間隙連接蛋白45與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性分析

朱建華， 錢筱健， 顧夢會， 袁 政

(江蘇省蘇州市立醫(yī)院腸胃外科， 江蘇 蘇州 215002)

結(jié)直腸癌發(fā)病率居我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤第五位，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，且約有1/3的患者確診時臨床分期已達(dá)到Ⅲ期或出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。盡管手術(shù)技術(shù)、化療藥物的發(fā)展使結(jié)直腸癌患者生存率得到顯著提高，但結(jié)直腸癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)率仍高達(dá)20%～45%，是影響患者遠(yuǎn)期預(yù)后的重要原因[2]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療理念的愈發(fā)深入，越來越多的學(xué)者開始嘗試探索評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的精準(zhǔn)指標(biāo)，并明確影響患者臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)因素，以期評估患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險，進(jìn)而指導(dǎo)個體化治療[3]。間隙連接蛋白45(Cx45)是Cx家族的成員之一，其基因?qū)俚诙愐职┗?，既往研究顯示，Cx45表達(dá)異常與鼻咽癌發(fā)病及進(jìn)展有關(guān)[4]。此次研究采用組織芯片技術(shù)就結(jié)直腸癌患者Cx45表達(dá)進(jìn)行檢測，旨在借助組織芯片大規(guī)模、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)勢，明確Cx45在不同細(xì)胞及組織內(nèi)表達(dá)情況，了解其與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)聯(lián)，為結(jié)直腸癌患者預(yù)后預(yù)測及個體化治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象：選擇本院2016年1月至2019年1月收治的97例結(jié)直腸癌患者，開展病例對照研究。病例入組標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)腸鏡及病理組織學(xué)檢查明確結(jié)直腸癌診斷：病理組織標(biāo)本鏡下檢查可見結(jié)直腸黏膜上皮來源，具有惡性形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞和(或)結(jié)構(gòu)，穿過黏膜肌層、浸潤黏膜下層；②符合結(jié)直腸癌外科手術(shù)治療指證；③入組前未接受結(jié)直腸癌相關(guān)外科治療或放化療等治療；④具備配合研究的能力及意愿。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前4周內(nèi)出現(xiàn)感染或急性炎癥；②入組前1周內(nèi)有抗凝或促凝藥物使用史；③合并其他部位惡性腫瘤；④合并心、腎等臟器嚴(yán)重功能不全；⑤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。97例患者中，男53例，女44例，年齡54～86歲，平均(72.95±5.71)歲，腫瘤直徑2.6～8.1cm，平均(5.51±0.36)cm。本研究已征得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲取患者知情同意。

1.2研究方法：97例患者均接受結(jié)直腸癌根治術(shù)治療。術(shù)中取其病灶組織、癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織，以4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)系列切片，每隔10片取連續(xù)4片，厚度6μm，以多聚賴氨酸載玻片貼片。將97份組織蠟塊切成厚度4μm的切片，使用烘箱以60℃烤片1h，行HE染色。顯微鏡下對病灶組織、癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織進(jìn)行標(biāo)記，切片后分別轉(zhuǎn)移至載玻片上，完成組織芯片制作。將組織芯片置入烘箱內(nèi)，以60℃烤片1h，行二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化；向蒸鍋內(nèi)加入枸櫞酸鈉0.01moL，加熱至95℃，放入組織芯片，加熱5min完成抗原熱修復(fù)，自然冷卻；使用PBS溶液漂洗5min，重復(fù)3次后滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育30min后加入兔抗人Cx45單克隆抗體(1∶100)，以4℃孵育過夜。取出標(biāo)本，復(fù)溫后以PBS溶液漂洗5min，重復(fù)3次后加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶200)室溫孵育1h，漂洗3次后加入SABC孵育1h，再次漂洗3次，行DAB顯色、蘇木素復(fù)染、PBS返藍(lán)，以及梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封固處理。觀察病灶組織、癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)Cx45陽性染色情況，陽性染色呈淡黃色、黃色或棕褐色，染色強(qiáng)度淡黃色判定為低表達(dá)，計(jì)1分，黃色為中表達(dá)，計(jì)2分，棕褐色為高表達(dá)，計(jì)3分。此外，通過電話隨訪、門診隨診等方式，對患者進(jìn)行長期隨訪，隨訪時間≥3年，記錄患者隨訪期間總生存時間(OS)、無進(jìn)展生存時間(PFS)，PFS定義為患者從接受治療開始，至觀察到疾病進(jìn)展或者發(fā)生因?yàn)槿魏卧虻乃劳鲋g的這段時間。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)直腸癌患者病灶組織、癌旁組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織Cx45表達(dá)情況：共獲取病灶組織、癌旁組織各97份，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織86份。病灶組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織Cx45表達(dá)情況比較，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，病灶組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織Cx45高表達(dá)率均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者病灶組織癌旁組織轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織Cx45表達(dá)情況n(%)

