酵米面和銀耳及其制品中毒黃素和熱誠菌素的檢測方法的建立及穩(wěn)定性比較

汪輝，鄧楠，崔曉嬌,2，陳先桂，王璐，袁圓,2，陳高超，周策睿

（1.長沙市食品藥品檢驗(yàn)所，國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心（湖南），湖南長沙 410016）

（2.食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410111）

隨著人們生活質(zhì)量的提高，食品安全問題日益受到大眾的關(guān)注。近來年，細(xì)菌性食物中毒時(shí)常發(fā)生，其中關(guān)于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）中毒事件較為突出[1-6]。2020年10月，黑龍江雞西市發(fā)生的“酸子湯”（酵米面）事件造成9名中毒者全部死亡，經(jīng)當(dāng)?shù)匦l(wèi)健部門定性為由椰毒假單胞菌污染引起的食物中毒事件。銀耳如果儲存不當(dāng)或時(shí)間過長，也易受該菌污染而引起中毒[1,5]。引起中毒的原因是唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）產(chǎn)生了米酵菌酸和毒黃素[4,7-9]?？傮w來說，米酵菌酸的毒性較大，關(guān)注度較高，檢測方法較成熟，且有食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[10]。但毒黃素（見圖1）的毒理學(xué)表明：小鼠靜脈口服毒黃素L D50為8.39 mg/kg[8]，毒性也較大，對人、動物、許多微生物及植物皆有毒性作用[11-13]。關(guān)于其作用部位、致毒機(jī)理的研究也有不少的報(bào)道[14-16]。熱誠菌素是毒黃素的同分異構(gòu)體（見圖1），和毒黃素一樣，擁有嘧啶并三嗪環(huán)骨架結(jié)構(gòu)，且在一定化學(xué)條件下兩者能夠相互轉(zhuǎn)化[17]。其毒理學(xué)表明：倉鼠腹腔注射LD50為11.2 mg/kg。由于兩者毒性均較高，中毒后需盡快解毒，所以其穩(wěn)定性研究很有必要，但目前該研究尚屬空白。因此，為了預(yù)防唐菖蒲伯克霍爾德氏菌中毒事件的發(fā)生以及后期中毒的鑒定和分析，需建立酵米面和銀耳及其制品中的毒黃素和熱誠菌素的測定方法，并對目標(biāo)物進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

圖1 毒黃素和熱誠菌素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of toxoflavin and fervenulin

目前，毒黃素和熱誠菌素的穩(wěn)定性研究較少，關(guān)于毒黃素的檢測方法較多，關(guān)于熱誠菌素的檢測方法較少，主要有薄層色譜法[18]、分光光度法[19,20]、高效液相色譜法[21]、高效液相-質(zhì)譜法[7]及流動注射化學(xué)發(fā)光法在線監(jiān)測法[22]等。這些方法大多應(yīng)用于細(xì)菌培養(yǎng)液中高濃度毒黃素的測定，不適用于食品中低含量毒素的測定。張偉等[7]采用了較昂貴的超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜，一般實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)，且對人員操作要求較高；周鵬等[23]和王朝霞等[24]建立的高效液相色譜法采用低波長檢測，可能存在一定干擾，且靈敏度有待提高。本文以酵米面和銀耳及其制品為研究對象，建立了一種測定酵米面和銀耳及其制品中毒黃素和熱誠菌素的高效液相色譜法。同時(shí)，對毒黃素和熱誠菌素的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，以期為后期解毒或避毒研究提供參考。該方法前處理簡單，干擾較小，準(zhǔn)確度和靈敏度較高，具有一定的應(yīng)用價(jià)值，可以為毒黃素和熱誠菌素的致毒機(jī)理及解毒方法的研究提供新的技術(shù)支撐，同時(shí)也可以更好地應(yīng)對和處理此類食品安全事故，以尋找搶救的最佳方案，減少死亡率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Milli-Q Direct 8超純水儀，德國MERCK公司。

毒黃素純度為97.22%，熱誠菌素純度為98.17%，香港標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究所；GBW(E)130417紫外分光光度計(jì)用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（重鉻酸鉀溶液），四川中測標(biāo)物科技有限公司；甲醇為色譜純，德國MERCK公司；甲酸為色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，氨水為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；食用小蘇打（碳酸氫鈉），長沙智騰食品貿(mào)易有限公司；食用純堿（碳酸鈉），武漢成達(dá)食品有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q Direct 8超純水儀制得的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精確稱取毒黃素和熱誠菌素各10 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為400 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，冷凍條件下（-18 ℃）可保存5個(gè)月。采用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液配制成標(biāo)準(zhǔn)系列使用液，供高效液相色譜分析。

