高靈敏度磁熒光免疫層析試紙模式構建及在嘔吐毒素檢測中的應用

孫亞寧，楊蘇珍，楊繼飛，胡驍飛，陳鑫鑫，張穎碩，鄧瑞廣，張改平,2,*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450002）

嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON），又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，主要由曲霉、青霉及鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族真菌毒素，在谷物、谷物制備及動物飼料中廣泛存在。DON具有胃腸毒性、細胞毒性、免疫毒性等，且與其他真菌毒素具有協(xié)同毒性，嚴重危害動物和人類身體健康。GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中對谷物及其制品中DON的允許限量為不高于1 000 μg/kg?？刂艱ON危害的最有效手段是能快速、準確地檢測DON污染。DON常用的檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、表面增強拉曼光譜法、電化學法傳感器法及免疫學檢測方法等。

免疫層析法由于具有快速、靈敏、特異、穩(wěn)定、成本低，特別是操作簡單等特點，已經(jīng)普遍應用于真菌毒素的快速檢測。Kong Dezhao等建立了DON膠體金免疫層析試紙，在谷物及飼料中的檢出限為50～750 μg/kg。由于傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙靈敏度已經(jīng)不能滿足檢測的需要，越來越多的新型標記材料（特別是熒光納米材料）逐漸應用于免疫層析試紙中提高檢測靈敏度。Huang Xinyu等研制了一種基于花狀金納米顆粒的免疫層析試紙條，同時檢測中藥中伏馬菌素B（fumonisin B，F(xiàn)B）和DON，檢測靈敏度為50 μg/kg。Jin Yongpeng等建立了基于近紅外熒光染料800CW和680LT的免疫層析試紙，同時檢測玉米中的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和DON，檢出限分別為0.55 μg/kg和3.8 μg/kg。Goryacheva等建立了一種基于硅烷化量子點免疫層析試紙，同時檢測谷物中的ZEN和DON，檢出限分別為40 μg/kg和400 μg/kg。Dong Haowei等建立了基于聚苯乙烯熒光微球標記的免疫層析試紙，檢測范圍為1～100 ng/mL，在玉米和飼料中的檢出限分別為0.206 ng/mL和0.216 ng/mL。提高檢測靈敏度的另一個方向是利用磁性納米材料實現(xiàn)樣品中靶標物的富集。Han Qiqi等基于金屬-有機框架的多靶點免疫磁珠實現(xiàn)了食品中DON、ZEN、T-2毒素的富集。Zhuo Siqi等利用磁性光子晶體微球?qū)崿F(xiàn)樣品中DON的富集，但是磁顆粒對樣品富集后通常需要復雜的洗脫過程才能用于檢測。

磁熒光納米復合材料即具有磁性可以富集待測物又同時具有熒光特性實現(xiàn)信號放大，已廣泛應用于生物傳感、藥物輸送、臨床呈像等領域，而在免疫檢測領域還處于起步階段。目前鮮見磁熒光免疫層析試紙在真菌毒素檢測方面的報道。由于磁性納米顆粒與熒光微球結合后會造成熒光微球的猝滅，目前磁熒光納米顆粒需要復雜的制備過程，不利于廣泛應用。

本研究利用磁性納米顆粒和綠色熒光蛋白及DON單克隆抗體一步法制備磁性熒光抗體探針，建立DON磁熒光免疫層析試紙，并將其應用于谷物中DON污染物的檢測中；同時建立DON膠體金免疫層析試紙，對比兩種方法的靈敏度，判定新模式的有效性。本研究采用一步法制備磁性熒光抗體探針應用于的免疫層析檢測技術中，同步實現(xiàn)樣品的富集及熒光信號的檢測，從而提高檢測靈敏度，促進磁熒光納米顆粒在免疫檢測領域的廣泛應用，為更靈敏的免疫層析檢測方法提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DON 青島普瑞邦生物工程有限公司；檸檬酸三鈉、綠色熒光蛋白 北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA） 英國BDH公司；黃曲霉毒素B（aflatoxin B，AFB）、ZEN、赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）、FB、T-2、三氯化鐵、葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）美國Sigma公司；Tween-20 德國Merck公司；硝酸纖維素膜（NC膜，HF13502S25，（30×2.5）cm）、玻璃纖維棉、吸水紙、支撐底板 德國Millipore公司；DON單克隆抗體由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室自制；實驗用超純水由實驗室自制；氫氧化鈉等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AE260電子天平 德國Mettler公司；JEM-1400透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；4-16K離心機德國Sigma公司；ESE-Quant FLUO熒光讀條儀 德國QIAGEN公司；RH Digital KT/C磁力攪拌器 德國IKA公司；Zetasizer Nano ZS90型動態(tài)散射粒度分析儀 英國Malvern公司；SpectraMax i3x多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；XYZ-3000型噴膜噴金儀、CM-4000型斬切機、TSR3000讀條儀 美國Bio-Dot公司；電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；ZHS-SP低露點轉(zhuǎn)輪除濕機 無錫奧波公司。

