單基因自身炎癥性疾病的動物模型

黃欣，沈敏

自身炎癥性疾病(systemic autoinflammatory diseases，SAIDs)是由于基因突變引起固有免疫異常，進(jìn)而造成系統(tǒng)性或器官特異性炎癥的一組遺傳性疾病。本組疾病按照遺傳特征分為單基因SAIDs和多基因多因素SAIDs。其中單基因SAIDs包括家族性地中海熱(familial Mediterranean fever，F(xiàn)MF)、NLRP3相關(guān)自身炎癥性疾病(3-associated autoinflammatory disease)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)周期性綜合征(tumor necrosis factor receptor-associated periodic syndrome，TRAPS)、腺苷脫氨酶2缺乏癥(deficiency of adenosine deaminase 2，DADA2)、嬰兒起病的STING相關(guān)血管病[stimulator of interferon genes (STING)-associated vasculopathy with onset in infancy，SAVI]、A20單倍體劑量不足(haploinsufficiency of A20，HA20)等罕見病。從該病20世紀(jì)末被命名以來的20年，隨著基因測序技術(shù)的提高，許多新的單基因SAIDs致病基因不斷被發(fā)現(xiàn)，對該病的認(rèn)識也在不斷加深，發(fā)現(xiàn)固有免疫失調(diào)在SAIDs的發(fā)病中起到了重要作用，但是SAIDs的發(fā)病機(jī)制仍然尚未闡釋清楚，治療也缺乏有效手段。

實(shí)驗動物是進(jìn)行人類疾病研究的重要載體。主要的實(shí)驗動物有酵母菌、線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠、豬等，其中小鼠在醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛。動物模型能夠模擬人類疾病的臨床表現(xiàn)，可以幫助認(rèn)識疾病的發(fā)生、發(fā)展及病理生理機(jī)制，還可為藥物治療靶點(diǎn)提供證據(jù)。SAIDs發(fā)病率低，多與遺傳相關(guān)聯(lián)，難以建立自發(fā)動物模型和誘發(fā)動物模型?；蚬こ虅游锬Ｐ涂梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)基因、基因打靶等基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使實(shí)驗動物出現(xiàn)單基因SAIDs的表型。基因工程動物模型的構(gòu)建技術(shù)隨著時代的進(jìn)步而發(fā)展，從開始的轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因打靶技術(shù)，到轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)座、體細(xì)胞核移植技術(shù)等，再到近年來飛速發(fā)展的基因編輯技術(shù)，科學(xué)家們目前已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)構(gòu)建基因修飾動物模型。構(gòu)建基因編輯小鼠最常用的方法主要有鋅指核酸內(nèi)切酶(zincfingerendonucleases，ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcriptionalactivatoreffectornucleases，TALEN)和CRISPR-Cas9等技術(shù)。構(gòu)建SAIDs基因修飾小鼠模型的目的是為了更好地了解SAIDs這類疾病，更應(yīng)該關(guān)注小鼠模型的適用性，而不是技術(shù)的優(yōu)劣性。本文主要綜述基因工程小鼠在單基因SAIDs中的應(yīng)用，包括其在發(fā)病機(jī)制、病理生理以及治療方面的研究，并展望應(yīng)用前景。

1 已報道的單基因SAIDs動物模型

1.1 FMF動物模型

FMF是最常見的單基因SAIDs，主要特點(diǎn)是周期性發(fā)作的發(fā)熱，伴漿膜炎、滑膜炎或皮炎，部分患者最終發(fā)展為系統(tǒng)性AA型淀粉樣變。FMF的致病基因為位于16號染色體的，其編碼的蛋白質(zhì)炎素(pyrin)可以作為一種先天性免疫傳感器觸發(fā)半胱氨酸蛋白酶- 1(Caspase- 1)的激活以及白細(xì)胞介素(IL)- 1β、IL- 18的產(chǎn)生。常見的致病性突變有M680I，M694V，M694I和V726A(https：//infevers.umai-montpellier.fr/web/)。小鼠、大鼠及斑馬魚均有與人類同源的基因。小鼠與人類的同源基因同樣位于16號染色體且構(gòu)建技術(shù)較為成熟，多種基因工程小鼠被用于探究FMF的發(fā)病機(jī)制及病理生理(http：//www.informatics.jax.org/)。大多數(shù)的FMF突變聚集在炎素的C端B30.2域，具有人類B30.2域的純合敲入小鼠、和表現(xiàn)出與FMF相似的嚴(yán)重自發(fā)性炎癥，包括關(guān)節(jié)炎和皮炎。其中小鼠炎癥表型最嚴(yán)重，出生1周左右即出現(xiàn)皮膚鱗片狀皮炎，2- 3周死亡。而和出現(xiàn)發(fā)育遲緩、消耗癥狀、皮炎和關(guān)節(jié)炎等表現(xiàn)。這些基因工程小鼠是應(yīng)用廣泛的FMF疾病模型。