1.3 波長的選擇

采用不接色譜柱直接進(jìn)樣，高效液相色譜儀二極管陣列檢測器對毒黃素和熱誠菌素在210～600 nm進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)掃描結(jié)果設(shè)置合適波長進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液測試，根據(jù)測試結(jié)果選擇波長。

1.4 進(jìn)樣溶劑優(yōu)化

采用0.1%甲酸水、0.1%甲酸水-甲醇（95:5，V/V）、0.1%甲酸水-甲醇（90:10，V/V）、0.1%甲酸水-甲醇（80:20，V/V）和0.1%甲酸水-甲醇（70:30，V/V）配制20 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察進(jìn)樣溶劑對目標(biāo)物的色譜峰形的影響。

1.5 提取溶劑的選擇

毒黃素和熱誠菌素溶于甲醇和水，本試驗(yàn)參考流動相考察采用0.1%甲酸水和甲醇提取樣品，觀察提取時(shí)樣品狀態(tài)和后期樣品溶液過濾狀態(tài)。

1.6 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A為0.1%甲酸水，B為甲醇，梯度洗脫程序：0～5.00 min，6% B，5.00～10.00 min，6% B～50% B，10.00～12.00 min，50% B，12.01 min，6% B；毒黃素檢測波長：398 nm，熱誠菌素檢測波長：338 nm，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：80 μL。

1.7 樣品前處理

取10 g酵米面（取樣前混勻）或5 g銀耳罐頭（取樣前勻漿）于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1%甲酸超聲提取10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液于25 mL容量瓶中，重復(fù)提取一次，合并上清液，用0.1%甲酸溶液定容至刻度，混勻，取溶液過0.45 μm濾膜，待測。

取5 g鮮銀耳（取樣前粉碎至顆粒狀）或干銀耳（取樣前粉碎至粉末狀）于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇超聲提取10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL于10 mL刻度塑料離心管中，45 ℃氮吹至近干，0.1%甲酸溶液定容至1 mL，渦旋復(fù)溶1 min，取溶液過0.45 μm濾膜，待測。

1.8 方法學(xué)驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限：配制濃度為0.20、0.40、0.80、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00 mg/L的毒黃素和熱誠菌素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度平行測定3次。以3倍信噪比計(jì)算檢出限，10倍信噪比計(jì)算定量限。

加標(biāo)回收率和精密度：在空白酵米面中添加0.50、1.00、5.00 mg/kg的毒黃素和熱誠菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在空白鮮銀耳、干銀耳和銀耳罐頭分別添加1.00、2.00、10.00 mg/kg的毒黃素和熱誠菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4節(jié)方法進(jìn)行前處理和1.2節(jié)儀器條件進(jìn)行測定，每個(gè)添加水平濃度平行測定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度。

專屬性試驗(yàn)：毒黃素和熱誠菌素是水溶性黃色毒素。本試驗(yàn)配制了實(shí)驗(yàn)室常測的水溶性橙黃色色素（酸性橙1、酸性橙2、堿性橙2、堿性橙22、檸檬黃、日落黃）和生物毒素（黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲毒毒素A）標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用建立的方法進(jìn)行分析，考察對目標(biāo)分析物有無影響。

1.9 穩(wěn)定性比對

采用甲醇配制100 mg/L的毒黃素和熱誠菌素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別采用0.1%甲酸，1%甲酸和0.1%氨水配制10 mg/L的毒黃素和熱誠菌素的標(biāo)準(zhǔn)使用液。在相應(yīng)的環(huán)境中分別保存0、1、2、3、4、5個(gè)月，采用紫外可見分光光度計(jì)測定毒黃素（258 nm和398 nm）和熱誠菌素（240 nm和338 nm）的吸光度（見表1）。每次測定前采用GBW(E)130417紫外分光光度計(jì)用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（重鉻酸鉀溶液）對紫外分光度計(jì)進(jìn)行透射比測定。

