12～15 min），流量：0.35 mL/min，柱溫：40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣：1 μL。質(zhì)譜條件：ESI離子源（正負(fù)離子），噴霧電壓3800/3000 V（+/-），氣體溫度350 ℃，毛細(xì)管溫度230 ℃，掃描范圍m/z70～100 0。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

由質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清與DMEM配制細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞接種至含完全培養(yǎng)液T25細(xì)胞瓶中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行傳代，用3 mL PBS洗滌兩次后，加入500 μL胰酶消化細(xì)胞。加入3 mL培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，離心（1 000 r/min，5 min），棄去上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)液中吹打均勻后，移入培養(yǎng)瓶中[22]。

1.3.4 增殖活性測(cè)定

參考Wang等[23]的方法略作修改。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成每毫升2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，然后以每孔100 μL接種于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μL不同濃度的樣品，每組樣品均做六個(gè)平行，以加入100 μL不含樣品的培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入10 μL MTT溶液（終濃度為5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速震蕩10 min后，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。細(xì)胞增殖率按公式（1）計(jì)算：

式中：

Z——細(xì)胞增值率，%；

OD實(shí)——實(shí)驗(yàn)組（毛酸漿果提取物處理組）OD值；

OD空——空白組OD值。

1.3.5 一氧化氮（NO）含量測(cè)定

參考Fujiwara等[24]的方法略作修改。細(xì)胞在96孔板上按1.3.3分組培養(yǎng)后，同時(shí)以加入100 μL LPS（終濃度為0.5 μg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照組，按組收集細(xì)胞上清液（每組六個(gè)平行）。每孔取100 μL的上清液，在室溫下分別加入Griess Reagent Ⅰ、Griess ReagentⅡ（每孔50 μL）輕輕混勻后，于37 ℃反應(yīng)10 min后，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.3.6 細(xì)胞因子測(cè)定

按照Elisa試劑盒操作說(shuō)明，測(cè)定TNF-α、IL-6、IFN-γ等細(xì)胞因子含量。

1.3.7 TNF-α、IL-6、IFN-γ細(xì)胞因子qRT-PCR檢測(cè)

收集按1.3.3分組培養(yǎng)后的細(xì)胞，按照RNA抽提試劑盒操作說(shuō)明，提取總RNA，再應(yīng)用一步法qRT-PCR試劑盒，使用qPCR引物在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，采用20 μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：37 ℃、15 min；95 ℃、2 min；95 ℃、15 s；60 ℃、15 min，總共40個(gè)循環(huán)。各引物序列如表1，通過(guò)通過(guò)2-??Ct法計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.8 吞噬功能測(cè)定

參考苗月等[25]的方法略作修改。細(xì)胞在96孔板上按1.3.4分組培養(yǎng)后，每孔加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%中性紅溶液，靜置20 min后，棄去中性紅溶液并用PBS清洗2遍，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，室溫下放置2 h，待細(xì)胞裂解后，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。細(xì)胞吞噬率按公式（2）計(jì)算：

式中：

T——細(xì)胞吞噬率，%；

OD實(shí)2——實(shí)驗(yàn)組（毛酸漿果提取物處理組和脂多糖處理組）OD值；

OD空——空白組OD值。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.3.9 活性氧水平測(cè)定

參考Zhang等[26]和Liu等[27]的方法略作修改。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成每毫升2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，然后以每孔3 mL接種于6孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h后，每孔加入3 mL不同濃度的樣品，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。去除培養(yǎng)液，每孔加入1 mL適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。隨后使用激光共聚焦顯微鏡（LSCM）直接觀察成像情況，收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，并根據(jù)公式（3）計(jì)算相對(duì)ROS水平：

式中：

S——相對(duì)ROS水平；

R實(shí)——實(shí)驗(yàn)組（毛酸漿果提取物處理組和脂多糖處理組）ROS水平；

R對(duì)——對(duì)照組ROS水平。

1.3.10 細(xì)胞周期測(cè)定

參考Fu等[28]的方法略作修改。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成每毫升5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，然后以每孔3 mL接種于6孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h后，每孔加入3 mL不同濃度的樣品，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，隨后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，得出細(xì)胞周期百分比。

1.3.11 細(xì)胞凋亡測(cè)定

參考Xu等[29]的方法略作修改。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成每毫升5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，然后以每孔3 mL接種于6孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h后，每孔加入3 mL不同濃度的樣品，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 2021軟件進(jìn)行圖形繪制，以ANOVA進(jìn)行顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛酸漿果提取物中活性成分分析