1.3 方法

1.3.1 羧基修飾的超順磁納米顆粒的制備及表征

采用溶劑熱法制備粒徑為100～300 nm的超順磁顆粒。稱取3 組三氯化鐵（0.675、0.675、0.844 g）及檸檬酸鈉（0.324、0.245、0.245 g），分別加入20 mL乙二醇中，于加熱磁力攪拌器上，90 ℃加熱攪拌至溶解，再分別加入1.2 g醋酸鈉，繼續(xù)加熱攪拌至完全溶解，然后將得到棕色溶液轉(zhuǎn)移至100 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應釜中，200 ℃烘箱加熱10 h，自然冷卻后產(chǎn)物呈黑褐色，用無水乙醇、乙醇-超純水（1∶1，/）、超純水清洗3 次，超純水定容至20 mL，分裝2 mL/瓶，冷凍干燥密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選用Zetasizer Nano ZS90型動態(tài)散射粒度分析儀分析及透射電子顯微鏡進行表征。利用強力磁鐵鑒定超順磁顆粒的磁性：取1 mL磁顆粒于玻璃瓶中，放于強力磁鐵上觀察磁顆粒吸附情況。

1.3.2 一步法制備DON磁熒光抗體探針

選用活潑酯法將羧基磁顆粒與綠色熒光蛋白及DON單抗進行一步法偶聯(lián)制備磁熒光抗體探針。取2號磁顆粒200 μL加入20 μL EDC（1 mg/mL）及40 μL NHS（1 mg/mL）室溫避光攪拌反應3 h為A液。取CBS 200 μL加入綠色熒光蛋白2.5 μg、DON單抗2.5 μg，室溫避光攪拌反應1 h，在強力磁鐵吸附下分離磁顆粒，去上清液，200 μL重懸液（0.02 mol/L的NaBO·10HO溶液含1% BSA、3%海藻糖、0.05%疊氮鈉）重懸得到磁熒光抗體探針。偶聯(lián)過程中優(yōu)化了綠色熒光蛋白及DON單克隆抗體的加入量，綠色熒光蛋白與DON單克隆抗體按1∶1加入，200 μL磁顆粒中蛋白加入量分別為5 μg（2.5 μg+2.5 μg）、2.5 μg（1.25 μg+1.25 μg）、1.25 μg（0.625 μg+0.625 μg）、0.625 μg（0.313 μg+0.313 μg），偶聯(lián)結束后用強力磁鐵吸附磁顆粒，多功能酶標儀分別檢測偶聯(lián)后上清液與偶聯(lián)前的蛋白溶液中熒光信號（激發(fā)波長430 nm、發(fā)射波長510 nm），確定較優(yōu)蛋白加入量。用強力磁鐵檢測磁熒光抗體探針的磁性；將磁熒光抗體探針加于重懸液中用NC膜上包被有SPA的試紙進行檢測，目察SPA攔截探針情況，從而判斷磁珠與抗體偶聯(lián)是否成功；然后通過熒光讀條儀掃描試紙熒光信號，鑒定探針熒光性能。

1.3.3 DON膠體金標記抗體探針制備

為驗證磁熒光免疫層析試紙的有效性，利用相同的免疫學試劑建立膠體金免疫層析試紙。

1.3.3.1 膠體金制備

以檸檬酸三鈉為還原劑制備膠體金。取100 mL 超純水加入三角瓶中，于加熱磁力攪拌器上加熱，加入1 mL 1%氯金酸溶液加熱至沸騰，然后攪拌狀態(tài)下迅速加入1.6 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色經(jīng)過透明-黑色-深紅色-酒紅色變化，待顏色不再變化時再加熱5 min，室溫冷卻后，用超純水將膠體金定容至100 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 膠體金標記單克隆抗體

取DON單克隆抗體用超純水稀釋為2 mg/mL備用。取稀釋杯6 孔，分別加入10 μL超純水鋪底，于第一孔中加入稀釋好的單克隆抗體10 μL，倍比稀釋至最后一孔。取膠體金用0.2 mol/L的KCO溶液調(diào)節(jié)pH值為8.2，然后加入上述稀釋杯中，125 μL/孔，反應5 min，加入125 μL/孔10% NaCl，觀察膠體金顏色變化，選擇能保持膠體金顏色不變的最低抗體濃度為抗體標記濃度。