表1 毒黃素和熱誠菌素的穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 1 Stability tests of toxoflavin and fervenulin

1.10 數(shù)據(jù)處理

本文化合物結(jié)構(gòu)式采用ACD/Labs releasee：12.00軟件繪圖，其他繪圖均采用OriginPro 2018C(64-bit)SR1 b9.5.195軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長的選擇

毒黃素在258 nm和398 nm有較大吸收峰，熱誠菌素在240 nm和338 nm有較大吸收峰，且兩種目標(biāo)物在低波長的吸收峰均高于高波長吸收峰（見圖2）。在分析標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，采用對應(yīng)的低波長測定時(shí)兩種目標(biāo)物的靈敏度均高于高波長（見圖3），但采用低波長分析樣品溶液時(shí)，由于大多數(shù)化合物在低波長均有一定的吸收，且樣品基質(zhì)較復(fù)雜，雜質(zhì)對目標(biāo)物的測定干擾較嚴(yán)重。當(dāng)波長為398 nm，毒黃素能獲得較高的靈敏度，當(dāng)波長為338 nm時(shí)，熱誠菌素能獲得較高的靈敏度，且在這兩種波長下目標(biāo)化合物的干擾較小[23]。因此，本方法選擇在398 nm波長下測定毒黃素和在338 nm波長下測定熱誠菌素。

圖2 毒黃素和熱誠菌素的光譜圖Fig.2 Spectrograms of toxoflavin and fervenulin

圖3 4種加標(biāo)樣品溶液在不同波長下的色譜圖Fig.3 Chromatograms of 4 kinds of spiked sample solutions at different wavelength

2.2 進(jìn)樣體積的選擇和進(jìn)樣溶劑優(yōu)化

本試驗(yàn)使用的進(jìn)樣器的進(jìn)樣范圍為0.1～100 μL，為得到更低的檢出限值，又避免采用進(jìn)樣器極限值，最終選用較大體積即80 μL作為進(jìn)樣體積[25]。進(jìn)樣溶劑對目標(biāo)物的色譜峰形影響較大，且對毒黃素的色譜峰形的影響大于熱誠菌素（見圖4）。當(dāng)溶劑為0.1%甲酸水和0.1%甲酸水-甲醇（95:5，V/V）時(shí)，兩種目標(biāo)物的峰形對稱且尖銳。當(dāng)甲醇含量≥10%時(shí)，毒黃素峰形開始出現(xiàn)展寬，當(dāng)甲醇含量≥20%時(shí)，熱誠菌素的峰形也開始出現(xiàn)展寬，當(dāng)甲醇含量為30%時(shí)，毒黃素出現(xiàn)了肩峰。因此，選用0.1%甲酸水作進(jìn)樣溶劑，操作較簡便。

2.3 提取溶劑的選擇

圖4 不同溶劑配制的毒黃素和熱誠菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.4 Chromatograms of toxoflavin and fervenulin n standard solution prepared with different solvent

采用0.1%甲酸水時(shí)，較適合酵米面和銀耳罐頭中目標(biāo)物的提取，提取率大于85%；但干銀耳和鮮銀耳會吸水，提取溶液較粘稠，后期無法通過濾膜；而采用甲醇時(shí)，適合所有類型的樣品中目標(biāo)物的提取，提取率大于80%?？紤]本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑提取，后期需要濃縮后置換溶劑，使前處理過程變得復(fù)雜，最終選用0.1%甲酸水溶液提取酵米面和銀耳罐頭，甲醇溶液提取干銀耳和鮮銀耳。

表2 方法的檢出限、定量限、線性范圍、回歸方程和R2Table 2 LODs, LOQs, linear ranges, regression equations and R2 of this method

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，平均峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩種目標(biāo)物在0.20～20.00 mg/L呈良好線性。酵米面中的毒黃素和熱誠菌素的檢出限均為0.15 mg/kg，定量限為0.50 mg/kg；銀耳及其制品中的毒黃素和熱誠菌素的檢出限均為0.30 mg/kg，定量限為1.00 mg/kg，具體結(jié)果見表2。

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

回收率試驗(yàn)結(jié)果表明：四種樣品基質(zhì)中毒黃素的加標(biāo)回收率為79.77%～104.02%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.50%～8.91%；熱誠菌素的加標(biāo)回收率為93.31%～104.36%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.96%～5.77%，具體結(jié)果見表3。

