高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法研究塑料接觸材料中酚類化合物向奶油中的遷移

張 慧，曹 慧，姜 侃，肖功年，王 瑾，周學(xué)軍，厲小燕

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2.浙江省產(chǎn)品質(zhì)量安全科學(xué)研究院，浙江 杭州 310018）

食品中雙酚類和烷基酚類等酚類化合物的污染一直是人們關(guān)注的領(lǐng)域。在對各類食品的調(diào)查中酚類化合物如雙酚A（bisphenol A，BPA）、雙酚S（bisphenol S，BPS）和壬基酚（nonylphenol，NP）等仍有一定的檢出率。這些物質(zhì)可產(chǎn)生類似雌激素的作用而干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響人體健康。食品中酚類化合物主要來源于環(huán)境污染和接觸材料的遷移等。酚類化合物常用作環(huán)氧樹脂等高分子材料或包裝容器內(nèi)壁涂層生產(chǎn)中的化工原料或中間體，通過材料和食品直接接觸，在生產(chǎn)或貯存過程中可能會遷移到食品中。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品接觸用塑料樹脂、涂料和涂層中BPA和BPS的特定遷移量分別為0.6 mg/kg和0.05 mg/kg，還沒有食品中雙酚類和烷基酚類的限量標(biāo)準(zhǔn)。

近年來，裱花蛋糕塑料裝飾品如各種造型的插件等時(shí)常被用于蛋糕表面的點(diǎn)綴和美化，由于色彩鮮艷、種類繁多受到青少年的喜愛。塑料裝飾品一般擺放在裱花蛋糕的奶油表面而與奶油直接接觸，接觸材料中的酚類化合物可能會遷移至奶油中產(chǎn)生食品安全風(fēng)險(xiǎn)。一些地區(qū)已經(jīng)禁止在裱花蛋糕上使用塑料裝飾品。因此，酚類化合物的遷移研究至關(guān)重要。當(dāng)前的研究多是食品接觸材料往模擬液中的遷移，而往真實(shí)樣品中的遷移研究則較少。

酚類化合物的檢測方法有分光光度法、熒光光度法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、高分辨質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法等，樣品涉及食品模擬液（水性食品、含酒精食品和含油脂食品等模擬液）、食品、飲用水、紡織品等。前人多是針對某幾類酚類物質(zhì)的檢測研究，尚缺乏奶油中多種酚類化合物同時(shí)檢測的方法。

本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)測定奶油中14 種酚類化合物的檢測方法，嘗試研究塑料接觸材料中酚類化合物在真實(shí)奶油中的遷移情況，并對市售的裱花蛋糕裝飾擺件等進(jìn)行遷移量的檢測分析，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估和科學(xué)監(jiān)管提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

動(dòng)物淡奶油、植物奶油樣品、塑料蛋糕裝飾擺件、底托配件、插桿 市購。

BPA標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；BPS、雙酚E（bisphenol E，BPE）、雙酚F（bisphenol F，BPF）、4-正辛基酚（4--octylphenol，4--OP）、4-壬基酚（4-nonylphenol，4-NP）、4-正壬基酚（4--nonylphenol，4--NP）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 北京Bepure公司；雙酚B（bisphenol B，BPB）、雙酚AF（bisphenol AF，BPAF）、雙酚AP（bisphenol AP，BPAP）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）美國TRC公司；雙酚Z（bisphenol Z，BPZ）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；四溴雙酚A（tetrabromobisphenol A，TBBPA）（純度＞99%） 美國Chem Service公司；四氯雙酚A（tetrachlorobisphenol A，TCBPA）、辛基酚（octylphenol，OP）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 美國AccuStandard公司；乙腈、甲醇、正己烷（均為色譜純） 德國Merck公司；乙醇（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

5500QTRAP型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；LC 20AD高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；VORTEX2旋渦混合器 德國IKA公司；UNIVERSAL 320 R離心機(jī)德國Hettich科學(xué)儀器有限公司；GT-7005-AT2恒溫恒濕試驗(yàn)機(jī) 高特威爾檢測儀器（青島）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器工作條件

1.3.1.1 色譜條件

Waters AtlantisT色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈-甲醇（1∶1，/），B為水；進(jìn)樣量5.0 μL；柱溫40 ℃；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions of liquid chromatography

1.3.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，負(fù)離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式；噴霧電壓-4 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣（N）壓力為50 psi；氣簾氣（N）為35 psi；輔助加熱氣（N）為55 psi；質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 酚類化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters of phenolic compounds