取10 mL膠體金0.2 mol/L的KCO溶液調(diào)節(jié)pH值為8.2。將DON單克隆抗體，用超純水稀釋為1 mg/mL，取60 μL緩慢加入到調(diào)好pH值的膠體金中，邊加邊攪拌，然后室溫反應70 min，然后再加入1 mL 10% BSA溶液，室溫封閉10 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清液，沉淀用4 mL重懸液重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 DON免疫層析試紙的組裝

1.3.4.1 免疫層析試紙各組分的制備

取NC膜分別在檢測線（T線）及質(zhì)控線（C線）位置，用XYZ-3000型噴膜噴金儀按0.9 μL/cm的量噴涂0.2 mg/mL DON-BSA及0.2 mg/mL的SPA，42 ℃干燥1 h，避光密封備用。

結合墊制備：將0.02 mol/L的NaBO·10HO溶液（含5% BSA、0.1% PVP-10、0.1% Triton X-100、0.05%疊氮鈉），用XYZ-3000型噴膜噴金儀按8 μL/cm的量噴涂在玻璃纖維棉（8 mm×30 mm）上，42 ℃干燥50 min制備結合墊。將膠體金標記DON單克隆抗體用XYZ-3000型噴膜噴金儀按6.5 μL/cm的量噴涂在結合墊上，42 ℃干燥50 min制備膠金墊，避光密封備用。

樣品墊制備：將玻璃纖維棉（16 mm×30 mm）浸泡于0.1 mol/L的PB溶液（pH 7.4，含1% BSA、0.3%Tween 20、5%海藻糖、0.05%疊氮鈉）中5 min后取出平鋪于干燥箱內(nèi)，42 ℃干燥4 h制備樣品墊。

1.3.4.2 試紙組裝

DON膠體金免疫層析試紙組裝：取制備好的NC膜、膠金墊、樣品墊及吸水紙依次粘貼于支撐底板上，各組分間重疊1～2 mm，用切割機切成3.0 mm的試紙加干燥劑密封保存。

DON磁熒光免疫層析試紙組裝：取制備好的NC膜、結合墊、樣品墊及吸水紙依次粘貼于支撐底板上，各組分間重疊1～2 mm，用切割機切成3.0 mm的試紙加干燥劑密封保存，搭配DON磁熒光抗體探針使用。

1.3.5 試紙的檢測方法

DON膠體金免疫層析試紙的檢測方法：取100 μL樣品于反應杯中，插入膠體金免疫層析試紙檢測，10 min后觀察結果。

DON磁熒光免疫層析試紙的檢測方法：取300 μL樣品于反應杯中，然后加入1 μL磁熒光抗體探針，孵育10 min后，用強力磁鐵分離，100 μL重懸液重懸后插入磁熒光免疫層析試紙檢測，10 min后觀察結果。

1.3.6 試紙靈敏度檢測

用重懸液配制DON質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、125、62.5 ng/mL及40、20、10、5、2.5 ng/mL的標準品溶液用于檢測試紙敏感性，膠體金免疫層析試紙通過裸眼及TSR3000讀條儀判定結果；磁熒光免疫層析試紙通過熒光讀條儀判定結果，兩種試紙條均根據(jù)掃描峰面積，繪制標準曲線進行定量檢測，計算50%抑制濃度（IC）衡量其靈敏度，以10%抑制濃度為試紙條的檢出限。

1.3.7 試紙?zhí)禺愋詸z測

選取常見真菌毒素AFB、OTA、ZEN、FB、T-2作為交叉反應靶標物，各靶標物用甲醇配制成1 mg/mL母液，用相應稀釋液稀釋為10 μg/mL。分別用膠體金免疫層析試紙及磁熒光免疫層析試紙檢測，確定試紙的交叉反應率，評價試紙?zhí)禺愋浴?/p>

1.3.8 DON磁熒光試紙熒光信號穩(wěn)定性檢測

用磁熒光試紙檢測重懸液，10 min后通過熒光讀條儀讀取試紙T線熒光信號，每隔5 min讀取1 次，至反應40 min，通過峰面積分析熒光信號的穩(wěn)定性。