1.2 NLRP3-AID動物模型

3-AID又稱冷炎素相關(guān)周期性綜合征(cryopyrin associated periodic syndromes，CAPS)，主要表現(xiàn)為周期性發(fā)熱伴皮疹(蕁麻疹最常見)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)自輕到重可分三種疾?。杭易逍岳渥陨硌装Y綜合征(familial cold autoinflammatory syndrome，F(xiàn)CAS)、Muckle-Wells綜合征(Muckle-Wells syndrome，MWS)和慢性嬰兒神經(jīng)皮膚關(guān)節(jié)綜合征(chronic infantile neurological cutaneous articular syndrome，CINCA)。FCAS在寒冷暴露后出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)痛、結(jié)膜炎和蕁麻疹樣皮疹。MWS與寒冷暴露關(guān)系不密切，也會有發(fā)熱、蕁麻疹樣皮疹、關(guān)節(jié)痛/炎、結(jié)膜炎，還可出現(xiàn)慢性無菌性腦膜炎、感音神經(jīng)性聾。而CINCA是最重的類型，一般自出生起持續(xù)終生，前述發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)炎等癥狀更嚴(yán)重，并有嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥表現(xiàn)。3-AID的致病基因是3，常見致病性突變主要位于外顯子3，包括R260W、D303N、T348M和A352V等(https：//infevers.umai-montpellier.fr/web/)，通過構(gòu)建攜帶相應(yīng)突變的小鼠模型可以驗證這些突變的致病性。FCAS小鼠模型攜帶L351P突變，MWS小鼠模型則攜帶A350V突變，這兩種小鼠都表現(xiàn)出生長發(fā)育異常，并出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)。另一種攜帶R258W突變的MWS小鼠則主要表現(xiàn)為自發(fā)性皮膚炎癥。CINCA小鼠有兩種，一種是3，另一種是3，后者表現(xiàn)出淀粉樣變。其他類型的3-AID小鼠生長遲滯且死亡較早，但CINCA小鼠的存活時間延長，可能是其能被觀察到淀粉樣變的原因。值得一提的是，3-AID小鼠模型的表型與人類疾病表型嚴(yán)重程度相反，人類疾病中表型最嚴(yán)重的CINCA，與之相應(yīng)基因突變的小鼠卻呈現(xiàn)出最輕的表型，這顯示出小鼠模型的局限性。

1.3 其他單基因SAIDs動物模型

TRAPS也是一種常見的單基因SAIDs，是由基因突變引起的常染色體顯性遺傳性疾病，主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)熱，除了與FMF相似的腹痛、胸痛和滑膜炎之外，TRAPS還常出現(xiàn)眼炎(最常見結(jié)膜炎和眶周水腫)，以及特征性游走性肌痛，伴或不伴表面痛性紅斑。TRAPS敲入小鼠模型分別攜帶外顯子2上的C33Y突變以及外顯子3上的T50M突變，這兩個突變均是infever網(wǎng)站(https：//infevers.umai-montpellier.fr/web/)中的致病性突變。有學(xué)者還曾構(gòu)建了TNF受體缺陷的小鼠證明p55和p75在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)體內(nèi)TNF活性中的作用。

SAVI是一種自嬰兒期起病，主要以血管病變?yōu)樘卣鞯暮币姷某Ｈ旧w顯性遺傳性疾病，其致病基因為，編碼蛋白STING。研究者們構(gòu)建了敲入N153S突變的SAVI小鼠模型，表現(xiàn)為自發(fā)性肺部炎癥、皮膚潰瘍以及壽命縮短等癥狀。另一種敲入V154M突變的SAVI小鼠模型則表現(xiàn)出聯(lián)合免疫缺陷表型、低丙種球蛋白血癥以及不同程度的肺部炎癥和腎臟炎癥(表1)。

