硒對樹突狀細胞和巨噬細胞功能的調(diào)控作用

景麗榮，張 超，喬 杰，海尼斯格，楊 英，高珍珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018)

硒是動物必需的營養(yǎng)元素，也是植物有益的營養(yǎng)元素，具有抗氧化、抗癌、增強免疫功能等生物學(xué)作用。當動物攝取硒不足時可引起多種疾病，如癌癥、克山骨病、心血管疾病等，對動物的身體健康造成危害的同時，也對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。硒不能由機體自主合成，只能從體外攝取，因此在畜牧生產(chǎn)中，常常會把亞硒酸鈉作為添加劑，用來補充動物機體需要的微量元素硒，再通過氧化還原反應(yīng)或復(fù)雜的生物酶反應(yīng)等使其被機體吸收并利用。有研究發(fā)現(xiàn)，硒對T、B細胞的免疫功能和巨噬細胞的抗氧化功能具有調(diào)節(jié)作用，同時可抑制肺癌細胞增殖和遷移。樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)和巨噬細胞是參與調(diào)節(jié)免疫刺激和耐受的重要抗原提呈細胞，在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。然而，硒對DCs和巨噬細胞免疫功能的影響報道少見，因此，本試驗以髓源性樹突狀細胞(bone marrow derived dendritic cells, BMDCs)和腹腔巨噬細胞為靶細胞，探究硒對樹突狀細胞和巨噬細胞的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

亞硒酸鈉購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司(批號：W5070)； RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco(批號：8120038)；小牛血清購自四季青有限公司(批號：20060502)青鏈霉素購自Biological Industries(批號：1950172)；噻唑藍(MTT)，購自Solarbio公司(批號：CM27191620)；二甲基亞砜(DMSO)購自Coolaber科技有限公司(批號：CD281315200)；Phagocytosis Assay Kit購自Thermo公司(批號：2160425)；rmGM-CSF(批號：BJ2418061)和rmIL-4(批號：BC1918101)購自RD Systems公司；小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒購自天津顥洋生物制品有限公司；Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32(批號：0160289)、PE-Cy7 Hamster Anti-Mouse CD11c(批號：9345738)、488 Rat Anti-Mouse I-A/I-E(批號：1004521)、PE Mouse Anti-Rat CD86(批號：9338081)、BV421 Hamster Anti-Mouse CD80(批號：0009143)、APC Rat anti-Mouse CD40(批號：9128909)和7-AAD(批號：0017296-A)購自BD Pharmingen；IL-10、IL-12、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ和NO的ELISA試劑盒購自酶免公司(批號：212104)。

1.2 主要儀器

酶聯(lián)免疫檢測儀購自Thermo公司；L420離心機購自上海生物科技有限公司；CytoFLEX流式細胞儀購自Beckman公司；DMi 1倒置顯微鏡購自LEICA公司。

1.3 硒對小鼠未成熟BMDCs的影響

1.3.1 小鼠未成熟BMDCs的制備 未成熟BMDCs取自4～6周齡KM小鼠脛骨和股骨的骨髓，重懸于含有10%小牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，未成熟BMDCs制備完成。

1.3.2 硒對小鼠未成熟BMDCs安全濃度的測定 將制備的未成熟BMDCs細胞濃度調(diào)整為2.5×10個·mL，加入至96孔板(100 μL·孔)，分別加入不同質(zhì)量濃度的硒，硒以亞硒酸鈉的形式添加 (將硒用細胞培養(yǎng)液分別從45.66 mg·L倍比稀釋至0.02 mg·L，共11個濃度梯度，加入細胞孔后的終濃度依次為22.83、11.42、5.71、2.85、1.43、0.72、0.36、0.18、0.09、0.04、0.02 mg·L)，每個濃度組100 μL·孔，并重復(fù)6個孔，另設(shè)空白組(blank group, BG)，只加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液。在37 ℃、50 mL·LCO條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入30 μL MTT(5 g·L)。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO，輕晃10 min，用酶聯(lián)免疫儀檢測570 nm處的吸光值。當硒最大質(zhì)量濃度在570 nm處的吸光值不顯著低于空白組(BG)時，作為硒對未成熟BMDCs最大安全質(zhì)量濃度。測得硒的最大安全質(zhì)量濃度為1.43 mg·L，選擇最大安全質(zhì)量濃度倍比稀釋5個質(zhì)量濃度，進行以下相關(guān)試驗，因此硒的質(zhì)量濃度選取范圍是1.43～0.09 mg·L。