2.6 專屬性試驗(yàn)

生物毒素（黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲毒毒素A）在338 nm和398 nm波長處無吸收，在色譜圖中無響應(yīng)，橙黃色色素（酸性橙1、酸性橙2、堿性橙2、堿性橙22、檸檬黃、日落黃）雖有響應(yīng)，但在目標(biāo)物出峰處均無干擾（見圖5），說明該方法有一定的抗干擾能力，專屬性較好。

圖5 干擾試驗(yàn)的色譜圖Fig.5 Chromatogram of interference test

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用建立的方法測定4個(gè)酵米面、6個(gè)干銀耳、2個(gè)銀耳罐頭，均未檢出毒黃素（＜檢出限）和熱誠菌素（＜檢出限），測定10個(gè)鮮銀耳，2個(gè)鮮銀耳樣品檢出毒黃素，含量范圍為1.50～7.77 mg/kg；3個(gè)樣品鮮銀耳檢出熱誠菌素，含量范圍為1.01～3.41 mg/kg。典型陽性樣品色譜圖和光譜圖見圖6。

表3 回收率試驗(yàn)和精密度Table 3 Recovery and precision test (n=6)

圖6 典型陽性樣品色譜圖和光譜圖Fig.6 Chromatograms and spectrograms of typical positive samples

2.8 與現(xiàn)有方法的對比

本方法與現(xiàn)在方法進(jìn)行了對比，結(jié)果見表4。張偉等[7]建立的超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS/Q-Trap）檢出限能達(dá)到0.004 μg/kg，但該設(shè)備較昂貴，對檢測人員要求也較高，一般實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)；劉倩妤等[22]建立的流動注射化學(xué)發(fā)光法靈敏度也較高，方法檢出限可達(dá)到0.01 mg/L，但分析對象僅適用于飲用水，且只能檢測毒黃素；周鵬等[23]建立的高效液相色譜法（HPLC）雖然分析了三種目標(biāo)物，但采用低波長檢測樣品時(shí)會導(dǎo)致基線較高，方法檢出限僅為3 mg/kg，且分析的新鮮銀耳樣品為已泡發(fā)的樣品，有一定的局限性；王朝霞等[24]建立高效液相色譜法（HPLC），雖同樣采用低波長檢測，但前處理采用液液萃取方法，可以一定程度上凈化樣品，從而使方法靈敏度有了一定的提高，檢出限為0.8 mg/kg，但方法不適用于酵米面和銀耳及其制品的分析；本方法針對酵米面、鮮銀耳、干銀耳和銀耳罐頭樣品特性，采用不同的提取溶劑進(jìn)行提取，并克服溶劑效應(yīng)，采用大體積進(jìn)樣[25]，利用毒黃素和熱誠菌素的高波長作為檢測波長，大大降低了雜質(zhì)的干擾，同時(shí)提高方法靈敏度，方法檢出限相對于周鵬等建立的方法降低了一個(gè)數(shù)量級，即0.15 mg/kg。本文采用梯度洗脫排除了等度洗脫會導(dǎo)致后出峰組分色譜峰展寬和雜質(zhì)富集色譜柱的影響，大體積進(jìn)樣和高波長檢測有效地解決了復(fù)雜基質(zhì)的干擾，大大提高了方法的穩(wěn)定性和靈敏度。經(jīng)方法驗(yàn)證和實(shí)際樣品測定，本方法切實(shí)可行，效果令人滿意。

