玉米后熟期間醇溶蛋白結(jié)構(gòu)和理化特性

李 琦，葛思彤，張士禹，王天池，鄭明珠，吳玉柱，趙城彬，劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130118）

玉米是世界第一大農(nóng)作物，在全球都有廣泛的種植，2020年中國玉米年產(chǎn)量高達(dá)2.6億 t，占比全球22.9%，是全球第二大玉米生產(chǎn)國。新采收的玉米在食用及加工前貯藏數(shù)天至數(shù)月，在這期間，其可食用性及促進(jìn)健康的品質(zhì)均發(fā)生了改變。玉米在初步成熟后進(jìn)行采收，此時玉米籽粒尚未完全成熟，生理生化反應(yīng)仍在持續(xù)進(jìn)行中，經(jīng)過一段時間的貯藏后，玉米籽粒的品質(zhì)得到多方面的改善，使其作為食物、飼料和加工原料等具有更優(yōu)的特性，這個過程稱為后熟。禾本科作物包括水稻、小麥、玉米等，是世界上最為重要的糧食作物，他們都具有后熟的特性，但其機制研究并不成熟。Giorni等發(fā)現(xiàn)玉米在新采收后仍舊進(jìn)行一系列的呼吸作用，使其內(nèi)部的活性物質(zhì)及營養(yǎng)成分發(fā)生變化。Jelena等發(fā)現(xiàn)新收獲的小麥后熟過程中，4 種蛋白含量呈波動式變化，其結(jié)構(gòu)在后熟過程也發(fā)生一定變化，如巰基含量下降，二硫鍵含量上升等，巰基和二硫鍵的變化影響小麥粉的加工特性。有研究發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，小麥蛋白的分子質(zhì)量發(fā)生變化。還有研究發(fā)現(xiàn)水稻經(jīng)過貯藏后，其營養(yǎng)成分發(fā)生變化，對大米的功能特性均有重要影響。

玉米中的貯藏蛋白分為4 大類：清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白。玉米以醇溶蛋白為主，占貯藏蛋白總量的60%以上。玉米醇溶蛋白是一種兩親性植物蛋白，具有較高比例的非極性氨基酸殘基（＞50%）和獨特的溶解性。玉米醇溶蛋白不溶于水，可溶于一定濃度的乙醇溶液和強堿性溶液等，這導(dǎo)致其具有獨特的理化特性。研究表明蛋白質(zhì)二硫鍵和非二硫鍵共價交聯(lián)、疏水殘基暴露、肽鏈展開等結(jié)構(gòu)變化均會影響其理化性質(zhì)。Sun Cuixia等研究發(fā)現(xiàn)不同溫度和時間處理的玉米醇溶蛋白，對其二級結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、形態(tài)都有不同的影響。Agyare等研究發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白中加入羧甲基纖維素鈉可改變其發(fā)泡性能。張雪瑩等研究發(fā)現(xiàn)，玉米醇溶蛋白經(jīng)過微波和射頻加熱處理后，分子結(jié)構(gòu)展開，其溶解性和乳化性得到改善。Wang Lei等將玉米醇溶蛋白納米顆粒在70 ℃條件下加熱處理，其粒徑降低，使其可以通過靜電相互作用與多糖復(fù)合更加穩(wěn)定。

目前，關(guān)于玉米后熟過程中玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)和理化特性以及兩者的構(gòu)效關(guān)系研究鮮有報道。本實驗從蛋白的理化特性出發(fā)，研究玉米后熟過程中玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)特性、理化特性的變化規(guī)律及構(gòu)效關(guān)系，探究其后熟的機制，以期通過控制玉米后熟期調(diào)節(jié)玉米醇溶蛋白的理化特性，為玉米后熟期的判斷及玉米醇溶蛋白理化特性的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米（良玉99（LY99））產(chǎn)自吉林省梨樹縣；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴化鉀 美國Sigma公司；5,5’-二巰基-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB） 青島捷世康生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20000-CR高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；Alpha1-4LDplus冷凍干燥機 德國Christ公司；DU800型紫外-可見分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司；VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 德國Bruker公司；差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC）美國TA公司；ZS-Nano激光納米粒度儀 英國Malvern Panalytical公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米采后貯藏和玉米醇溶蛋白制備