1.3.2 溶液的配制

酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：準(zhǔn)確稱量各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg），甲醇定容至10 mL容量瓶中，分別配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)儲備液，于-18 ℃冰箱保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：準(zhǔn)確吸取各單標(biāo)儲備液于同一容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L（BPS、BPAF和TCBPA為0.2 mg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃冰箱保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用乙腈和空白基質(zhì)溶液配制成0.5～75.0 μg/L或0.1～15.0 μg/L系列溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。以待測物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 提取溶劑的選擇

以動(dòng)物奶油為基質(zhì)，分別采用乙腈、甲醇、乙腈-水（1∶1，/）、甲醇-水（1∶1，/）、乙醇、乙腈-甲醇（1∶1，/）各5 mL，乙腈-正己烷（1∶1，10 mL）進(jìn)行提取比較研究，選擇適合的提取溶劑。

1.3.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.1 mg）奶油于50 mL具塞離心管中，再加入乙腈-甲醇（1∶1，/）5 mL渦旋振蕩5 min，9 000 r/min離心15 min，取乙腈-甲醇溶液層待測。

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

參照1.3.4節(jié)進(jìn)行樣品提取，以奶油為基質(zhì)，進(jìn)行系列加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，分別以3 倍和10 倍信噪比計(jì)算檢出限和定量限。

選取奶油樣品，分別添加低、中、高3 個(gè)水平的14 種混標(biāo)溶液，按照1.3.4節(jié)進(jìn)行樣品提取，同時(shí)做空白對照實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率。

1.3.6 酚類化合物的遷移實(shí)驗(yàn)

根據(jù)GB 5009.156—2016《食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)預(yù)處理方法通則》的規(guī)定，采用全浸沒的方法，按照6 dm接觸面積對應(yīng)1 L或1 kg食品模擬物的比例要求，開展蛋糕塑料裝飾材料在真實(shí)奶油樣品中的遷移實(shí)驗(yàn)。選擇前期篩查含有BPA和NP的塑料蛋糕裝飾材料作為陽性樣品，以動(dòng)物淡奶油和植物奶油為基質(zhì)，開展遷移實(shí)驗(yàn)。

溫度、接觸時(shí)間對酚類化合物遷移的影響：由于蛋糕裝飾材料一般接觸裱花蛋糕奶油的表面，根據(jù)裱花蛋糕的真實(shí)貯存情況，選擇4 ℃和20 ℃作為遷移溫度，20、40、60、120、240 min作為遷移時(shí)間；遷移后的樣品參照1.3.4節(jié)進(jìn)行處理，樣液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，上機(jī)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

流動(dòng)相的組成和pH值影響組分的分離效果和響應(yīng)強(qiáng)度大小，通常采用甲酸和氨水調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸、堿性和離子強(qiáng)度?？疾煲译?水、甲醇-乙腈（1∶1，/）-水、0.1%甲酸-乙腈、0.1%氨水-乙腈、0.1%甲酸-甲醇-乙腈（1∶1，/）、0.1%氨水-甲醇-乙腈（1∶1，/）等作為流動(dòng)相時(shí)14 種酚類化合物的出峰情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在甲醇-乙腈-水作為流動(dòng)相的條件下，14 種酚類化合物10 min內(nèi)出峰完全，且響應(yīng)值高、保留值好、峰形尖銳無拖尾；而甲酸的加入影響了酚類物質(zhì)的響應(yīng)值；氨水可提高酚類物質(zhì)的離子化效率，但使得四溴雙酚A和四氯雙酚A兩種物質(zhì)的出峰時(shí)間變化。因此，選擇甲醇-乙腈-水體系作為流動(dòng)相。14 種酚類化合物分離的總離子流圖見圖1。

圖1 14 種酚類化合物總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of 14 phenolic compounds

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于酚類物質(zhì)上的酚羥基在電離時(shí)容易失去質(zhì)子，因此選擇在電噴霧負(fù)離子模式下進(jìn)行優(yōu)化。采用針泵直接注射模式，將100 μg/L的化合物單標(biāo)溶液單獨(dú)進(jìn)樣，對母離子進(jìn)行全掃描，得到分子離子峰。以分子離子為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜全掃描，獲得碎片離子信息，每種酚類化合物選取2 個(gè)響應(yīng)強(qiáng)度高且干擾較少的特征碎片作為定性、定量離子對，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)（去簇電壓、碰撞能量等），結(jié)果見表2。

