MCT2激活Nrf2通路調(diào)控H/R視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡與焦亡

張小敏， 劉 文， 蔡傲竹

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院眼科， 湖北 武漢 430070)

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是影響視神經(jīng)病變的重要細(xì)胞類型之一，例如青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷等[1]。其中，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是許多視網(wǎng)膜疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，也是導(dǎo)致視力障礙或失明的主要原因，該過程可導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生一系列損傷反應(yīng)，從而破壞細(xì)胞正常生理功能，加重視網(wǎng)膜組織損傷。單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monocarboxylate transporters，MCT)是溶質(zhì)載體16轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員，可介導(dǎo)細(xì)胞乳酸、丙酮酸及其它單羧酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。研究表明，MCT2在整個(gè)視網(wǎng)膜內(nèi)層大量表達(dá)，其表達(dá)受抑制將導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能降低，同時(shí)降低光轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感性和谷氨酸能神經(jīng)元的水平[3]，這提示MCT2可能是治療視網(wǎng)膜疾病和保護(hù)視力的潛在靶點(diǎn)。鑒于此，本研究以缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)處理人視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5模擬視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，研究MCT2對(duì)RGC-5細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料：人視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5購(gòu)于廣州博輝生物科技公司，Nrf2抑制劑ML385(純度99.59%，北京百奧萊博科技公司)，胎牛血清、青-鏈霉素雙抗溶液和DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體試劑盒和Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程公司)，AceQ qPCR Probe Master Mix(南京諾唯贊生物公司)，CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海弗元生物公司)，免疫熒光染色試劑盒(江蘇凱基生物公司)，Hoechst33342/PI雙染試劑盒、RIPA裂解液、Bradford蛋白測(cè)定試劑盒及ECL超敏發(fā)光液(上海碧云天生物研究所)，特異性抗體MCT2、Nrf2、Caspase-1、Bax、Caspase-3、Bcl-2、GSDMD、Caspase-1、NLRP3、IL-1β、GAPDH以及Alexa Fluor?647熒光二抗(英國(guó)Abcam公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)。pcDNA3.1-MCT2重組質(zhì)粒及陰性對(duì)照pcDNA3.1-NC重組質(zhì)粒交由上海吉?jiǎng)P基因公司設(shè)計(jì)構(gòu)建。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：RGC-5細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RGC-5細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，在培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，確保細(xì)胞貼壁后密度80～90%，采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑盒將pcDNA3.1-MCT2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RGC-5細(xì)胞中，記為MCT2組，NC組將pcDNA3.1-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RGC-5細(xì)胞中，并以正常培養(yǎng)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的RGC-5細(xì)胞作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染具體按照試劑盒說明書進(jìn)行，4h后更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot測(cè)定轉(zhuǎn)染效果，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)總RNA純度與濃度，OD260/OD280值在1.8～2.0即為合格。取提取的總RNA，按照M-MLV試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以獲得cDNA作為模板，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行擴(kuò)增以測(cè)定目的基因mRNA的表達(dá)水平，在CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，GAPDH作為內(nèi)參基因。程序設(shè)置為：預(yù)變性，95℃ 5min；循環(huán)反應(yīng)，95℃ 10s、60℃ 30s，循環(huán)35次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。擴(kuò)增結(jié)束后，采用χ2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。具體引物序列如下：MCT2，上游引物5’-CGTTGACAGCGAGGCGAATC-3’，下游引物5’-GTGGCATTTCTGCTCCTAGAGT-3’；GAPDH，上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。

1.2.3Western blot法：在細(xì)胞中加入預(yù)冷RIPA緩沖液置于冰上裂解，提取總蛋白，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE凝膠，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，沸水浴煮沸10min，上樣至凝膠加樣孔內(nèi)，經(jīng)恒壓電泳分離蛋白，通過濕轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉2h，TBST洗膜，加入稀釋后的一抗工作液，4℃孵育過夜。次日，棄去一抗，TBST洗膜后，加入對(duì)應(yīng)稀釋后的二抗工作液，室溫放置1h，TBST再次洗膜，利用ECL顯色，經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)掃膜后拍攝圖像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4細(xì)胞H/R處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RGC-5細(xì)胞，0.25%胰酶消化，加入新鮮培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板，將其置于含有94%N2、5%CO2以及1%O2的培養(yǎng)箱，造成細(xì)胞缺氧，持續(xù)4h后，除去原培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)液，并將細(xì)胞移至37℃、5%CO2以及21% O2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h，使細(xì)胞復(fù)氧。