表1 單基因SAIDs小鼠模型

2 動物模型在單基因SAIDs的應(yīng)用

利用上述動物模型，可以對單基因SAIDs的遺傳、發(fā)病機(jī)制和治療開展深入研究。

2.1 遺傳機(jī)制研究

2.1.1 遺傳方式研究：FMF長期以來一直被認(rèn)為是一種常染色體隱性遺傳疾病，雜合敲入小鼠表型正常，而純合敲入小鼠表現(xiàn)出FMF的炎癥表型，由此能夠驗證FMF的隱性遺傳模式。但是，有些FMF的患者只攜帶一個致病基因并表現(xiàn)出常染色體顯性遺傳的特征，有學(xué)者猜測這或許是疾病的不完全外顯以及可變表現(xiàn)度所致。3-AID和SAVI的遺傳方式都呈現(xiàn)常染色體顯性遺傳，研究發(fā)現(xiàn)攜帶上述基因致病突變的雜合小鼠即可表現(xiàn)出相應(yīng)疾病的炎癥表型，與常染色體顯性遺傳的遺傳方式相一致，因此確定了這些疾病的遺傳方式。小鼠模型還可以被用來探討外顯率及表現(xiàn)度差異的影響因素。

2.1.2 編碼蛋白功能研究：插入FMF相關(guān)突變B30.2域可以使小鼠產(chǎn)生炎癥，而被靶向破壞基因的小鼠卻并未表現(xiàn)出FMF相關(guān)炎癥表型，說明FMF符合功能獲得性突變基因致病。雜合敲入小鼠，和生長正常，也無炎癥表現(xiàn)，而純合敲入小鼠則發(fā)病，這說明FMF符合隱性遺傳模式。研究者構(gòu)建了半合子小鼠726-，這種小鼠只攜帶一個來自致病基因的突變，但是卻并不存在炎癥表型。由此可見，小鼠模型能幫助我們認(rèn)識到FMF發(fā)病機(jī)制中基因功能獲得性突變以及基因劑量效應(yīng)的現(xiàn)象。

敲入3L351P突變以及A350V突變的小鼠都表現(xiàn)出了與人類3-AID相似的炎癥表型，提示這兩種突變是功能獲得性突變。與野生型小鼠相比，3 D301N突變小鼠也表現(xiàn)出全身炎癥以及生長遲緩，表明D301N也屬于功能獲得性突變。因此，通過小鼠模型可以證實(shí)3-AID是由于3功能獲得性突變的一組SAID。

2.2 發(fā)病機(jī)制研究

2.2.1 環(huán)境因素：3-AID患者暴露于寒冷的環(huán)境可能引起疾病發(fā)作。研究報道FCAS患者對寒冷的暴露十分敏感，會引起皮疹及其他疾病相關(guān)癥狀的發(fā)生，曾有研究顯示FCAS的患者的外周血單核細(xì)胞在暴露于32 ℃后會自發(fā)分泌IL- 1β，而MWS的患者在冷暴露后也可能會引起皮疹、關(guān)節(jié)炎等癥狀。人們通過小鼠模型研究了3-AID的發(fā)病與外界環(huán)境溫度的關(guān)系。+/小鼠外周血細(xì)胞暴露于32 ℃寒冷環(huán)境后，會出現(xiàn)自發(fā)性IL- 1β分泌增多，這與FCAS患者外周血單核細(xì)胞暴露于寒冷環(huán)境的結(jié)果是一致。與37 ℃環(huán)境溫度相比，+/小鼠外周血細(xì)胞在暴露于32 ℃且有刺激劑脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的情況下IL- 1β的水平上升，但沒有刺激劑的情況下，這種小鼠模型的炎癥因子水平?jīng)]有因為溫度降低而自發(fā)升高。這提示我們溫度在3-AID的發(fā)病機(jī)制中可能是一個激活因素，但無法脫離炎癥激活劑獨(dú)立存在。