1.3.3 硒對小鼠未成熟BMDCs吞噬活性測定 將制備的未成熟BMDCs濃度調(diào)整為每毫升2.5×10個細胞，加入到12孔板中(1 mL·孔)。貼壁15 h后，棄去非貼壁細胞，在每個細胞孔中分別加入1 mL的硒(1.43、0.72、0.36、0.18、0.09 mg·L)、LPS和PHA(5和10 mg·L)，另設(shè)空白組(BG)，只加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液，每個濃度組重復(fù)3個孔。在37 ℃、50 mL·LCO條件下培養(yǎng)46 h，收集細胞，分別加入200 μL FITC標記的大腸桿菌，避光孵育2 h后, 2 000 r·min離心5 min，PBS洗滌2次，在流式細胞儀中檢測各組細胞熒光強度。

1.4 硒對小鼠成熟BMDCs的影響

1.4.1 小鼠成熟BMDCs的制備 將制備的未成熟BMDCs細胞濃度調(diào)整為1.6×10個·mL，加入至6孔板中(2 mL·孔)，在37 ℃、CO濃度為50 mL·L條件下培養(yǎng)15 h后，棄去非貼壁細胞，加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)液(含有10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素、25 mg·LrmGM-CSF和25 mg·LrmIL-4)，然后隔天半量更換培養(yǎng)液，7 d后成熟BMDCs制備完成。

1.4.2 硒對成熟BMDCs表型測定 將硒(1.43、0.72、0.36、0.18、0.09 mg·L)、LPS和PHA(5和10 mg·L)分別加入到培養(yǎng)至第7天的成熟BMDCs，另設(shè)空白組(BG)，只加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液，每個濃度組重復(fù)3個孔。在37 ℃、50 mL·LCO條件下培養(yǎng)48 h后收集成熟BMDCs，先與CD16/32共孵育10 min，再與5種熒光素偶聯(lián)抗體(PE-Cy CD11c、488 I-A/I-E、PE CD86、BV421 CD80和APC CD40)混合液在4 ℃避光條件下孵育染色30 min后，加入7-AAD標記死亡細胞，在流式細胞儀中檢測各組細胞熒光強度。

1.4.3 硒對成熟BMDCs上清液中細胞因子含量的測定 如“1.4.1”制備小鼠成熟BMDCs，按“1.4.2” 進行分組處理，收集經(jīng)硒(1.43、0.72、0.36、0.18、0.09 mg·L)、LPS和PHA(5和10 mg·L)處理后的細胞，每個濃度組重復(fù)5個孔，離心收取各組成熟BMDCs上清液，并根據(jù)ELISA試劑盒按說明書檢測IL-10、IL-12、IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的含量水平。

1.4.4 硒對成熟BMDCs刺激同種異體淋巴細胞增殖能力的測定 取無菌KM小鼠脾，研磨成勻漿，用小鼠脾淋巴細胞分離液試劑盒提取脾淋巴細胞，調(diào)整脾細胞濃度至2.5×10個·mL。如“1.4.1”制備小鼠成熟BMDCs，按“1.4.2”進行分組處理，將制備好的脾淋巴細胞加入到經(jīng)硒(1.43、0.72、0.36、0.18、0.09 mg·L)、LPS和PHA(5和10 mg·L)處理后的細胞孔中(1 mL·孔)，在37 ℃、50 mL·LCO條件下共同培養(yǎng)44 h后, 添加600 μL MTT, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去孔內(nèi)液體，加入2 mL DMSO，吹打均勻后，吸100 μL至96孔板中，每個濃度組重復(fù)6個孔，在570 nm波長處測量其吸光度值。

1.4.5 硒對成熟BMDCs抗原呈遞能力的測定 KM小鼠每20 g體重皮下接種100 μg OVA，2周后收集脾淋巴細胞，調(diào)整細胞濃度至2.5×10個·mL。如“1.4.1”制備小鼠成熟BMDCs，按“1.4.2”進行分組處理，將制備好的脾淋巴細胞加入到經(jīng)硒(1.43、0.72、0.36、0.18、0.09 mg·L)、LPS和PHA(5和10 mg·L) 處理后的細胞孔中(1 mL·孔)，在37 ℃、50 mL·LCO條件下共同培養(yǎng)44 h后, 加入600 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去孔內(nèi)液體，加入2 mL DMSO，吹打均勻后，吸100 μL至96孔板中，每個濃度組重復(fù)6個孔，在570 nm波長處測量其吸光度值。

1.5 硒對腹腔巨噬細胞的影響

1.5.1 硒對腹腔巨噬細胞的吞噬活性的測定 小鼠每20 g體重腹腔內(nèi)注射1 mL 6%淀粉溶液，48 h后收集小鼠腹腔巨噬細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為2.5×10個·mL,接種于12孔板(1 mL·孔),15 h后棄去非貼壁細胞，在每個細胞孔中分別加入1 mL的硒(1.43、0.72、0.36、0.18、0.09 mg·L)、LPS和PHA(終濃度分別為5和10 mg·L)，另設(shè)空白組(BG)，只加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液，每個濃度組重復(fù)3個孔。在37 ℃、50 mL·LCO的條件下培養(yǎng)46 h，收集細胞，分別加入200 μL FITC標記的大腸桿菌，繼避避光孵育2 h后, 2 000 r·min離心5 min，PBS洗滌2次，在流式細胞儀中檢測各組細胞熒光強度。