毛酸漿果提取物中總多酚、黃酮、多糖的含量見表2。由表2可知，毛酸漿果提取物中總多酚含量為7.02 mg/g，黃酮含量為2.81 mg/g，多糖含量為9.57 mg/g。Hossam等[30]對(duì)酸漿中活性成分含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明總多酚含量最高為125.4 mg/g，黃酮含量為6.39 mg/g，說(shuō)明酸漿果富含活性物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)也具有潛在的藥用特性，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等。這為進(jìn)一步研究毛酸漿果提取物對(duì)巨噬細(xì)胞免疫增強(qiáng)作用提供依據(jù)。

表2 毛酸漿果提取物中總酚、黃酮、多糖含量(mg/g)Table 2 The content of total phenols, flavones and polysaccharides in extract of Physalis pubescens L. fruits

表3 PPFE組分UHPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果Table 3 Analysis results of PPFE component by UHPLC-Q-TOF-MS

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)毛酸漿果提取物組成進(jìn)行定性分析，UPLC-Q-TOF-MS總離子流色譜圖見圖1。得到相關(guān)化合物信息，結(jié)果見表3，表中化合物均為黃酮類物質(zhì)。

圖1 PPFE分離組分超高液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of PPFE component analyzed by UHPLC-Q-TOF-MS

2.2 毛酸漿果提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響

將5、10、12.5、25、50、100、250、500、100 0、200 0 μg/mL的PPFE濃度處理巨噬細(xì)胞24 h后，巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性和增殖活性見圖2。結(jié)果顯示，在10～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)，PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞沒(méi)有毒性作用且細(xì)胞活性顯著提高（p＜0.05），在25～250 μg/mL濃度范圍內(nèi)，巨噬細(xì)胞增殖率分別為130.53%、122.94%、115.94%、107.33%，差異顯著（p＜0.05），所以本實(shí)驗(yàn)選用25、50、100、250 μg/mL的PPFE作為樣品處理濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響Fig.2 Effects of PPFE on cell activity in RAW264.7 cells

2.3 毛酸漿果提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7一氧化氮（NO）分泌的影響

NO是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的主要效應(yīng)分子，不僅參與許多生理和病理活動(dòng)，而且是巨噬細(xì)胞破壞細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞主要媒介。因此，NO可作為測(cè)定巨噬細(xì)胞活化的定量指標(biāo)[31]。研究PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響由圖3可知，四個(gè)PPFE濃度均能提高RAW264.7細(xì)胞NO分泌量。在25～250 μg/mL濃度范圍NO釋放量分別為27.79、23.05、19.59 μmol/L以及15.18 μmol/L，以劑量依賴方式顯著減少（p＜0.05），NO濃度隨著PPFE處理濃度的升高而下降，極顯著高于空白組7.06 μmol/L（p＜0.01），顯著低于LPS陽(yáng)性對(duì)照組（0.5 μg/mL）的45.62 μmol/L（p＜0.01），表明PPFE可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞NO分泌。因此，可以推斷PPFE可以激活RAW264.7細(xì)胞發(fā)揮免疫作用，并且進(jìn)行一系列的免疫調(diào)控反應(yīng)。Chen等[32]研究正紅菇多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫增強(qiáng)作用，相較于空白組，顯著誘導(dǎo)了NO的產(chǎn)生。因此可知，當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活后，生成的NO發(fā)揮非特異免疫的主要細(xì)胞毒效應(yīng)。NO是成熟單核細(xì)胞極化為巨噬細(xì)胞后分泌的主要細(xì)胞因子或信號(hào)分子，發(fā)揮機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤細(xì)胞以及病原體增殖功能[33]。

圖3 PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響Fig.3 Effects of PPFE on the NO production in RAW264.7 cells

2.4 毛酸漿果提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞因子分泌的影響

細(xì)胞因子是細(xì)胞間信息傳遞的信使，是反映機(jī)體免疫應(yīng)答的重要指標(biāo)。當(dāng)機(jī)體正常時(shí)，適量釋放的細(xì)胞因子相互調(diào)控，激活免疫系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[34]。如圖4，經(jīng)不同濃度PPFE處理RAW264.7細(xì)胞后，TNF-α、IL-6及IFN-γ的分泌量隨濃度上升呈下降趨勢(shì)，具有劑量依賴性，均極顯著高于空白組（p＜0.01），在25 μg/mL時(shí)有最大釋放量，分別為150.54、15.41、119.36 pg/mL。同時(shí)，LPS陽(yáng)性對(duì)照組處理的細(xì)胞因子分泌量分別為158.32、17.06、123.13 pg/mL。Mao等[35]研究臺(tái)灣紫丹水提物對(duì)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答調(diào)控的影響，結(jié)果表明紫丹水提物激活巨噬細(xì)胞增加TNF-α、IL-6細(xì)胞因子的釋放，來(lái)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞促炎能力，從而增強(qiáng)個(gè)體宿主的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究得到了類似的結(jié)果，PPFE可以對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生免疫刺激影響，使之分泌較高水平的細(xì)胞因子，并專職提呈抗原，參與正向免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能[36]。