2.2不同臨床病理特征患者病灶組織Cx45表達(dá)情況：不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同分化程度、不同TNM分期直腸癌患者病灶組織Cx45表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征患者病灶組織Cx45表達(dá)情況比較n(%)

2.3不同病灶組織Cx45表達(dá)患者預(yù)后：病灶組織Cx45高表達(dá)患者OS及PFS均較中低表達(dá)者更短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同病灶組織Cx45表達(dá)患者預(yù)后比較

2.4影響因素分析：Cox回歸模型結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、病灶組織Cx45高表達(dá)均為影響結(jié)直腸癌患者OS的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。見表4、表5。

表4 多因素Cox回歸分析賦值表

表5 影響結(jié)直腸癌患者OS的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展伴隨著大量復(fù)雜的生理及病理變化，并以致癌基因激活、腫瘤微環(huán)境形成為主，上述變化直接影響著細(xì)胞增生，并誘導(dǎo)病變向惡性轉(zhuǎn)化[5]。既往研究顯示，間隙連接蛋白在消化道黏膜損傷至組織化生、癌變過程中發(fā)揮了重要影響：多個同型或異型間隙連接蛋白單體可共同構(gòu)成細(xì)胞間隙連接通道，為小分子和代謝產(chǎn)物的通過提供路徑，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長、分化及凋亡[6]。其中，Cx26表達(dá)水平的下調(diào)被認(rèn)為與結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差有關(guān)[7]。

此次研究就結(jié)直腸癌患者Cx45表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，結(jié)直腸癌病灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織Cx45高表達(dá)率均更高，說明Cx45表達(dá)上調(diào)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其機(jī)制可能與成纖維細(xì)胞活化所致Cx45表達(dá)水平上升有關(guān)[8]。同時，高表達(dá)Cx45可實(shí)現(xiàn)Wnt信號的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，重建細(xì)胞間隙連接，發(fā)揮一定的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用[9]。本研究結(jié)果顯示，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶組織低分化，以及TNM分期Ⅲ～Ⅳ結(jié)直腸癌患者病灶組織Cx45表達(dá)水平更高，在印證上述結(jié)論的同時，也表明Cx45可能是結(jié)腸癌重要的促癌因子[10]。動物實(shí)驗(yàn)表明，敲除Cx45基因有助于抑制人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株的增殖和侵襲[11]，表明Cx45有望成為惡性腫瘤的重要治療靶點(diǎn)之一，針對結(jié)直腸癌患者研發(fā)下調(diào)Cx45表達(dá)水平的靶向治療方案，將有望為患者預(yù)后的改善提供新的思路。

為印證Cx45表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響，此次研究就Cx45高表達(dá)、中低表達(dá)患者OS、PFS進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，Cx45高表達(dá)者OS及PFS均更短，說明Cx45高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其機(jī)制可能為：Cx45在細(xì)胞縫隙連接通訊(GJIC)環(huán)節(jié)可能發(fā)揮抑制作用，Cx45表達(dá)的上升伴隨著細(xì)胞與正常分化、增殖軌道的脫離，進(jìn)而導(dǎo)致正常GJIC無法形成、GJIC功能無法有效發(fā)揮，此時正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞趨向于出現(xiàn)惡性、轉(zhuǎn)移潛能，惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險也隨之上升[12,13]。同時，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Cx45不僅可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲力、附著力，也是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移的重要因子[14]。因此，病灶組織Cx45高水平表達(dá)可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者根治性切除術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險上升，進(jìn)而直接對患者預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響[15]。本研究Cox回歸分析結(jié)果顯示，除淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期等公認(rèn)指標(biāo)外，病灶組織Cx45高表達(dá)也使患者預(yù)后不良風(fēng)險上升36.416倍，印證了上述結(jié)論。

綜上所述，不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期結(jié)直腸癌患者病灶組織Cx45表達(dá)存在明顯差異，除臨床病理特征外，病灶組織Cx45高表達(dá)也與患者OS縮短直接相關(guān)。在今后的臨床實(shí)踐中，可嘗試基于病灶組織Cx45表達(dá)狀態(tài)評估患者預(yù)后并指導(dǎo)個體化診療策略的制定，同時進(jìn)一步探索抑制Cx45表達(dá)的靶向治療方案，將有望為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的思路。