2.2 提取溶劑的選擇

雙酚類和烷基酚類化合物的提取有針對食品接觸材料、乳制品、烘焙蛋糕和水等的研究，楊金泉等研究了C、NH、HLB固相萃取柱對飲用水中BPA、BPS萃取的影響，結(jié)果表明HLB小柱對二者均有較好的富集效果。王勝利等采用乙腈對乳制品中的8 種雙酚類化合物進(jìn)行提取，QuEChERS-SPE凈化樣品，可有效去除基質(zhì)的干擾。王斌等研究乙腈、40%乙腈溶液、40%乙腈-0.1%甲酸、甲醇等溶液對面粉中8 種酚類污染物的提取效果，結(jié)果表明乙腈為最適合的提取溶劑；蛋糕由于油脂含量高，則采用乙腈-正己烷提取的方法，以消除油脂的干擾。本實(shí)驗(yàn)選取乙腈、甲醇、乙腈-水（1∶1，/）、甲醇-水（1∶1，/）、乙醇、乙腈-甲醇（1∶1，/）、乙腈-正己烷（1∶1，/）作為提取溶劑，參照1.3.3節(jié)提取方法，對自制動(dòng)物奶油陽性樣品進(jìn)行提取研究，14 種酚類化合物的提取回收率見圖2。結(jié)果表明，乙腈、甲醇、乙醇、乙腈-甲醇、乙腈-正己烷都獲得了較好的提取效果，其中乙腈-甲醇提取時(shí)14 種酚類物質(zhì)的整體回收率最優(yōu)，為82%～116%。因此，選擇乙腈-甲醇（1∶1，/）作為奶油中酚類化合物的提取溶劑。

圖2 奶油提取溶劑的影響Fig. 2 Effects of extraction solvents on recoveries of phenolics

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)

食品基質(zhì)往往比較復(fù)雜，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析樣品時(shí)，樣品中除待測成分以外的組分，常對被分析物的檢測信號產(chǎn)生干擾，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而形成基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)的去除常應(yīng)用校正曲線法。本實(shí)驗(yàn)采用以空白基質(zhì)液稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值，評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的影響。通常斜率比值在0.8～1.2范圍內(nèi)時(shí)認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯；小于0.8時(shí)，表明存在離子抑制作用；大于1.2時(shí)，表明存在離子增強(qiáng)作用。表3顯示，采用乙腈-甲醇提取奶油基質(zhì)時(shí)，動(dòng)物奶油和植物奶油基質(zhì)中14 種酚類化合物的斜率比值分別為0.75～1.63和0.51～1.49，說明動(dòng)物奶油和植物奶油都具有一定的基質(zhì)效應(yīng)。因此，可采用奶油空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量分析，以消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

表3 不同基質(zhì)中酚類化合物的基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Matrix effects of 14 bisphenol compounds

2.4 線性方程、檢出限與定量限結(jié)果

在空白基質(zhì)樣液中加入混標(biāo)溶液，配成質(zhì)量濃度梯度為0.5、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0 μg/L或0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 μg/L（BPS、BPAF、TCBPA）系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，以定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到線性回歸方程。以3 倍信噪比確定酚類化合物的檢出限，以10 倍信噪比確定化合物的定量限，結(jié)果見表4。14 種酚類化合物線性相關(guān)系數(shù)（）均在0.990 4～0.999 8范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表4 酚類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of phenolic compounds

2.5 回收率與精密度結(jié)果

取陰性奶油樣品作為空白基質(zhì)，在動(dòng)物奶油和植物奶油中分別添加低、中、高3 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。如表5所示，動(dòng)物奶油中14 種酚類化合物的平均回收率為78.2%～117.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%～12.1%（=3）；植物奶油中14 種酚類化合物的平均回收率為79.4%～114.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%～12.5%（=3）。方法回收率和精密度較好，適合奶油樣品的分析測定。

表5 酚類物質(zhì)的回收率與精密度Table 5 Recoveries and RSD of phenolic compounds spiked in negative cream samples

續(xù)表5

2.6 酚類化合物在奶油中的遷移情況

食品中雙酚類和烷基酚類化合物的污染往往來源于食品接觸材料的遷移。裱花蛋糕裝飾材料常用于裝飾在生日蛋糕奶油的表面而與奶油接觸。本實(shí)驗(yàn)選取前期檢測為陰性的動(dòng)物奶油和植物奶油為遷移基質(zhì)，將前期檢測BPA和4-NP為陽性的塑料蛋糕裝飾品底板（可與蛋糕接觸的部分），按照1.3.6節(jié)方法開展在真實(shí)奶油中的遷移實(shí)驗(yàn)，了解酚類化合物在液態(tài)奶油中的遷移和溶出情況。

