基于1T-WS2@AuNPs復(fù)合材料的白蕓豆酯酶電化學(xué)生物傳感器構(gòu)建及其殺螟硫磷檢測(cè)應(yīng)用

田運(yùn)霞，吳遠(yuǎn)根，王 嘯，季 春，石啟麗，陶 菡,*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中使用最廣泛的農(nóng)藥，有機(jī)磷農(nóng)藥（organophosphorus pesticides，OPPs）在保護(hù)農(nóng)作物免受蟲害和提高農(nóng)作物產(chǎn)量方面發(fā)揮著重要作用。不幸的是，由于它在世界范圍內(nèi)的濫用，對(duì)水、土壤甚至農(nóng)產(chǎn)品造成了嚴(yán)重的污染。OPPs進(jìn)入人體內(nèi)會(huì)引起乙酰膽堿酯酶活性的不可逆抑制，進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂，甚至威脅生命。因此，開發(fā)一種靈敏、快速、可靠和經(jīng)濟(jì)的方法檢測(cè)OPPs相當(dāng)重要。但大多數(shù)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法是依賴于大型儀器的實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)，這些方法靈敏、準(zhǔn)確，可用于高通量檢測(cè)，但通常需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理步驟和較長(zhǎng)的分析時(shí)間，需要訓(xùn)練有素的操作員。更重要的是，這些儀器價(jià)格昂貴，攜帶不方便。這些缺點(diǎn)嚴(yán)重限制其廣泛應(yīng)用。相比之下，電化學(xué)傳感檢測(cè)技術(shù)具操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于OPPs殘留的簡(jiǎn)便快捷、靈敏可靠檢測(cè)。

酶抑制法具有檢測(cè)原理簡(jiǎn)單、無需大型儀器且易操作等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的OPPs快速檢測(cè)方法。應(yīng)用在農(nóng)藥殘留檢測(cè)的酶絕大部分是從動(dòng)物體內(nèi)分離純化得到的膽堿酯酶。膽堿酯酶提取步驟繁瑣、價(jià)格高昂，極大地增加了檢測(cè)成本。有研究發(fā)現(xiàn)，植物酯酶對(duì)OPPs具有與膽堿酯酶相似的敏感性，其酶活性也可被OPPs抑制，從而可應(yīng)用于酶抑制法農(nóng)藥殘留檢測(cè)。此外，植物酯酶廣泛存在于植物中，具有提取方法簡(jiǎn)單，成本低且易于保存的優(yōu)勢(shì)。因此，以植物酯酶替代膽堿酯酶進(jìn)行OPPs檢測(cè)具有可行性和良好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米材料因其獨(dú)特的光、電、催化等特性而被廣泛應(yīng)用于新型高效生物傳感器的開發(fā)。在眾多納米材料中，過渡金屬硫族化合物因其比表面積大、優(yōu)良的電導(dǎo)率和催化性能而受到人們廣泛關(guān)注和重視。二硫化鎢（WS）是一種典型的過渡金屬硫族化合物，具有不同電子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的兩相，分別是1T金屬相和2H半導(dǎo)體相。研究表明，1TWS具有更高的電導(dǎo)率、更強(qiáng)的電荷轉(zhuǎn)移能力和更高的催化活性位點(diǎn)密度，適合構(gòu)建酶基電化學(xué)生物傳感器。納米金（AuNPs）因其良好的生物相容性而被廣泛用于固定化生物分子以構(gòu)建生物傳感器，并且AuNPs可以促進(jìn)電子在電極表面和固定化生物分子活性位點(diǎn)之間的傳遞，通過信號(hào)放大提高生物傳感器的靈敏度。此外，AuNPs與1T-WS同時(shí)用于構(gòu)建傳感平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)信號(hào)的協(xié)同放大，進(jìn)一步提高傳感器的電化學(xué)性能。然而，目前鮮見利用1T-WS構(gòu)建植物酯酶基電化學(xué)傳感平臺(tái)的相關(guān)研究。