1.2.5實(shí)驗(yàn)分組與處理：實(shí)驗(yàn)分為4組進(jìn)行，具體分組與處理如下：①對(duì)照組，RGC-5細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理；②H/R組，RGC-5細(xì)胞進(jìn)行H/R處理；③MCT2組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCT2質(zhì)粒至RGC-5細(xì)胞，并進(jìn)行H/R處理；④MCT2+ML385組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCT2質(zhì)粒至RGC-5細(xì)胞，進(jìn)行H/R處理后使用Nrf2抑制劑2μmoL/L的ML385處理細(xì)胞24h。各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，收集細(xì)胞。

1.2.6CCK-8法：將處理后的各組RGC-5細(xì)胞接種于96孔板，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在24、48、72h檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，每分組設(shè)置6復(fù)孔，在各孔內(nèi)加入CCK-8檢測(cè)液，混合均勻，放于培養(yǎng)箱反應(yīng)2h后，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450nm處各孔細(xì)胞的光密度值(OD值)。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)：將收集的各組RGC-5細(xì)胞以1500rpm離心5min，棄上清，PBS洗滌沉淀，加入適量Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為5×105個(gè)/mL，取100μL懸液移入干凈離心管，依次添加5μL Annexin V-FITC和10μL PI，混勻，進(jìn)行雙染操作，室溫避光孵育30min后，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8Hoechst/PI染色法：將RGC-5細(xì)胞按分組處理完畢后，接種于含細(xì)胞爬片的24孔板中培養(yǎng)24h，更換為1mL含有染色液(5μL Hoechst 33342和5μL PI)的培養(yǎng)液進(jìn)行處理，放置于37℃培養(yǎng)箱孵育30min，吸棄染色液，PBS清洗細(xì)胞，抗熒光淬滅劑封片，通過熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，PI為紅色熒光，Hoechst為藍(lán)色熒光，隨機(jī)選擇6個(gè)視野，計(jì)數(shù)紅染細(xì)胞與藍(lán)染細(xì)胞，以兩者比值作為PI凋亡指數(shù)。

1.2.9免疫熒光染色：收集各組RGC-5細(xì)胞接種于含細(xì)胞爬片的24孔板中，加入預(yù)冷的丙酮固定細(xì)胞，采用0.25%Triton-X穿透液室溫作用10min，再用10%山羊血清在37℃下封閉2h，滴加特異性一抗Nrf2(1∶200)或Caspase-1(1∶200)，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。次日，棄一抗，并用PBS清洗干凈，滴加熒光標(biāo)記二抗(1∶500)，室溫繼續(xù)孵育1h，PBS清洗后，采用DAPI常溫避光孵育30min進(jìn)行染核，PBS再次清洗后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察染色情況，并采集圖片，Image Pro Plus 6.0系統(tǒng)計(jì)算蛋白染色的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞內(nèi)MCT2 mRNA與蛋白表達(dá)水平比較：轉(zhuǎn)染后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MCT2在mRNA與蛋白上的表達(dá)變化，與對(duì)照組比較，MCT2組細(xì)胞中MCT2 mRNA與蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)；此外，相較于NC組，MCT2組細(xì)胞中MCT2 mRNA與蛋白的相對(duì)表達(dá)量也均顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞MCT2 mRNA與蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

2.2各組細(xì)胞增殖活性比較：CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性變化，檢測(cè)結(jié)果顯示，在24h、48h及72h，H/R組細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)；MCT2組細(xì)胞增殖活性則顯著高于H/R組細(xì)胞增殖活性(P<0.05)；而相較于MCT2組，MCT2+ML385組細(xì)胞增殖活性顯著下降(P<0.05)，見圖2。