1.3.9 加標樣品檢測

選用PBS配制DON標準溶液100 μg/mL，取陰性小麥樣品5 份，粉碎后加入DON標準品，配制DON含量為1 000 μg/kg的小麥陽性樣品（國標限量）。小麥陽性樣品各取1 g/份于5 mL離心管中，加入2 mL PBS充分振蕩提取15 min，10 000 r/min離心3 min，上清液稀釋后用于DON磁熒光試紙檢測，每份樣品重復檢測3 次求取平均值計算小麥樣品中所含DON質(zhì)量濃度，計算添加回收率及變異系數(shù)，評價DON磁熒光免疫層析試紙的準確性及精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

從檢測儀器中導出數(shù)據(jù)及圖片，采用Excel進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 超順磁顆粒的表征

分別調(diào)整反應體系中三氯化鐵及檸檬酸鈉使用量，改變磁性顆粒的粒徑，結果見表1，保持整個體系其他成分不變時，磁顆粒粒徑隨著反應體系中三氯化鐵所占比例增加磁顆粒的粒徑增大。磁顆粒分布見圖1，結合圖1及表1結果顯示，1號磁顆粒的分布峰更窄，標準偏差更小，從而說明1號磁顆粒徑均一性更好。對1號磁性顆粒進行透射電鏡掃描結果見圖2，結果顯示磁納米顆粒呈現(xiàn)規(guī)則的球體。磁力鑒定實驗結果顯示：在外加磁場作用下，磁顆?？稍? min內(nèi)被完全吸附于瓶底，說明制備的磁顆粒具有較好的磁性，可以用于后期靶標物的富集檢測。

表1 磁性顆粒粒徑變化規(guī)律Table 1 Particle size variation of magnetic microspheres

圖1 超順磁納米顆粒的粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of superparamagnetic nanospheres

圖2 1號超順磁顆粒的透射電子顯微鏡掃描圖Fig. 2 TEM image of superparamagnetic microspheres

2.2 DON磁熒光抗體探針鑒定及優(yōu)化

磁熒光抗體探針的磁性鑒定結果見圖3A，結果顯示在外加磁場作用下磁顆粒在1 min內(nèi)可以完全被吸附于反應杯底部，說明探針具有很好的磁性；探針免疫學及熒光性能鑒定結果見圖3B及3C，結果顯示磁熒光抗體探針可以被NC膜上固定的SPA攔截，說明磁顆粒與DON單克隆抗體偶聯(lián)成功，且具有很好的活性；磁熒光抗體探針的熒光特性鑒定結果見圖3C，將圖3B中試紙用熒光讀條儀掃描，結果顯示，在SPA攔截線位置有較強的熒光信號。綜上所述本實驗通過一步法偶聯(lián)的DON磁熒光抗體探針制備成功。

圖3 DON磁熒光抗體探針的鑒定Fig. 3 Identification of DON magnetic fluorescent antibody probe

DON磁熒光抗體探針制備過程中優(yōu)化了綠色熒光蛋白及DON單克隆抗體的加入量，結果見圖4。當200 μL磁珠中加入蛋白量低于1.25 μg時，磁吸附上清液中熒光信號完全消失（吸附接近100%），隨著蛋白量的增加，磁珠吸附熒光值快速增加，吸附比逐漸下降。當?shù)鞍准尤肓窟_到5 μg時，吸附比僅為40.87%，有超過一半的熒光信號殘留于上清液中，說明蛋白加入已經(jīng)過量，但5 μg時吸附熒光值遠大于2.5 μg時，因此確定每200 μL磁珠中加入5 μg蛋白為較優(yōu)蛋白量。

圖4 DON磁熒光抗體探針標記蛋白加入量優(yōu)化Fig. 4 Optimization of protein concentrations for DON magnetic fluorescent antibody probe

2.3 試紙靈敏度的檢測

DON磁熒光免疫層析試紙裸眼觀測結果見圖5A，用熒光讀條儀掃描獲得熒光曲線見圖5B，利用峰面積值繪制標準曲線，回歸方程為-0.562+0.921，=0.990，經(jīng)計算試紙定量的IC為5.611 ng/mL，檢出限為1.089 ng/mL；DON膠體金免疫層析試紙靈敏度的結果見圖6，裸眼檢測靈敏度為500 ng/mL（圖6A）；利用讀條儀掃描灰度曲線為圖6B，根據(jù)峰面積繪制標準曲線，回歸方程為-0.543+1.485，=0.991，經(jīng)計算試紙定量的IC為65.16 ng/mL，檢出限為11.94 ng/mL。比較兩種方法的IC，結果顯示DON磁熒光免疫層析試紙是膠體金免疫層析試紙靈敏度的10.96 倍。

圖5 磁熒光免疫層析試紙靈敏度Fig. 5 Sensitivity of magnetic fluorescent immunochromatographic test strip