本研究構(gòu)建來源于白蕓豆的植物酯酶基電化學(xué)生物傳感器，利用1T-WS@AuNPs納米復(fù)合材料優(yōu)異的理化性能增敏傳感信號(hào)，并對(duì)其農(nóng)藥檢測(cè)性能和實(shí)際應(yīng)用性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。殺螟硫磷檢測(cè)原理如圖1所示，蕓豆酯酶（KbE）催化水解底物1-乙酸萘酯（1-naphthyl acetate，1-NA）產(chǎn)生電化學(xué)活性物質(zhì)1-萘酚，當(dāng)體系中存在農(nóng)藥殺螟硫磷時(shí)，KbE活性會(huì)被抑制，導(dǎo)致1-萘酚的產(chǎn)生減少，相應(yīng)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)也會(huì)降低，從而實(shí)現(xiàn)殺螟硫磷的定量檢測(cè)。

圖1 電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)原理示意圖Fig. 1 Schematic illustration of detection principle for the electrochemical biosensor

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蕓豆、白菜、油菜 貴陽花溪永輝超市；氯化鎢、硫代乙酰胺、,-二甲基甲酰胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨、氯金酸 上海阿拉丁試劑有限公司；殼聚糖（chitosan，CS）（純度90.0%） 北京索萊寶科技有限公司；1-NA、殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)品 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；AlO打磨粉 上海辰華有限公司。若無特殊說明，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（電阻率18 MΩ·cm），所用試劑均為分析純及以上。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；A-10超純水儀 美國(guó)Milipore公司；SB-5200 DTD超聲清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；S-3400N透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、SU8010掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；3K18離心機(jī)德國(guó)Sigma公司；ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）、DXRxi顯微拉曼成像光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 KbE的分離純化

參照Bao Jing和Yang Limin等的方法，白蕓豆洗凈晾干后粉碎，稱取適量白蕓豆粉，按照1∶5（g/mL）比例加入蒸餾水，攪拌30 min，4 ℃浸提過夜，5 000 r/min離心10 min取上清液，即得到KbE粗酶液。采用兩步雙水相萃取法對(duì)KbE粗酶液進(jìn)行純化，在聚乙二醇（PEG 1000）與NaHPO組成的雙水相體系中萃取2～3 h后，棄下相，加入(NH)SO進(jìn)行第二步萃取，2～3 h后收集下相進(jìn)行透析處理，最后冷凍干燥得到KbE粉末。

1.3.2 AuNPs的制備

參照Das等的方法并稍作修改。將100 mL超純水加熱至沸騰，在劇烈攪拌下迅速加入1 000 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液、800 μL 0.5 mol/L NaOH溶液和400 μL 10 mg/mL的HAuCl溶液。并在劇烈攪拌下持續(xù)加熱，直至溶液顏色變成酒紅色并不再改變，停止加熱，繼續(xù)攪拌直至溶液冷卻至室溫。將所得AuNPs溶液裝于棕色試劑瓶中，置于4 ℃冰箱保存。

1.3.3 水熱法制備1T-WS

將0.793 2 g的氯化鎢和1.502 6 g硫代乙酰胺溶于60 mL,-二甲基甲酰胺，攪拌溶解1 h，超聲溶解1 h。將上述溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，200 ℃高溫下反應(yīng)24 h。反應(yīng)終止后冷卻至室溫，用無水乙醇和超純水多次洗滌黑色產(chǎn)物，5 000 r/min離心10 min后收集產(chǎn)物，將產(chǎn)物在真空下50 ℃干燥12 h，得到1T-WS納米片。

1.3.4 1T-WS@AuNPs納米復(fù)合物的制備

稱取適量1T-WS納米片分散于超純水中，超聲分散30 min，得到1 mg/mL 1T-WS分散液。將1T-WS分散液與AuNPs溶液按一定體積比混合，超聲分散使其充分混勻，得到1T-WS@AuNP納米復(fù)合物的分散液。