選取一種非轉(zhuǎn)基因、栽培穩(wěn)定型玉米品種（LY99）。將新采收的玉米分別在溫度15 ℃和25 ℃、相對濕度55%的恒溫恒濕箱中貯藏，分別在第0、7、14、28、42、56天取樣提取玉米醇溶蛋白。首先將玉米脫粒，粉碎過80 目篩子，加入正己烷浸提2 h，反復(fù)3 次，取沉淀固體干燥備用。用75%乙醇溶液（液料比2∶1（mL/g））浸提2 h，反復(fù)3 次，4 000 r/min離心10 min后取上清液備用，得到蛋白提取液。將該提取液與含3%的NaCl溶液（1∶4，V/V）混合，靜置12 h，離心得到蛋白固體沉淀，將該沉淀水洗干凈，去除鹽離子后凍干，即為玉米醇溶蛋白。將不同貯藏時間下提取的玉米醇溶蛋白樣品分別記為ST0、ST7、ST14、ST28、ST42和ST56。

1.3.2 巰基及二硫鍵測定

參照Beveridge等的方法測定玉米后熟期間玉米醇溶蛋白的巰基含量。取不同后熟期質(zhì)量濃度2 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液0.5 mL備用。游離巰基的測定：將上述蛋白質(zhì)溶液加入到2.5 mL Tris-Gly緩沖溶液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0）中，加入50 μL的Ellman試劑（12 mg DTNB，3 mL Tris-Gly緩沖溶液），振蕩混勻，在室溫下靜置顯色15 min，測定其在412 nm波長處的吸光度?？瞻讟悠肥菍?.5 mL的蛋白質(zhì)樣品換成去離子水，其他試劑和反應(yīng)時間均相同，并且用空白進(jìn)行調(diào)零。總巰基的測定：將上述蛋白質(zhì)溶液加入到2.5 mL Tris-Gly緩沖溶液（含有8 mol/L尿素）中，其他操作與總巰基含量測定方法相同。

式中：SH為樣品總巰基含量/（μmol/g）；SH為樣品游離巰基/（μmol/g）含量；A為樣品在波長412 nm處的吸光度；D為溶液稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.3 表面疏水性測定

參照Tang Yu等的方法測定后熟期玉米醇溶蛋白的表面疏水性。取50 mg蛋白樣品溶于1.5 mL 0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)指示劑，在室溫下反應(yīng)10 min，隨后4 000×g離心10 min。將上清液稀釋10 倍，測量其在波長595 nm處的吸光度，空白組不加蛋白樣品。溴酚藍(lán)結(jié)合量按式（3）計算：

式中：A為空白在波長595 nm處的吸光度；A為樣品在波長595 nm處的吸光度。

1.3.4 Zeta電位及粒徑測定

配制75%的乙醇溶液，將玉米醇溶蛋白溶于乙醇溶液中，并將此溶液滴加到蒸餾水中配制成1 mg/mL的玉米醇溶蛋白溶液。測量電位的儀器參數(shù)設(shè)置如下：平衡時間120 s，每個樣品測量3 次，每次的測量設(shè)置在10～100 次范圍內(nèi)儀器自動運行。粒徑分布的儀器參數(shù)設(shè)置如下：折射率1.330，吸光度0.001，樣品遮光率0.1%～15%。

1.3.5 FTIR分析

參照Zhao Chengbin等的方法測定。將2 mg樣品與0.2 g溴化鉀混合充分研磨成均勻粉末，使用手動壓力機壓制成薄片，然后進(jìn)行全波段掃描（4 000～400 cm），掃描次數(shù)為64 次，分辨率為4 cm，波數(shù)精確度為0.01 cm，測定溫度為25 ℃。采用紅外光譜圖分析軟件Peak Fit對圖譜的酰胺I帶1 600～1 700 cm進(jìn)行分析，根據(jù)其擬合后的子峰面積，計算各二級結(jié)構(gòu)相對含量。