圖6 DON膠體金免疫層析試紙靈敏度Fig. 6 Sensitivity of colloidal gold immunochromatographic test strip

2.4 試紙?zhí)禺愋缘臋z測

表2 DON免疫層析試紙?zhí)禺愋澡b定結果Table 2 Specificity identification of test strips

表2顯示：DON膠體金免疫層析試紙與常見真菌毒素AFB、OTA、ZEN、FB、T-2交叉反應率低于0.65%，DON磁熒光免疫層析試紙與常見真菌毒素AFB、OTA、ZEN、FB、T-2交叉反應率低于0.06%，說明本實驗建立的兩種DON免疫層析試紙具有很好的特異性。

2.5 DON磁熒光試紙熒光信號穩(wěn)定性檢測

由于DON磁熒光免疫層析試紙跑板需要8～10 min，為了在干凈的背景下觀測熒光信號，因此選擇10 min后進行磁熒光信號穩(wěn)定性檢測，結果見圖7，熒光信號隨著時間的延長呈明顯下降的趨勢。因此應嚴格控制試紙結果判定時間，在試紙檢測10 min左右讀取結果。

圖7 磁熒光試紙熒光信號穩(wěn)定性Fig. 7 Stability of fluorescence signal of magnetic fluorescent test strip

2.6 DON磁熒光試紙加標回收實驗

檢測DON加標陽性小麥樣品5 份，實驗結果見表3。添加回收率在81.447%～98.558%之間，平均值為87.378%；變異系數(shù)在14.462%～19.662%之間，平均值為17.351%，均小于20%，說明該檢測方法具有很好的準確性和精密度。

表3 加標回收實驗結果（n=3）Table 3 Recoveries of magnetic fluorescent immunochromatographic test strip for DON in spiked wheat samples (n = 3)

3 討 論

盡管熒光免疫層析試紙快速檢測技術、免疫磁珠分離技術和磁性熒光復合材料制備技術已經(jīng)非常成熟且被廣泛應用，但綜合以上技術的磁熒光免疫層析檢測還鮮有報道，本研究將超順磁顆粒與綠色熒光蛋白偶聯(lián)制備磁性熒光納米復合材料作為標記物應用于免疫層析試紙中，構建磁熒光免疫層析試紙技術模式，該模式兼具了免疫反應的特異性、磁顆粒的富集作用及熒光信號的高靈敏度，并成功應用于小麥中DON的檢測，為高靈敏、更準確定量的免疫學快速檢測提供技術啟示及支撐。

在磁熒光免疫層析試紙檢測時，將1 μL磁熒光抗體探針加入到300 μL的樣品中反應，在外加磁場的作用下回收。由于投入的磁顆粒探針量較少，當樣品體積超過300 μL后磁熒光抗體探針回收較困難，因此選擇1 μL探針加入300 μL樣品進行檢測，100 μL重懸液重懸，等于將樣品3 倍富集。選擇磁性探針不僅可以濃縮樣品，而且探針回收后統(tǒng)一用重懸液重懸，大大降低了試紙檢測過程中不同樣本的基質(zhì)效應，讓檢測結果更準確。

由于超順磁顆粒與熒光納米材料偶聯(lián)后出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，因此在磁熒光納米材料的制備過程中需要硅化處理及偶聯(lián)等復雜的制備過程，技術門檻很高，限制了推廣應用。本實驗選取的綠色熒光蛋白，熒光性質(zhì)穩(wěn)定，從藍光到紫外線都能使其激發(fā)，發(fā)出綠色螢光，采用一步法將磁顆粒、綠色熒光蛋白與抗體偶聯(lián)制備磁熒光抗體探針，大大簡化了磁熒光抗體探針的制備過程，降低了磁熒光納米材料的技術門檻，為其更廣泛的應用于免疫層析檢測中提供技術手段。

4 結 論

采用溶劑熱法成功制備了超順磁顆粒，并采用一步法將其與綠色熒光蛋白及DON單克隆抗體偶聯(lián)獲得磁熒光抗體探針。通過優(yōu)化實驗參數(shù)，分別制備了DON磁熒光免疫層析試紙及DON膠體金免疫層析試紙，DON磁熒光免疫層析試紙可以實現(xiàn)樣品的富集及熒光信號檢測，靈敏度是DON膠體金免疫層析試紙的10.96 倍，可以實現(xiàn)DON的定量檢測。該實驗成功建立了磁熒光免疫層析試紙模式，并將其應用于DON檢測中，為磁熒光納米顆粒應用于免疫層析領域提供技術支撐。