1.3.5 納米材料的表征

在最優(yōu)制備條件下，對(duì)1T-WS@AuNPs納米復(fù)合物及1T-WS納米片進(jìn)行表征。用SEM和TEM表征樣品的微觀形貌和結(jié)構(gòu)，圖像采集的加速電壓為10 kV和200 kV。用XPS確定樣品的元素組成、元素的化學(xué)價(jià)態(tài)以及相的構(gòu)成，以Al靶（1 486.6 eV）作為激發(fā)光源。用拉曼光譜對(duì)樣品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm。

1.3.6 修飾電極的制備

對(duì)玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）進(jìn)行預(yù)處理，在含有AlO料漿的拋光絨布上打磨數(shù)次，依次在丙酮、無水乙醇和超純水中進(jìn)行超聲清洗，活化后備用。采用滴涂法制備CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極，在潔凈的GCE表面滴涂一定體積的1T-WS@AuNP納米復(fù)合物分散液，在紅外燈下烘干后，滴加一定體積的KbE，室溫干燥后在其表面均勻覆蓋一層質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的CS，干燥后得到CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極。其他修飾電極按照類似方法進(jìn)行制備，所有酶電極于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 修飾電極電化學(xué)特性測(cè)定

以GCE為工作電極，鉑絲電極和Ag/AgCl電極分別為對(duì)電極和參比電極，在CHI660E電化學(xué)工作站上完成電化學(xué)測(cè)試。采用循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）和電化學(xué)交流阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）分別對(duì)經(jīng)最優(yōu)制備條件得到的裸電極（GCE）、1T-WS/GCE、1T-WS@AuNPs/GCE和CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極進(jìn)行測(cè)定，以表征傳感器組裝過程。5 mmol/L K[Fe(CN)]/K[Fe(CN)]（1∶1，/）為電解質(zhì)溶液，CV測(cè)試電壓范圍為-0.4～0.5 V，掃描速率100 mV/s；EIS測(cè)試采用相同的電解質(zhì)溶液，頻率范圍為1～100 kHz，振幅5 mV。

1.3.8 修飾電極的催化性能測(cè)定

將三電極系統(tǒng)浸入含5 mmol/L 1-NA的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液反應(yīng)體系中，采用方波伏安法（square wave voltammetry，SWV）在最優(yōu)條件下測(cè)定CS/KbE/GCE、CS/KbE/AuNPs/GCE、CS/KbE/1T-WS/GCE、CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE對(duì)1-萘酚的響應(yīng)電流值。SWV測(cè)試電壓范圍為-0.1～0.6 V，振幅25 mV，頻率為15 Hz。

1.3.9 CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極制備及測(cè)試條件的優(yōu)化

采用SWV分別考察磷酸鹽緩沖液pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、1T-WS與AuNPs體積比（0∶1、1∶0、1∶1、2∶1、3∶1）、1T-WS@AuNPs負(fù)載體積（6～18 μL）、KbE負(fù)載量（0.032～0.23 U）以及農(nóng)藥抑制時(shí)間（5～25 min）對(duì)響應(yīng)電流的影響，優(yōu)化電極制備參數(shù)。

1.3.10 CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極的重復(fù)性、穩(wěn)定性及抗干擾性測(cè)試

在最優(yōu)制備條件下，同一批制備5 支修飾電極，并在最優(yōu)測(cè)試條件下分別對(duì)同濃度1-NA（5 mmol/L）進(jìn)行SWV測(cè)試。

1.3.11 殺螟硫磷的檢測(cè)

在最佳條件下，將所構(gòu)建CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE用于殺螟硫磷的檢測(cè)。將CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE浸入含一定濃度底物（1-NA）的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行SWV掃描，得到電流響應(yīng)。電極清洗后，將電極浸入不同濃度的殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)液中孵化15 min，再次將其浸入含同濃度底物（1-NA）的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行SWV掃描得到電流響應(yīng)。

根據(jù)下式計(jì)算農(nóng)藥對(duì)酶的抑制率：

式中：為初始電流值；為農(nóng)藥抑制后電流值。

根據(jù)酶抑制率與殺螟硫磷質(zhì)量濃度呈正比的線性關(guān)系，以峰電流值為縱坐標(biāo)、殺螟硫磷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中殺螟硫磷質(zhì)量濃度設(shè)置為0.1、1、10 100、200、500、1 000、2 000 μg/L。