1.3.6 DSC

參考Paraman等的方法測定，稱取3 mg固體樣品于鋁皿中，并以空白鋁皿為對照。從20 ℃以10 ℃/min的速率升溫至180 ℃，氮氣流速為40 mL/min。采用TA Universal Analysis 2000軟件分析蛋白的熱特性，記錄峰值溫度（T）和焓變（ΔH）。

1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-gel electrophoresis，SDS-PAGE）

取不同后熟期的樣品5 mg，加入1 mL 2×的蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，在4 ℃、10 000 r/min離心5 min后將10 μL上清液添加到凝膠上樣品孔上，其中分離膠為12%，濃縮膠為4%，80 V使蛋白移動到濃縮膠與分離膠分界處時，將電壓升至120 V，直至蛋白全部跑完后停止。最后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，并用冰乙酸和乙醇脫色液脫色，待凝膠背景無明顯顏色即脫色完成，使用iBright CL1000成像。

1.3.8 溶解性測定

參考Nazari等的方法，稱取100 mg玉米醇溶蛋白溶于10 mL去離子水中，用1 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0，10 000 r/min離心15 min，取1 mL溶液溶于9 mL緩沖溶液（50 mmol/L EDTA和8 mol/L尿素，pH 10.0）中，測其在波長280 nm處的吸光度，記為A，離心前懸浮液的吸光度記為A。溶解性按式（4）計算：

1.3.9 持水性和持油性測定

參考Saetae等的方法。準(zhǔn)確稱取離心管的質(zhì)量記為m，再稱取0.1 g左右的玉米醇溶蛋白樣品記為m，向離心管中加入5 mL去離子水，4 000 r/min離心20 min，倒去上清液，稱質(zhì)量m。蛋白持水性按式（5）計算：

準(zhǔn)確稱取離心管的質(zhì)量記為M（g），再稱取0.1 g左右的玉米醇溶蛋白樣品記為M，向離心管中加入5 mL大豆油，4 000 r/min離心20 min，倒去上清液，稱質(zhì)量M。蛋白持油性按式（6）計算：

1.3.10 乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定

參考Pearce等的方法。制備1 mg/mL的玉米醇溶蛋白-乙醇溶液，取6 mL和2 mL大豆油于試管中，采用高速均質(zhì)機10 000 r/min均質(zhì)90 s，取乳化層100 μL加入到5 mL 1 mg/mL SDS中，于波長500 nm處測量其吸光度，記為A。靜置10 min后，在乳化層同一位置取100 μL加入到5 mL 1 mg/mL SDS中，于波長500 nm處測量其吸光度，記為A。乳化活性和乳化穩(wěn)定性按式（7）、（8）計算：

式中：C為蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為大豆油占比（0.25）；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.11 起泡能力和泡沫穩(wěn)定性測定

參考Motoi等的方法，制備0.1 g/mL玉米醇溶蛋白-乙醇溶液，取1 mL溶液滴入25 mL 0.02 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，使用高速均質(zhì)機12 000 r/min均質(zhì)2 min，測量均質(zhì)后的液面體積，記為V，靜置30 min后再次測量液面體積為V。起泡能力和泡沫穩(wěn)定性按式（9）、（10）計算：

1.4 統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05為差異顯著），并采用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巰基及二硫鍵分析