表4 與現(xiàn)有方法的對比Table 4 Comparison with existing methods

2.9 穩(wěn)定性比對

采用GBW(E)130417紫外分光光度計(jì)用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（重鉻酸鉀溶液）對紫外分光光度計(jì)進(jìn)行透射比測定，每次三次平行測定的透射比允許誤差符合I級標(biāo)準(zhǔn)，且連續(xù)5個(gè)月的透射比的RSD小于0.65%，說明儀器的穩(wěn)定性較好[26]。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（見圖7）表明：采用甲醇配制100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在冷凍條件下（-18 ℃），兩種目標(biāo)化合物5個(gè)月內(nèi)的吸光值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.90%和0.58%，說明在此條件下，毒黃素和熱誠菌素較穩(wěn)定；采用0.1%甲酸（V/V）和1%甲酸（V/V）配制10 mg/L的使用液，毒黃素的吸光值會隨著時(shí)間變長而變小，5個(gè)月內(nèi)降解至26%以下，且采用1%甲酸（V/V）配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液降解速度快于0.1%甲酸（V/V），而熱誠菌素在5個(gè)月內(nèi)吸光值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.18%，說明在此條件下，熱誠菌素較穩(wěn)定。另外，同一濃度毒黃素和熱誠菌素在高波長下吸光值較低波長的吸光值穩(wěn)定，說明在高波長下測定兩種目標(biāo)物偏差較??；采用0.1%氨水（V/V）配制10 mg/L的使用液顏色較采用0.1%甲酸（V/V）配制10 mg/L的使用液淺，其中毒黃素的吸光值不到后者的40%，熱誠菌素的吸光值不到后者的20%，說明在此條件下，毒黃素和熱誠菌素極不穩(wěn)定，易發(fā)生降解。

根據(jù)毒黃素和熱誠菌素在堿性條件下不穩(wěn)定的現(xiàn)象，我們采用0.1%、0.5%、1.0%、2.0%食用小蘇打（m/m）和0.1%、0.5%、1.0%、2.0%食用純堿（m/m）分別配制毒黃素和熱誠菌素溶液進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用食用小蘇打溶液（m/m）配制的毒黃素變化不明顯，熱誠菌素的吸光值（338 nm）變?yōu)?.1%甲酸（V/V）配制的熱誠菌素溶液的85%左右，且隨著溶液濃度升高變化不顯著；采用食用純堿（m/m）配制的兩種目標(biāo)物溶液顏色迅速變淺，其中采用0.1%食用純堿（m/m）配制的毒黃素，吸光值（398 nm）為0.1%甲酸（V/V）配制的毒黃素溶液的18.28%，隨著食用純堿（m/m）的濃度增大，降解比例隨之降低，當(dāng)濃度為1%時(shí)，降解比例達(dá)到12.48%；而熱誠菌素的降解更為明顯，當(dāng)采用0.1%食用純堿（m/m）配制的熱誠菌素，吸光值（338 nm）為0.1%甲酸（V/V）配制的熱誠菌素溶液的1.11%，且隨著食用純堿（m/m）濃度增加，變化不顯著（見圖8）。因此，我們在日常生活中采用1%食用純堿（m/m）清洗或浸泡相關(guān)食品，可以大幅度降解毒黃素和熱誠菌素，從而降低中毒的風(fēng)險(xiǎn)。

圖7 毒黃素和熱誠菌素在不同溶液和不同儲存環(huán)境中的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of toxoflavin and fervenulin in different solution and storage environment

圖8 毒黃素和熱誠菌素在不同質(zhì)量濃度的食用小蘇打和純堿溶液中降解至原濃度的比例Fig.8 The ratio of toxoflavin and fervenlulin degraded to their original concentrations in different concentrations of edible baking soda and sodium carbonate

3 結(jié)論

本文以酵米面和銀耳及其制品為研究對象，采用C18色譜柱對目標(biāo)物進(jìn)行分離，在其高波長下進(jìn)行分析，建立測定毒黃素和熱誠菌素的高效液相色譜法。采用該方法對樣品進(jìn)行測定，經(jīng)保留時(shí)間和光譜圖定性，外標(biāo)法定量，檢測出部分鮮銀耳中含有目標(biāo)物。該方法與現(xiàn)有的方法比較，前處理簡單易行，干擾較小，準(zhǔn)確度和靈敏度較高，可適用于酵米面、銀耳及其制品中毒黃素和熱誠菌素的定性定量分析，可為食品安全監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供技術(shù)支撐。目標(biāo)物的穩(wěn)定性研究表明，毒黃素和熱誠菌素在堿性條件下易發(fā)生降解，日常生活中，采用1%食用純堿（m/m）清洗或浸泡相關(guān)食品，可能會降低毒黃素和熱誠菌素中毒的風(fēng)險(xiǎn)。毒黃素在酸性條件下會隨著時(shí)間變長慢慢降解，熱誠菌素在酸性條件下穩(wěn)定性較好。穩(wěn)定性對比結(jié)果可為后期的解毒（如果降解產(chǎn)物毒性?。┗虮芏荆ㄈ绻到猱a(chǎn)物毒性大）提供了有力的參考。