1.3.12 CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極的實(shí)際樣品及回收率測(cè)試

根據(jù)Kumar等的方法稍作修改，將油菜和白菜清洗凈晾干后，切碎備用。取2 g油菜樣品或白菜樣品于10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，攪拌10 min混勻，8 000 r/min離心10 min，收集上清液備用。

在上清液中分別添加不同質(zhì)量濃度的殺螟硫磷（5、100、1 000 μg/L）進(jìn)行實(shí)際樣品分析，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次?；谒鶚?gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)際樣品體系中的殺螟硫磷含量，考察檢測(cè)體系對(duì)實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Excel統(tǒng)計(jì)并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米材料的表征分析

由圖2A可知，1T-WS呈片狀，并且1T-WS納米片組成了具有大量孔隙的空間結(jié)構(gòu)且結(jié)構(gòu)分布均一。這些空隙一方面能夠增加1T-WS的比表面積，為酶的附著提供更多位點(diǎn)；另一方面也為酶促反應(yīng)提供了足夠的反應(yīng)環(huán)境，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。圖2B表明，AuNPs是均勻的球形顆粒，平均粒徑為13.5 nm，且較為均勻地附著在1T-WS的片狀表面。

由圖2C可知，1T-WS納米片中含有鎢、硫、氮等元素。從圖2D可知，與2H-WS相比（軟件擬合所得），1T-WS對(duì)應(yīng)的峰向低結(jié)合能處偏移了約0.5 eV。同樣，硫元素2p高分辨率譜圖（圖2E）也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，以上峰結(jié)合能的變化與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明本實(shí)驗(yàn)制備的1T-WS納米片中，1T相占主導(dǎo)地位。為進(jìn)一步確定1T相的存在，采用拉曼光譜對(duì)1T-WS納米片的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。如圖2F所示，在347 cm和411 cm處有兩個(gè)明顯的特征峰，分別對(duì)應(yīng)于WS中面內(nèi)（E）和層間（A）兩種分子振動(dòng)模式。此外，在低頻區(qū)域出現(xiàn)了幾個(gè)新的峰，這文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明1T-WS制備成功，這與XPS的表征結(jié)果也相對(duì)應(yīng)。

圖2 1T-WS2及1T-WS2@AuNPs納米材料的表征Fig. 2 Characterization of 1T-WS2 and 1T-WS2@AuNPs nanomaterials

2.2 不同修飾電極的電化學(xué)特性分析

如圖3A所示，4 種電極均出現(xiàn)一對(duì)氧化還原峰。與裸電極相比，1T-WS/GCE修飾電極上的氧化和還原峰電流明顯增大；同時(shí)，峰電位差從裸電極的173 mV減小到138 mV，這歸因于1T-WS的高導(dǎo)電性。與AuNPs復(fù)合后，F(xiàn)e/Fe電對(duì)的氧化和還原電流值進(jìn)一步增大且峰電位差減小至103 mV，表明1T-WS@AuNPs修飾電極具有更優(yōu)異的電化學(xué)性能，這與AuNPs良好的導(dǎo)電性有關(guān)；因此將AuNPs引入1T-WS可以進(jìn)一步提高電極的導(dǎo)電性，從而加速電子的傳遞。由于KbE和CS為不導(dǎo)電的生物分子，阻礙了電子的傳遞，所以觀察到CS/KbE/1TWS@AuNPs/GCE修飾電極上的氧化還原電流下降且峰電位差增加。

進(jìn)一步研究不同修飾電極的電化學(xué)特性，如圖3B所示，每條曲線都是由高頻區(qū)的一個(gè)半圓與低頻區(qū)的一條直線組成，其中高頻區(qū)的半圓直徑大小反映了電極的電荷轉(zhuǎn)移電阻大小。1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極的半圓直徑最小，即電荷轉(zhuǎn)移電阻最小，表明1T-WS@AuNPs具有優(yōu)異的電子轉(zhuǎn)移能力。隨著KbE和CS的進(jìn)一步修飾固定，半圓直徑明顯增大，CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE的電子轉(zhuǎn)移能力最差。上述結(jié)果與CV測(cè)試結(jié)果一致，同時(shí)表明CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE生物傳感器被成功構(gòu)建。