總巰基含量包括暴露在蛋白表面的游離巰基與包裹在蛋白內(nèi)部的巰基，暴露在蛋白外部的游離巰基易被氧化成二硫鍵，引發(fā)蛋白質(zhì)分子間的相互作用，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。如圖1所示，玉米醇溶蛋白的巰基和二硫鍵含量發(fā)生顯著變化（P＜0.05），說明玉米后熟期間存在巰基-二硫鍵交換反應(yīng)。整體來看，在玉米后熟期間玉米醇溶蛋白的總巰基與二硫鍵含量呈上升趨勢，游離巰基含量呈下降趨勢。在15 ℃和25 ℃后熟28 d時，玉米醇溶蛋白的游離巰基含量最低，與未后熟的樣品相比分別降低了27.09%和16.17%，在相同條件下樣品二硫鍵含量增加了5.01%和5.24%。這可能與玉米內(nèi)部的呼吸作用及氧化反應(yīng)有關(guān)。隨著后熟時間延長，游離巰基的含量下降，推測是由于包埋在內(nèi)部的巰基暴露，有利于巰基和二硫鍵之間的交換反應(yīng)。

圖1 玉米后熟期間醇溶蛋白巰基、二硫鍵含量Fig. 1 Changes in sulphydryl and disulfide bond conents of zein during postharvest ripening of corn

2.2 表面疏水性分析

圖2 玉米后熟期間醇溶蛋白表面疏水性的變化Fig. 2 Changes in surface hydrophobicity of zein during postharvest ripening of corn

表面疏水性是評價蛋白構(gòu)象變化及相互作用情況的重要指標(biāo)，它反映了蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)暴露的情況。采用溴酚藍(lán)結(jié)合法測定玉米醇溶蛋白的表面疏水性，溴酚藍(lán)結(jié)合量越高，表示蛋白的表面疏水性越大。如圖2所示，在后熟過程中，隨著貯藏時間的延長，溴酚藍(lán)與蛋白的結(jié)合呈降低趨勢，表明后熟作用使玉米醇溶蛋白表面疏水性下降。在15 ℃貯藏條件下，溴酚藍(lán)結(jié)合量從13.44 μg下降到9.43 μg，在25 ℃貯藏條件下，其結(jié)合量從13.44 μg下降到9.47 μg。這說明了蛋白經(jīng)過一段時間的后熟，暴露的疏水基團(tuán)經(jīng)過呼吸作用和氧化反應(yīng)，疏水性殘基相互締合形成聚集體，其內(nèi)部的非極性氨基酸的隱藏不利于溴酚藍(lán)與蛋白質(zhì)的結(jié)合。Wu Junnan等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)氧化誘導(dǎo)的大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，暴露的疏水殘基通過疏水相互作用形成聚集體，從而導(dǎo)致其表面疏水性下降。

2.3 Zeta電位與粒徑分析

Zeta電位反映了蛋白在溶液中的電荷及分布狀態(tài)，其絕對值越高，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性越好。從圖3A可知，玉米醇溶蛋白的Zeta電位均為負(fù)值，說明其表面帶有負(fù)電荷，且其絕對值在整個后熟期呈上升趨勢，在15 ℃后熟42 d及在25 ℃后熟28 d時，玉米醇溶蛋白的Zeta電位從-13.03 mV分別降至最低點-18.06 mV和-18.9 mV，這可能是在后熟期由于仍在繼續(xù)的呼吸作用導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致靜電相互作用增加了其保持體系穩(wěn)定性的能力。隨著Zeta電位絕對值的升高，蛋白之間的排斥力也增加，使其在水溶液體系中不易聚集，更加穩(wěn)定。

如圖3B所示，粒徑大小和多分散系數(shù)值均呈下降趨勢，15 ℃后熟42 d時，粒徑從354.93 nm降低至278.20 nm，多分散系數(shù)值從0.49降低至0.29，25 ℃后熟28 d時，粒徑從354.93 nm降低至287.83 nm，多分散系數(shù)值從0.49降低至0.27。后熟期間的氧化反應(yīng)能夠引起蛋白分子結(jié)構(gòu)的展開，Zeta電位的結(jié)果表明后熟作用使其表面電荷增加，通過靜電排斥作用防止了蛋白質(zhì)聚集，使其以更小的顆粒尺寸，更均勻的分布在溶液中，導(dǎo)致粒徑和多分散系數(shù)的降低。