2.2.2 病理生理機(jī)制：攜帶人B30.2域突變的小鼠成為探索FMF病理生理機(jī)制的良好模型。這些小鼠模型被用于驗證RhoA激活蛋白質(zhì)激酶(protein kinase，PKN)1和PKN2并對炎素炎癥小體產(chǎn)生抑制。Sharma等使用小鼠發(fā)現(xiàn)其自身炎癥是由IL- 1β特異性介導(dǎo)的，而FMF發(fā)作有賴于Caspase- 1-ASC軸活化。該小鼠模型還被用于驗證TNF與炎癥小體協(xié)同作用放大炎癥反應(yīng)，提示炎素炎癥小體介導(dǎo)的IL- 1β促進(jìn)TNF的分泌，并可調(diào)節(jié)FMF的某些病理特征。

為了探索IL- 1β在炎癥中發(fā)揮的作用，研究者們構(gòu)建了不表達(dá)IL- 1受體(IL- 1 receptor，IL- 1r)的小鼠3//-，這種小鼠避免了新生致死，且體重相較于3350/+/小鼠及3//-小鼠顯著上升，證明小鼠3-AID的表型部分依賴于IL- 1β。缺失IL- 18受體且攜帶3突變的年輕小鼠的皮膚炎癥以及內(nèi)臟炎癥減輕，而衰老的小鼠將會出現(xiàn)嚴(yán)重的全身炎癥，提示IL- 1與IL- 18在疾病的不同階段發(fā)揮病理作用。

2.2.3 進(jìn)化機(jī)制：炎素可能是先天免疫中特異的免疫傳感器，基于這種猜想，有學(xué)者使用TALEN技術(shù)構(gòu)建小鼠，證實(shí)了炎素作為感受器感知細(xì)菌內(nèi)的Rho GTP酶的修飾，并形成炎癥小體，發(fā)揮其在先天免疫中抗細(xì)菌的作用。2016年，研究者用FMF小鼠模型探討了炎素炎癥小體抵御病原體的機(jī)制，并提出這些突變可能是一把雙刃劍，在抵御病原菌的入侵的同時引起自身炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，突變型炎素和野生型相比，前者與鼠疫耶爾森菌毒力因子YopM結(jié)合力變?nèi)?。動物研究證實(shí)，鼠疫耶爾森菌感染的小鼠和野生型敲入小鼠相比存活率更高，因此表明地中海人群中基因高突變率的發(fā)生可能是在進(jìn)化上對鼠疫耶爾森菌的陽性選擇結(jié)果。

2.3 治療研究

2.3.1 已有藥物：秋水仙堿是一種常用于治療痛風(fēng)的藥物，同時也是一種RhoA激活劑，過去幾十年被廣泛用于治療FMF。秋水仙堿可以使小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞中的IL- 1β水平降低，證明秋水仙堿可以抑制炎素炎癥小體。富馬酸二甲酯(dimethyl fumarate，DMF)是一種工業(yè)防腐原料，后來被用于治療多發(fā)性硬化。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠模型給藥DMF后，小鼠的體重增加，脾大好轉(zhuǎn)，同時IL- 1β的分泌及焦孔素D (gasdermin D，GSDMD)-N端的形成減少，提示DMF對FMF的潛在治療作用。為了探究并發(fā)嚴(yán)重淀粉樣變的-AID的治療方法，研究者們新構(gòu)建了小鼠。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)子泵抑制劑可以顯著改善3敲入小鼠的臨床癥狀，并使淀粉樣蛋白沉積消退，證明了這些藥物可以嘗試作為-AID的治療藥物。

2.3.2 探索新治療：動物模型在探索SAIDs藥物治療新靶點(diǎn)方面發(fā)揮了重要作用。焦亡是細(xì)胞程序性死亡的途徑之一，而GSDMD缺陷的FMF小鼠沒有表現(xiàn)出炎癥特征，提示焦亡介導(dǎo)了FMF的發(fā)病，可能作為FMF的治療新靶點(diǎn)。

美國食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)用于治療3-AID的藥物有IL- 1受體拮抗劑阿那白滯素(anakinra)、IL- 1受體融合蛋白雷納西普(rilonacept)以及IL- 1β 單克隆抗體卡納單抗(canakinumab)。但是這些藥物價格昂貴并且可能增加感染的風(fēng)險，因此構(gòu)建NLRP3小鼠模型對于藥物新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。與傳統(tǒng)的IL- 1靶向治療相比，NLRP3抑制劑可能更加經(jīng)濟(jì)并具有治療潛力。同時，IL- 18在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用也值得重視。目前，針對這些新靶點(diǎn)的動物實(shí)驗正在-AID小鼠模型中開展。