圖3 不同修飾電極的CV圖（A）及EIS圖（B）Fig. 3 CV curves (A) and Nyquist plots (B) of different modified electrodes

2.3 不同修飾電極的催化性能分析

由圖4可知，在不含1-NA的磷酸鹽緩沖液中，CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極的SWV曲線平滑，無峰電流響應(yīng)產(chǎn)生；加入1-NA后，出現(xiàn)一個(gè)明顯的氧化峰，說明此峰是由KbE水解1-NA生成的1-萘酚在電極上被電化學(xué)氧化而產(chǎn)生。以上結(jié)果表明KbE被成功固定在電極上并保持其生物活性。此外，相比于CS/KbE/GCE電極，CS/KbE/1T-WS/GCE、CS/KbE/AuNPs/GCE、CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極上所產(chǎn)生的氧化峰電流增大且出峰電位減小。結(jié)果表明1T-WS@AuNPs良好的導(dǎo)電性和協(xié)同電催化效應(yīng)有效促進(jìn)電子的傳遞，從而增強(qiáng)1-萘酚的氧化電流信號(hào)，該信號(hào)的增強(qiáng)有助于提高傳感器的響應(yīng)靈敏度。

圖4 不同修飾電極的SWV響應(yīng)曲線圖Fig. 4 SWV response curves of different modified electrodes

2.4 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE修飾電極制備及測(cè)試條件優(yōu)化

2.4.1 底液pH值的影響

如圖5A所示，隨著pH值的增大，電流響應(yīng)先增大后減小，在pH 7.0處具有最高電流響應(yīng)。因此pH 7.0為最優(yōu)pH值，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液。

圖5 不同制備條件及測(cè)試條件對(duì)SWV響應(yīng)電流及抑制率的影響Fig. 5 Effects of different preparation and test conditions on SWV response current and inhibition rate

2.4.2 1T-WS與AuNPs體積比和1T-WS@AuNPs負(fù)載體積的影響

電極修飾材料的組成會(huì)影響生物傳感器的電化學(xué)性能。如圖5B所示，1T-WS與AuNPs的最佳體積比為1∶1。適量的納米材料修飾到電極上可以增大電極的比表面積，促進(jìn)電極與電活性物質(zhì)之間的電子轉(zhuǎn)移。如圖5C所示，當(dāng)1T-WS@AuNPs負(fù)載體積從6 μL增加到12 μL，峰電流隨負(fù)載體積增加而增大，于12 μL時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)負(fù)載體積進(jìn)一步增加，峰電流值逐漸下降，這可能因?yàn)檫^厚的膜會(huì)阻礙電子傳遞。因此，選擇12 μL作為1T-WS@AuNPs納米復(fù)合物的最佳負(fù)載體積。

2.4.3 負(fù)載的KbE酶活力的影響

作為傳感器的生物識(shí)別元件，負(fù)載的KbE酶活力對(duì)響應(yīng)信號(hào)的影響較大。如圖5D所示，隨著負(fù)載的KbE酶活力的增加，傳感器的響應(yīng)電流值變大，在0.13 U時(shí)達(dá)到最大值；繼續(xù)增加負(fù)載的KbE酶活力，峰電流值略有下降，這是因?yàn)镵bE是蛋白酶，導(dǎo)電性很差，過量的酶會(huì)阻礙電子在傳感器表面的傳遞。因此，0.13 U為負(fù)載的最佳酶活力。