圖3 玉米后熟期醇溶蛋白Zeta電位（A）、粒徑及多分散系數(shù)（B）的變化Fig. 3 Zeta-potential (A), particle size and PDI (B) of zein during postharvest ripening of corn

2.4 FTIR分析

FTIR是用于表征分子間相互作用力及蛋白二級結(jié)構(gòu)的技術(shù)之一，吸收峰的不同代表著其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。如圖4A、B所示，所有蛋白樣品在3 400 cm附近表現(xiàn)出明顯的吸收峰，這歸因于O—H的伸縮振動和蛋白中的氫鍵。在15 ℃條件下后熟28 d時，蛋白的吸收峰從3 396 cm移動至3 311 cm，隨后逐漸趨于穩(wěn)定，在25 ℃條件下后熟14 d時，其吸收峰從3 396 cm移動至3 315 cm，此后基本不再偏移，說明后熟破環(huán)了蛋白內(nèi)部的氫鍵平衡。2 900 cm附近的吸收峰代表著蛋白質(zhì)碳骨架中C—H的伸縮振動，后熟期間此峰發(fā)生藍(lán)移后又逐漸紅移。酰胺I帶（1 600～1 700 cm）及酰胺II帶（1 500～1 600 cm）是蛋白質(zhì)的特征吸收峰，由圖4A、B可以看到，在15 ℃后熟28 d時，酰胺I帶和酰胺II帶吸收峰分別從1 654 cm及1 535 cm移動至1 656 cm及1 537 cm，在25 ℃后熟14 d時，這2 個吸收峰分別從1 654 cm及1 535 cm移動至1 656 cm及1 535 cm，這些吸收峰位置的變化表明C—O、C—N及N—H基團(tuán)的振動發(fā)生改變。

酰胺I帶常用來解析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。如圖4C、D所示，β-折疊的相對含量呈現(xiàn)下降趨勢，無規(guī)卷曲相對含量呈現(xiàn)增加趨勢。15 ℃后熟42 d及25 ℃后熟28 d時，β-折疊的相對含量達(dá)到最低值，分別由34.08%降低至31.80%和31.09%，而無規(guī)卷曲相對含量由14.78%分別增加至18.02%和18.25%，說明玉米后熟增加了玉米醇溶蛋白的無序性，使其解折疊。β-折疊相對含量的降低使其結(jié)構(gòu)展開，使柔性程度增加，這可能是由于氫鍵作用的降低及其內(nèi)部仍舊進(jìn)行的氧化反應(yīng)促使其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖4 玉米后熟期間醇溶蛋白傅里葉變換紅外光譜圖（A、B）及二級結(jié)構(gòu)（C、D）Fig. 4 Fourier transform infrared spectra (A, B) and secondary structure composition (C, D) of zein during postharvest ripening of corn

2.5 熱特性分析

蛋白的熱特性可以采用DSC法鑒定，通過測量恒速加熱時蛋白的熱變性鑒定其熱穩(wěn)定性。隨著貯藏時間的延長，玉米醇溶蛋白的T整體向低溫度方向偏移。T為蛋白的變性溫度，通常與氫鍵的斷裂有關(guān)，T的降低表明蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性下降。由表1可知，在15 ℃貯藏42 d和25 ℃貯藏28 d時，T從109.70 ℃分別顯著降低至102.13 ℃和104.47 ℃，隨后又升高至103.72 ℃和108.91 ℃。Sandra等發(fā)現(xiàn)玉米在經(jīng)過一段時間的貯藏后，其內(nèi)部反應(yīng)導(dǎo)致蛋白的解折疊而使其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這可能是其變性溫度降低的原因。