圖2 CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性

2.3各組細(xì)胞凋亡與焦亡水平比較：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；MCT2組細(xì)胞凋亡率較H/R組則顯著減少(P<0.05)；此外，MCT2+ML385組細(xì)胞凋亡率較MCT2組顯著增加(P<0.05)，見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

由Hoechst/PI染色法檢測(cè)結(jié)果可見，各組細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)PI紅色熒光，說明細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞PI凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與H/R組比較，MCT2組細(xì)胞PI凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.05)；與MCT2組比較，MCT2+ML385組細(xì)胞PI凋亡指數(shù)則顯著升高(P<0.05)，見圖4。

圖4 Hoechst/PI染色觀察各組細(xì)胞凋亡情況(比例尺=100μm)

2.4各組細(xì)胞內(nèi)凋亡與焦亡蛋白表達(dá)水平比較：Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞中Bax和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)；與H/R組比較，MCT2組中Bax和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；與MCT2組比較，MCT2+ML385組Bax和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，同時(shí)，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，H/R組細(xì)胞內(nèi)GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均顯著上調(diào)(P<0.05)；與H/R組比較，MCT2組內(nèi)GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)；而相較于MCT2組，MCT2+ML385組GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5各組細(xì)胞內(nèi)Nrf2與Caspase-1蛋白免疫熒光染色結(jié)果：免疫熒光染色觀察各組細(xì)胞內(nèi)Nrf2與Caspase-1表達(dá)，染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞內(nèi)Nrf2熒光強(qiáng)度顯著減弱，Caspase-1熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與H/R組比較，MCT2組細(xì)胞內(nèi)Nrf2熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，Caspase-1熒光強(qiáng)度顯著減弱(P<0.05)；而相較于MCT2組，MCT2+ML385組細(xì)胞內(nèi)Nrf2熒光強(qiáng)度顯著減弱，Caspase-1熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.05)，見圖7。

圖7 免疫熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞Nrf2與Caspase-1表達(dá)(比例尺=50μm)

3 討 論

目前，視網(wǎng)膜缺血再灌注已被公認(rèn)為各種視網(wǎng)膜疾病的關(guān)鍵病理因素，包括視網(wǎng)膜血管阻塞、急性青光眼、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。急性青光眼作為最常見且最危險(xiǎn)的眼部疾病，主要是由眼內(nèi)壓的快速升高和降低引起的，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、軸突損傷和后續(xù)的視力喪失。盡管濾過手術(shù)和降壓藥等降低眼壓的策略在臨床實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用，但一些開角型青光眼患者無法通過降低眼壓獲得有效治療，此外，降低眼壓的藥物如前列腺素類似物和縮瞳劑等，會(huì)產(chǎn)生各種局部或全身性副作用，從而限制了這類藥物的臨床應(yīng)用[4]。因此，探索視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中相關(guān)的分子機(jī)制以開發(fā)安全有效的治療靶點(diǎn)，并對(duì)促進(jìn)視網(wǎng)膜缺血再灌注介導(dǎo)的其他視網(wǎng)膜疾病的預(yù)防與治療均具有重大意義。

SLC16由MCT家族的14個(gè)成員組成，這些成員在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞代謝和pH調(diào)節(jié)中均發(fā)揮著重要作用，與激素、脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關(guān)。近年來，MCT1～4被研究者們進(jìn)行了大量且廣泛的研究，已揭示其參與了L-乳酸、丙酮酸、短鏈脂肪酸和單羧酸在各種組織中質(zhì)子依賴型的轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。此外，MCT1、MCT 2和MCT 4在多種癌癥中過度表達(dá)，并與癌癥的預(yù)后惡化有關(guān)，抑制其表達(dá)可作為癌癥的一種新治療策略。MCT2在肝臟、腎、腦、心臟、脾臟等多種組織中表達(dá)，與一些疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如Harun-Or-Rashid等[6]通過將攜帶MCT2的AAV2腺相關(guān)病毒注射入青光眼模型中以提高M(jìn)CT2表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，MCT2促進(jìn)了高眼壓期間單羧酸鹽在視網(wǎng)膜中的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，改善能量穩(wěn)態(tài)并維持視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的線粒體功能，這一結(jié)果提示MCT2可能在改善視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷方面也發(fā)揮積極作用。