通常情況下，接觸溫度和接觸時(shí)間會對化合物的遷移有影響。溫度越高，分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)越活躍，也就越易遷移；時(shí)間越長，化合物遷移量也會增多。羅玉瑋、王君等分別研究了BPS、壬基酚在不同濃度食品模擬液水、乙醇、乙酸等中的遷移規(guī)律，均得出了遷移溫度越高、時(shí)間越長、遷移量越大的結(jié)論。如圖3所示，在不同溫度和時(shí)間下，BPA和4-NP在動(dòng)物奶油和植物奶油中均發(fā)生了遷移，20 ℃時(shí)的遷移量均高于4 ℃時(shí)的遷移量；隨著時(shí)間的延長，遷移量也逐漸增多。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BPA和4-NP在前60 min內(nèi)遷移量增幅較快，120 min后開始增長變緩，綜合考慮裱花蛋糕的實(shí)際貯藏和使用情況，選擇120 min作為后期樣品測定的遷移時(shí)間。

圖3 不同溫度和時(shí)間下塑料接觸材料中BPA（A）和4-NP（B）向奶油中的遷移Fig. 3 Migration of BPA (A) and 4-NP (B) into cream from plastic contact materials

2.7 樣品測定結(jié)果

選取液體動(dòng)物淡奶油為遷移基質(zhì)，采用最優(yōu)條件對市場和網(wǎng)店隨機(jī)購買的21 個(gè)塑料蛋糕裝飾擺件、插桿和底托等進(jìn)行遷移量測定，遷移溫度選擇20 ℃，遷移時(shí)間選擇120 min，結(jié)果見表6、圖4。有8 個(gè)樣品檢出了酚類化合物，主要集中在BPA、BPS和4-NP，BPA、BPS檢出樣品分別為3 個(gè)和1 個(gè)，遷移量最高值分別為4.61、0.94 μg/kg；4-NP檢出的樣品數(shù)最多為7 個(gè)，遷移量最高值為125.1 μg/kg。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品接觸用塑料樹脂、涂料和涂層中特定遷移限量要求是BPA 0.6 mg/kg、BPS 0.05 mg/kg，樣品中BPA和BPS在奶油中遷移2 h的遷移量均低于遷移限量；目前尚無壬基酚的限量要求。BPA、BPS和4-NP是酚醛樹脂、可塑性聚酯等高分子材料生產(chǎn)過程中重要的原料，它們的暴露會干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，造成內(nèi)分泌失調(diào)、新陳代謝紊亂等，影響人體健康。因此，應(yīng)持續(xù)關(guān)注酚類化合物遷移可能帶來的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。圖4為典型陽性樣品中Y2檢出BPA和4-NP、Y4中檢出BPS的色譜圖。

表6 塑料蛋糕裝飾材料中酚類化合物的遷移量Table 6 Migration of phenolic compounds from plastic cake decorations

圖4 典型陽性樣品中BPA、4-NP和BPS的多反應(yīng)監(jiān)測圖Fig. 4 Multi-reaction monitoring chromatograms of BPA, 4-NP and BPS in typical positive samples

3 結(jié) 論

建立了乙腈-甲醇為提取溶劑、高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定奶油中14 種酚類化合物的檢測方法，用于塑料中BPA和4-NP陽性樣品在奶油中的遷移規(guī)律，以及塑料蛋糕裝飾材料在奶油基質(zhì)中遷移量的測定分析。結(jié)果表明，14 種酚類化合物的檢出限為0.15～0.75 μg/kg，定量限為0.5～2.5 μg/kg，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，酚類化合物在動(dòng)物奶油中的回收率為78.2%～117.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%～12.1%（=3）；在植物奶油中的回收率為79.4%～114.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%～12.5%（=3）。塑料接觸材料陽性樣品中的BPA和4-NP在奶油發(fā)生了遷移，隨著遷移溫度的升高和時(shí)間的延長，遷移量逐漸增大。選擇120 min作為遷移時(shí)間，對市售的塑料蛋糕裝飾擺件等在動(dòng)物淡奶油中的遷移量進(jìn)行測定，遷移的化合物主要集中在BPA、BPS和4-NP，BPA和BPS遷移量最高值分別為4.61、0.94 μg/kg；4-NP遷移量最高值為125.1 μg/kg，檢出的樣品數(shù)量最多。雙酚類和烷基酚類化合物其遷移到食品中的安全性不容忽視。本方法的建立和遷移研究，可為食品和食品相關(guān)產(chǎn)品的安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。