焓值的變化（ΔH）與蛋白質(zhì)分子間的構(gòu)象變化有關(guān)，這些變化歸因于吸熱反應(yīng)例如氫鍵的斷裂以及放熱反應(yīng)例如疏水基團(tuán)的相互作用。后熟期間玉米醇溶蛋白的ΔH整體呈現(xiàn)下降趨勢，熱變性所需能量減少說明玉米醇溶蛋白因后熟而發(fā)生構(gòu)象變化。玉米在15 ℃和25 ℃后熟期間，ΔH分別下降了24.13%和24.69%，這可能是由于疏水相互作用的穩(wěn)定性逐漸增加所導(dǎo)致的放熱作用，也可能是其內(nèi)部結(jié)構(gòu)在后熟過程中產(chǎn)生了一些堆積。此外，F(xiàn)TIR的結(jié)果表明后熟降低了蛋白的氫鍵鍵合，這可能也是其焓值降低的原因。

表1 玉米后熟期醇溶蛋白的DSC熱力學(xué)參數(shù)Table 1 DSC thermodynamic parameters of zein during postharvest ripening of corn

2.6 SDS-PAGE

如圖5所示，在15 ℃和25 ℃貯藏溫度條件下，不同后熟期的玉米醇溶蛋白在25 kDa及45 kDa附近有2 條明顯的條帶，說明后熟作用不會改變蛋白質(zhì)亞基種類，但條帶的顏色及寬度有差異，表明其亞基的含量發(fā)生變化。19～22 kDa范圍的條帶代表α-玉米醇溶蛋白亞基，占據(jù)了玉米醇溶蛋白的70%～85%，45 kDa的條帶主要是γ-玉米醇溶蛋白亞基，其占據(jù)了玉米醇溶蛋白的10%～20%，α-玉米醇溶蛋白亞基的條帶在2 種溫度后熟28 d時有向下遷移的趨勢，γ-玉米醇溶蛋白亞基的條帶無明顯變化，推測是二硫鍵及疏水相互作用的變化影響了蛋白質(zhì)亞基的聚集，進(jìn)而降低了蛋白質(zhì)亞基的聚集程度及其分子質(zhì)量大小。

圖5 玉米后熟期醇溶蛋白SDS-PAGE圖Fig. 5 SDS-PAGE patterns of zein during postharvest ripening of corn

2.7 溶解性結(jié)果

圖6 玉米后熟期醇溶蛋白溶解性Fig. 6 Solubility of zein during postharvest ripening of corn

玉米醇溶蛋白具有獨特的溶解性，它可以直接影響蛋白質(zhì)的其他理化特性，溶解性的增加可能會提高蛋白分子的氣液界面性質(zhì)和油水界面性質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)其在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用。從圖6可以看到，隨著后熟時間的延長，玉米醇溶蛋白的溶解度都有不同程度的增加，在15 ℃后熟42 d時，溶解度達(dá)到最高值12.93%，以及在25 ℃后熟28 d時達(dá)到最高值12.88%。這可能是由于后熟期間玉米內(nèi)部發(fā)生的生理生化反應(yīng)使其結(jié)構(gòu)打開，使蛋白內(nèi)部的一些親水基團(tuán)暴露，從而使其溶解性增加，而28 d后溶解度有所下降可能是由于巰基氧化成二硫鍵使高分子質(zhì)量聚集體增加，且25 ℃條件下失水更快導(dǎo)致其溶解性較15 ℃條件下更早達(dá)到峰值。此外，研究發(fā)現(xiàn)后熟作用使玉米醇溶蛋白的粒徑和表面疏水性降低，這也可能是溶解度增加的原因。

2.8 持水性和持油性結(jié)果

如圖7所示，后熟期間，持水性整體呈上升趨勢，持油性整體呈下降趨勢，在15 ℃后熟42 d和25 ℃后熟28 d時，持水率達(dá)到最高值，分別為1.07 g/g和1.05 g/g；在15 ℃和25 ℃后熟7 d后，整體呈下降趨勢，推測是由于表面疏水性的降低，導(dǎo)致其親水基團(tuán)的暴露，從而增加了其親水性，降低了其吸油性。且FTIR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分子柔性增加，可能是導(dǎo)致其更親水的原因，因為分子柔性決定著蛋白質(zhì)分子的親疏水端與水相和油脂相互作用。