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡是包括青光眼在內(nèi)的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷引發(fā)的疾病中的主要變化，此外，急性青光眼的眼壓升高與視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡呈正相關(guān)[7]。細(xì)胞焦亡即炎癥性程序性細(xì)胞死亡，對(duì)于防御病原微生物和機(jī)體危險(xiǎn)信號(hào)至關(guān)重要。當(dāng)遭受缺血性損傷時(shí)，受損組織會(huì)釋放危險(xiǎn)信號(hào)，激活NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體，活化的NLRP3炎癥小體隨后裂解gasdermin D(GSDMD)蛋白，同時(shí)激活下游Caspase-1而催化炎癥因子IL-1β等的成熟和釋放，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡發(fā)生。然而，過度的細(xì)胞焦亡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不斷腫脹和裂解，從而致使細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放，從而引發(fā)強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)[8]。在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞凋亡與焦亡的分子機(jī)制有所不同但又存在著一定聯(lián)系，腫瘤細(xì)胞焦亡機(jī)制在一定刺激下會(huì)被啟動(dòng)，且在細(xì)胞焦亡現(xiàn)象中有檢測(cè)到Caspase-1通路的激活，而Caspase-1能夠進(jìn)一步激活caspase-3/7誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。而在H/R誘導(dǎo)的各種組織細(xì)胞損傷中抑制細(xì)胞凋亡途徑的激活及焦亡相關(guān)因子的表達(dá)，可降低炎癥與組織損傷，減緩疾病病程的發(fā)展[10]。本研究結(jié)果顯示，在H/R誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中過表達(dá)MCT2后，細(xì)胞增殖活性得到提高，細(xì)胞凋亡率減少，促凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)下調(diào)而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β表達(dá)均下調(diào)，由此說明，MCT2抑制了H/R處理下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡與焦亡。

本研究經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，H/R處理下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Nrf2熒光強(qiáng)度減弱而Caspase-1熒光強(qiáng)度升高，而在H/R誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中過表達(dá)MCT2后，細(xì)胞中Nrf2熒光強(qiáng)度增加，Caspase-1熒光強(qiáng)度減弱。Nrf2是全身抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，在正常情況下，Nrf2與具有CNC同源性(ECH)相關(guān)蛋白1(Keap1)的Kelch樣紅細(xì)胞衍生蛋白結(jié)合作為復(fù)合物，并被限制在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行泛素化和蛋白酶體降解；而在壓力條件下，Nrf2與Keap1分離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與DNA啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，啟動(dòng)ARE控制的抗氧化酶轉(zhuǎn)錄[11]。大量研究表明，激活Nrf2在眼神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用，例如，富馬酸單甲酯在缺血再灌注損傷后通過激活Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮視網(wǎng)膜神經(jīng)元保護(hù)作用，明顯改善了Nrf2調(diào)節(jié)的抗氧化基因的表達(dá)，降低了炎癥基因的表達(dá)，減少了神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中神經(jīng)元細(xì)胞損傷，并改善了小鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后視網(wǎng)膜功能；MicroRNA-141作為Keap1的靶向抑制劑，可在紫外線誘導(dǎo)后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中引發(fā)Nrf2激活和細(xì)胞核易位，使ARE控制的抗氧化基因轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)，從而減弱紫外線誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡[12]。因此推測(cè)，在本研究中MCT2可能是通過激活Nrf2發(fā)揮了對(duì)H/R處理下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該作用，通過以Nrf2抑制劑ML385抑制Nrf2激活后，MCT2對(duì)H/R處理下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用消失或減弱。

綜上所述，H/R處理可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及焦亡，使細(xì)胞增殖活性下降，而MCT2能夠減輕H/R處理下細(xì)胞凋亡與焦亡，從而達(dá)到保護(hù)視網(wǎng)膜的作用，該作用可能是通過介導(dǎo)Nrf2激活實(shí)現(xiàn)的。本研究為視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷以及其他視網(wǎng)膜相關(guān)疾病的治療研究提供了分子機(jī)制及理論依據(jù)，但關(guān)于MCT2在該體內(nèi)試驗(yàn)中是否同樣發(fā)揮作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。