3 單基因SAIDs動物模型的應(yīng)用前景

單基因SAIDs因為只包含單個基因的突變，所以在構(gòu)建基因工程實(shí)驗動物方面有其獨(dú)特優(yōu)勢。單基因SAIDs疾病譜不斷擴(kuò)展，例如2019年新命名的單基因SAIDs——抗裂解RIPK1誘導(dǎo)的自身炎癥(cleavage-resistant RIPK1-induced autoinflammatory，CRIA)，不同的研究團(tuán)隊在探討RIPK1、Caspase- 8以及RIPK3在其發(fā)病機(jī)制中的作用時，都使用了小鼠模型。動物模型也并非只有小鼠這一選擇，與人類親緣關(guān)系更為接近的豬，也可以被構(gòu)建成為SAIDs動物模型。2020年，研究者們構(gòu)建了NLRP3 R259W點(diǎn)突變豬模型，這種動物模型體內(nèi)炎癥通路與人類相似，可以作為一種理想的3-AID動物模型。除了豬，斑馬魚也曾作為SAIDs的動物模型。例如2020年新命名的VEXAS綜合征(vacuoles，E1 enzyme，X-linked，autoinflammatory，somatic syndrome)，研究者們利用基因編輯的斑馬魚完成了體內(nèi)實(shí)驗的基因功能驗證。此外，通過利用敲低斑馬魚內(nèi)ADA2的表達(dá)，還證實(shí)了ADA2缺陷在DADA2發(fā)病中的作用。

小鼠模型是目前應(yīng)用最廣泛和研究最透徹的動物模型，小鼠模型屬于哺乳動物，擁有繁殖力強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。科學(xué)家們目前已經(jīng)構(gòu)建了很多單基因SAIDs的小鼠模型，并利用這些模型探究了SAIDs的遺傳機(jī)制、發(fā)病機(jī)制與治療靶點(diǎn)。但是單基因的疾病可能存在多種突變，構(gòu)建單基因SAIDs的小鼠模型時研究者往往選擇的都是人群中最常見的突變類型，不同突變的表型是存在一定差異的，這無疑會降低疾病模型的適用范圍。另外，構(gòu)建小鼠模型的突變一般是外國人群常見的基因突變類型，并不一定與中國人群疾病突變類型完全相同。因此有些未經(jīng)證實(shí)的突變位點(diǎn)可通過構(gòu)建攜帶相應(yīng)突變的小鼠模型進(jìn)行證實(shí)。在構(gòu)建基因工程小鼠時，由于人與小鼠的遺傳信息的不同或是技術(shù)的限制，小鼠模型可能無法達(dá)到預(yù)期表型。被廣泛應(yīng)用的SAIDs的基因工程小鼠也可以進(jìn)行雜交等方法得到適合研究者應(yīng)用的基因型和表型，應(yīng)用于更多方面的探索。

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，基因編輯工具的特異性和效率不斷增高，高效且可以跨物種的基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)使比較醫(yī)學(xué)得到極大發(fā)展。動物模型相關(guān)數(shù)據(jù)庫的出現(xiàn)提供了更多供研究者選擇的動物模型。例如數(shù)據(jù)庫Mouse Genome Informatics(http：//www.informatics.jax.org/)、JacksonLaboratory(https：//www.jax.org/cn/)和國家遺傳工程小鼠資源庫(http：//www.nrcmm.cn/)等。通過信息的整合，研究人員可以依據(jù)基因型和表型來選擇適合自己研究的動物模型。

綜上所述，通過多種動物模型，許多SAIDs的發(fā)病機(jī)制逐漸被闡明。隨著技術(shù)的完善以及對于疾病認(rèn)識的加深，研究者已經(jīng)構(gòu)建出同時擁有炎癥表型和并發(fā)癥的動物模型，用于SAIDs發(fā)病機(jī)制研究以及探索疾病治療新靶點(diǎn)。雖然已經(jīng)有其他種類的動物模型出現(xiàn)，但基因工程小鼠仍然是未來單基因SAIDs領(lǐng)域的應(yīng)用熱點(diǎn)。