圖4 PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-6、TNF-α、IFN-γ生成的影響Fig.4 Effects of PPFE on the IL-6, TNF-α and IFN-γ production in RAW264.7 cells

2.5 毛酸漿果提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

為明確PPFE免疫分子作用機(jī)制，采用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子合成基因的表達(dá)。由圖5可知，LPS陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中TNF-α、IFN-γ和IL-6的相對(duì)表達(dá)量極顯著（p＜0.01）高于毛酸漿果提取物處理組。同時(shí)，經(jīng)不同質(zhì)量濃度PPFE處理后，細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量呈劑量依賴性，與空白組相比，25 μg/mL PPFE對(duì)TNF-α、IFN-γ、IL-6細(xì)胞因子的表達(dá)均顯著增加（p＜0.01）且與LPS組最為接近，相對(duì)表達(dá)量為分別為26.17、24.70、11.39。TNF-α、IFN-γ、IL-6是巨噬細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，發(fā)揮機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤細(xì)胞以及病原體增殖功能[37]。有文獻(xiàn)[38]指出，漿果含豐富的酚類、黃酮類、多糖類、含氮成分等植物化學(xué)物質(zhì)，常與人類健康相關(guān)。漿果不僅影響癌變細(xì)胞，甚至影響免疫細(xì)胞，同時(shí)，漿果復(fù)合的植物化學(xué)物質(zhì)提供了比高濃度單一成分更有效的免疫刺激，由此可見，PPFE可能通過(guò)提高巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子合成基因的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞成熟，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫能力。

圖5 PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α（a）、IFN-γ（b）、IL-6（c）mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effects of PPFE on the expression of TNF-α (a), IFN-γ (b)and IL-6 (c) mRNA in RAW264.7 cells

2.6 毛酸漿果提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力的影響

巨噬細(xì)胞在炎癥的發(fā)生、維持、宿主防御等方面起著至關(guān)重要的作用[39]，其吞噬功能是機(jī)體最重要的非特異性免疫反應(yīng)之一[40]。巨噬細(xì)胞對(duì)異物的吞噬能力，也一定程度上反應(yīng)了巨噬細(xì)胞的活力。如圖6所示，與空白組相比，不同濃度PPFE處理RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞的吞噬率增加，并呈一定的劑量-效力關(guān)系。在25～250 μg/mL濃度范圍內(nèi)下吞噬率分比為189.88%、151.49%、143.56%、128.85%，且極顯著（p＜0.01）高于空白組（110.66%）與LPS陽(yáng)性對(duì)照組（164.44%），表明PPFE能夠有效激活RAW264.7細(xì)胞，增加巨噬細(xì)胞吞噬能力。李芳宇等[41]研究發(fā)現(xiàn)人參根提取物，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖以及吞噬能力增強(qiáng)。吞噬作用是巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞清除外源性病原微生物和內(nèi)源性衰老和死亡細(xì)胞的重要手段，從而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用。本文通過(guò)中性紅吞噬法，檢測(cè)PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬功能的影響，得出相似結(jié)果?；罨木奘杉?xì)胞最顯著的特征之一是吞噬作用的激增，這是巨噬細(xì)胞對(duì)病原體和癌細(xì)胞反應(yīng)的第一步和重要的步驟。吞噬作用是消除病原體的主要系統(tǒng)，可提高宿主對(duì)微生物感染的先天免疫應(yīng)答。

圖6 PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.6 Effects of PPFE on the pinocytic capability of RAW264.7 cells

2.7 毛酸漿果提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7活性氧（ROS）生成的影響

為探究PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響，用熒光探針DCFH-DA標(biāo)記PPFE處理24 h后的RAW264.7細(xì)胞。如圖7a所示，與空白組相比，25～250 μg/mL的PPFE處理RAW264.7細(xì)胞后，相對(duì)ROS水平極顯著增加（p＜0.01），并隨著濃度上升呈下降趨勢(shì)。相對(duì)ROS水平分別為137.75%、131.77%、126.66%、114.62%，LPS陽(yáng)性對(duì)照組相對(duì)ROS水平為136.50%。DCFH被細(xì)胞內(nèi)活性氧氧化為DCF，產(chǎn)生綠色熒光，熒光強(qiáng)度可顯示活細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平[42]。Waqas等[43]研究綠包藤提取物可以顯著增加巨噬細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，ED50值為24.23 μmol/L。在巨噬細(xì)胞中，ROS是分化、激活和功能的關(guān)鍵功能效應(yīng)因子。本實(shí)驗(yàn)得到了相似結(jié)果，由7b～7e圖可知，LSCM觀察顯示，與空白組相比，PPFE處理24 h的細(xì)胞中的ROS量明顯增加。說(shuō)明，PPFE處理24 h可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生?；钚匝踝鳛榧?xì)胞復(fù)雜的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)的中心參與者，適量的ROS可以介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳遞的調(diào)節(jié)，激活免疫反應(yīng)信號(hào)[44]。因此，推測(cè)出PPFE可以刺激巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放各種高活性的非特異性細(xì)胞毒介質(zhì)，如NO、活性氧等，從而增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能。