圖7 玉米后熟期醇溶蛋白的持水性和持油性Fig. 7 Water-holding capacity and oil-holding capacity of zein during postharvest ripening of corn

2.9 乳化性和起泡性分析

圖8 玉米后熟期醇溶蛋白乳化性（A）和起泡性（B）的變化Fig. 8 Changes in emulsifying (A) and foaming capacity (B) of zein during postharvest ripening of corn

蛋白的乳化性主要是其內(nèi)部同時含有親水性及疏水性基團(tuán)，使其能夠吸附在油水界面形成油水膜，起到穩(wěn)定乳液的作用。隨著后熟時間的延長，玉米醇溶蛋白的乳化性呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。從圖8A可以看到，在15 ℃和25 ℃后熟14 d時，乳化活性達(dá)到最高值，分別為30.20 m/g和30.24 m/g，在2 種溫度下后熟7 d時，穩(wěn)定性升高至51.77%和51.80%，至28 d均無顯著性差異。這可能歸因于后熟使其結(jié)構(gòu)松散，極性基團(tuán)的水合作用增加，親水性增加，而研究發(fā)現(xiàn)持油性降低，二者在后熟到一定時間時達(dá)到較好的平衡，使其乳化性達(dá)到最大值。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)表面疏水性較低的蛋白乳化性較差，研究后熟期間表面疏水性呈下降趨勢，這可能是14 d后乳化性降低的原因。

泡沫體系中，泡沫的聚合、失液和歧化等會導(dǎo)致其不穩(wěn)定，穩(wěn)定泡沫的形成需要蛋白質(zhì)在氣水界面形成一層具有相當(dāng)厚度黏性和彈性的薄膜，而薄膜的破裂會導(dǎo)致起泡的破裂，使其穩(wěn)定性降低。如圖8B所示，隨著后熟時間的延長，玉米醇溶蛋白的起泡能力整體呈先上升后下降的趨勢，泡沫穩(wěn)定性也有所提高。在15 ℃和25 ℃后熟14 d時，起泡能力及泡沫穩(wěn)定性均達(dá)到較高值，分別為60.67%、48.66%和59.00%、50.01%，這可能是由于玉米在后熟期間，蛋白的界面作用發(fā)生了改變。

3 結(jié) 論

玉米在溫度15 ℃和25 ℃、相對濕度55%條件下貯藏56 d，玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)有明顯變化，游離巰基的含量下降，二硫鍵的含量升高，表面疏水性降低、Zeta電位的絕對值增加，粒徑和多分散系數(shù)均降低。FTIR的結(jié)果表明后熟期間玉米醇溶蛋白內(nèi)部的氫鍵作用力降低，更多的β-折疊轉(zhuǎn)化為無規(guī)卷曲，這表明后熟增加了其結(jié)構(gòu)的無序性。DSC結(jié)果表明，玉米醇溶蛋白在玉米后熟期間的熱穩(wěn)定性降低，SDS-PAGE結(jié)果顯示在后熟期間α-玉米醇溶蛋白分子質(zhì)量有所降低。此外，通過測定其理化特性，發(fā)現(xiàn)后熟顯著改善了其溶解性和持水性，但降低了其持油性，其中溶解性于15 ℃后熟42 d和25 ℃后熟28 d時達(dá)到最高，持水性在15 ℃后熟42 d和25 ℃后熟28 d達(dá)到極值，持油性在2 種溫度條件下均呈下降趨勢，乳化活性、起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均在2 種溫度下后熟14 d達(dá)到較高水平后降低，乳化穩(wěn)定性在2 種溫度條件下后熟7 d達(dá)到較高水平。本研究結(jié)果有利于了解后熟過程中玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)與理化特性的構(gòu)效關(guān)系，通過對玉米后熟期的控制，可以潛在的調(diào)整玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)，從而改善其理化特性，為促進(jìn)玉米的精深加工及拓展玉米醇溶蛋白應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)。