2.4.4 農(nóng)藥抑制時(shí)間的影響

農(nóng)藥抑制時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。從圖5E可以看出，隨抑制時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性下降越多，導(dǎo)致生成的1-萘酚越少，抑制率上升；當(dāng)抑制時(shí)間超過15 min時(shí)，由于酶活性位點(diǎn)與農(nóng)藥的飽和結(jié)合，酶的抑制程度也趨于穩(wěn)定。因此，以15 min作為最佳抑制時(shí)間。

2.5 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器殺螟硫磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6A表明CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE傳感器的峰電流值整體隨著殺螟硫磷質(zhì)量濃度的增加而減小，農(nóng)藥對(duì)酶活性的抑制逐漸增強(qiáng)。由圖6B可知，在0.1～2 000 μg/L范圍內(nèi)，抑制率與殺螟硫磷質(zhì)量濃度（lg）呈良好的線性關(guān)系，其線性標(biāo)準(zhǔn)方程為＝14.82lg+24.18，相關(guān)系數(shù)（）為0.992，檢出限為0.04 μg/L（信噪比為3）。將CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE傳感器與已報(bào)道的其他檢測(cè)方法進(jìn)行比較（表1），結(jié)果表明本研究構(gòu)建的傳感器具有較寬的線性區(qū)間和檢出限；此外，還具有制備簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。說明將植物酯酶替代來源于動(dòng)物的膽堿酯酶進(jìn)行農(nóng)藥的高效檢測(cè)切實(shí)可行，具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的價(jià)值。

圖6 不同質(zhì)量濃度殺螟硫磷抑制后的SWV曲線圖（A）及殺螟硫磷質(zhì)量濃度與抑制率的線性關(guān)系圖（B）Fig. 6 SWV curves in the presence of different concentrations of fenitrothion (A), and linear relationship between KbE inhibition rate and fenitrothion concentration (B)

表1 殺螟硫磷檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of different methods for fenitrothion detection

2.6 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器重復(fù)性、穩(wěn)定性和抗干擾能力分析

同一批制備5 支修飾電極，分別對(duì)同濃度1-NA進(jìn)行SWV測(cè)試，峰電流值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.83%。在相同測(cè)試條件下，對(duì)同一支修飾電極進(jìn)行連續(xù)5 次SWV測(cè)試，峰電流值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.96%。不用時(shí)將傳感器置于4 ℃冰箱貯存，分別測(cè)試貯存15 d和30 d的SWV響應(yīng)，電流響應(yīng)下降為初始電流的95.9%和80.9%。結(jié)果表明所制備的CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE傳感器具有良好的重復(fù)性和貯存穩(wěn)定性。

圖7 各干擾物對(duì)CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響Fig. 7 Effects of interfering substances on the response signal of CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE sensor

2.7 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器在實(shí)際樣品中應(yīng)用分析

為了評(píng)估所建CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE傳感器在實(shí)際樣品中的應(yīng)用，將其用于白菜、油菜的加標(biāo)回收檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次。如表2所示，回收率為96.16%～109.60%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，表明該生物傳感器具有良好的實(shí)用性，有望應(yīng)用于實(shí)際樣品中OPPs的檢測(cè)。

表2 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器在實(shí)際樣品中殺螟硫磷檢測(cè)Table 2 Rsults of fenitrothion detection in real samples with CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE sensor

3 結(jié) 論

制備了具有良好電催化活性的1T-WS@AuNPs納米復(fù)合物，并以KbE代替乙酰膽堿酯酶構(gòu)建新型電化學(xué)生物傳感器，將其用于殺螟硫磷的簡(jiǎn)便、高效檢測(cè)。SEM和TEM表征結(jié)果表明1T-WS@AuNPs納米復(fù)合物具有大比表面積，可為酶的負(fù)載提供良好的微環(huán)境，同時(shí)電化學(xué)表征表明1T-WS@AuNPs具有良好的導(dǎo)電性和協(xié)同電催化效應(yīng)可以有效促進(jìn)電子的傳遞，提高傳感器的響應(yīng)靈敏度。與傳統(tǒng)分析方法相比，該電化學(xué)傳感器成本低、制備簡(jiǎn)單、靈敏度高，在OPPs檢測(cè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，并為植物酯酶在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用提供一定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。