圖7 （a）PPFE對(duì)巨噬細(xì)胞ROS生成的影響，（b～e）用PPFE和LPS處理24 h后RAW264.7細(xì)胞的LSCM圖像Fig.7 (a) Effects of PPFE on the pinocytic capability in RAW264.7 cells, (b～e) LSCM images of RAW 264.7 cells treated with PPFE and LPS for 24 h

2.8 毛酸漿果提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞周期的影響

本文探究PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期分布的影響，檢測(cè)結(jié)果如圖8和表4所示。與空白組相比，經(jīng)25 μg/mL和250 μg/mL PPFE處理24 h后，RAW264.7細(xì)胞于G0/G1期所占百分比下降，分別減少到53.08%和56.30%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，S期和G2/M期所占百分比上升，由空白組的14.08%、26.68%，分別增加到17.40%、29.52%和15.48%、28.22%。當(dāng)PPFE質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，各時(shí)期的變化趨勢(shì)與LPS陽(yáng)性對(duì)照組最接近。Sérgio等[45]研究報(bào)道，用酸漿乙醇提取物處理誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞周期停滯在G1期，且在S期的比例增加，加快淋巴細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。在細(xì)胞周期中，G1期主要合成RNA和核糖體，S期主要是DNA復(fù)制、組蛋白和酶的合成；G2期為有絲分裂的準(zhǔn)備期。G0期細(xì)胞大量存在，則不利于細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂[46]。根據(jù)結(jié)果可知，PPFE可以調(diào)節(jié)RAW264.7細(xì)胞周期分布比例，防止RAW264.7細(xì)胞阻滯于G0/G1期，促使巨噬細(xì)胞在G1期向G2期和S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，使之更好的發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

表4 PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期的影響（%）Table 4 Effects of PPFE on the cell cycle of RAW264.7 cells

圖8 （a）PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期的影響，（b～e）PPFE和LPS處理24 h后RAW264.7細(xì)胞的FCM圖像Fig.8 (a) Effects of PPFE on the cell cycle of RAW264.7 cells,(b～e) FCM images of RAW264.7 cells treated with PPFE and LPS for 24 h

2.9 毛酸漿果提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響

PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響見圖9a。25 μg/mL和250 μg/mL PPFE處理組RAW264.7細(xì)胞凋亡率分別為16.50%、23.68%，與空白對(duì)照組34.94%凋亡率相比，極顯著降低（p＜0.01），LPS陽(yáng)性對(duì)照組凋亡率為9.48%。由圖9b～9e可知，流式細(xì)胞儀觀察顯示，PPFE處理組正常具有細(xì)胞活性且可增殖的細(xì)胞比例顯著高于空白組（p＜0.01）。表明PPFE可減緩RAW264.7細(xì)胞凋亡，凋亡結(jié)果與增殖率結(jié)果相對(duì)應(yīng)。因此可知，PPFE可緩解巨噬細(xì)胞凋亡進(jìn)程，促進(jìn)其分化增殖，從而增強(qiáng)個(gè)體宿主免疫調(diào)控應(yīng)答。

圖9 （a）PPFE對(duì)RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響，（b～e）PPFE和LPS處理24 h后RAW264.7細(xì)胞的FCM圖像Fig.9 (a) Effects of PPFE on the apoptosis of RAW264.7 cells,(b～e) FCM images of RAW264.7 cells treated with PPFE and LPS for 24 h

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了毛酸漿果提取物中總多酚、黃酮以及多糖的含量，通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS分析，共鑒定出14種黃酮成分。并基于RAW264.7巨噬細(xì)胞免疫模型探究PPFE免疫調(diào)節(jié)作用，得出PPFE提高RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO、TNF-α、IFN-γ、IL-6、ROS等免疫信號(hào)分子含量以及吞噬功能，PPFE能夠減輕RAW264.7細(xì)胞凋亡情況，促進(jìn)其分化增殖，同時(shí)PPFE可緩解RAW264.7細(xì)胞阻滯于G0/G1期，使細(xì)胞正常的進(jìn)行分化繁殖，PPFE使RAW264.7巨噬細(xì)胞在基因表達(dá)層次上促進(jìn)TNF-α、IFN-γ、IL-6，文中探討了PPFE功能組分和體外免疫增強(qiáng)作用，而PPFE物質(zhì)分離、結(jié)構(gòu)表征和在通路水平上免疫影響有待后續(xù)的研究。