1.5.2 硒對腹腔巨噬細胞上清液中細胞因子含量的測定 同“1.5.1”制備并處理腹腔巨噬細胞，每個濃度組重復(fù)5個孔，于37 ℃、50 mL·LCO的條件下培養(yǎng)48 h，收集細胞，離心收取各組小鼠腹腔巨噬細胞上清液，并根據(jù)ELISA試劑盒按說明書檢測IL-6、IL-10、NO、TNF-α和IFN-γ的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0中的One-way ANOVA程序進行單因素方差分析，Dunkan氏法進行多重比較，試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示，用<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 硒對小鼠未成熟BMDCs安全濃度的分析

當硒最大質(zhì)量濃度在570 nm處的吸光值不顯著低于空白組(BG)時，作為硒對未成熟BMDCs最大安全質(zhì)量濃度。由圖1可知，當硒的質(zhì)量濃度在1.43 mg·L時，吸光值顯著高于空白組(<0.05)，因此對于未成熟BMDCs，硒最大安全質(zhì)量濃度為1.43 mg·L。在以下的試驗中，硒選擇的質(zhì)量濃度為1.43、0.72、0.36、0.18和0.09 mg·L。

所標字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，下表同Different letters mean significant difference among treatments(P<0.05), same letter means no significant difference among treatments(P>0.05). The same as below圖1 硒對未成熟BMDCs的安全濃度(n=6)Fig.1 The safe concentration of selenium on immature BMDCs(n=6)

2.2 硒對小鼠未成熟BMDCs吞噬活性分析

由圖2B可知，當硒的質(zhì)量濃度為0.36～0.09 mg·L時，未成熟BMDCs吞噬活性顯著高于空白組、LPS和PHA組，且當質(zhì)量濃度0.18 mg·L時，吞噬活性最強，顯著高于其他各組(<0.05)，達到61.19%。

A.未成熟BMDCs的吞噬活性流式圖；B.未成熟BMDCs的吞噬活性統(tǒng)計圖A.Flow chart of phagocytic activity of immature BMDCs; B.Statistical chart of phagocytic activity of immature BMDCs圖2 硒對未成熟BMDCs吞噬活性的影響(n=3)Fig.2 Effect of selenium on phagocytic activity of immature BMDCs (n=3)

2.3 硒對成熟BMDCs表型分析

由圖3可知，成熟BMDCs的MHCⅡ、CD86和CD80的表達量隨硒質(zhì)量濃度的遞減呈現(xiàn)遞增趨勢，且當硒的質(zhì)量濃度為0.09 mg·L時，均顯著高于空白組(<0.05)，而當硒的質(zhì)量濃度為0.09 mg·L時，MHCⅡ的表達量還顯著高于LPS和PHA組(<0.05)，而CD40的表達量在不同硒處理組中雖然與空白組沒有顯著差異(>0.05)，但有明顯上升的趨勢。

A.成熟BMDCs的表型流式圖；B.成熟BMDCs的表型統(tǒng)計圖A.Flow chart of phenotype of mature BMDCs; B.Statistical chart of phenotype of mature BMDCs圖3 硒對成熟BMDCs表型的影響(n=3)Fig.3 Effect of selenium on phenotype of mature BMDCs(n=3)

2.4 硒對成熟BMDCs上清中細胞因子含量的分析

由圖4可知，隨著硒質(zhì)量濃度的遞減，IFN-γ的含量呈遞增趨勢，當質(zhì)量濃度為0.36～0.09 mg·L時，IFN-γ的含量顯著高于空白組，且質(zhì)量濃度在0.18～0.09 mg·L時，顯著高于LPS、PHA組及其他各組(<0.05)；當硒的質(zhì)量濃度為0.18～0.09 mg·L時，IL-12的含量顯著高于空白組，當濃度為0.18 mg·L時，IL-12的含量最高且顯著高于其他各組(<0.05)；隨著硒質(zhì)量濃度的遞減，TNF-α的含量呈遞減趨勢，且當硒的質(zhì)量濃度為0.36～0.09 mg·L時，TNF-α的含量顯著低于空白組、LPS和PHA組(<0.05)；IL-10在硒的質(zhì)量濃度為0.09 mg·L時，其含量最高且顯著高于除PHA組外的其他各組(<0.05)；當硒的質(zhì)量濃度為1.43～0.72 mg·L時，IL-6和IL-1β的含量顯著低于其他各組(<0.05)，硒的質(zhì)量濃度為0.36～0.09 mg·L時，IL-6和IL-1β的含量雖然明顯升高，但與空白組無顯著性差異(>0.05)。

A.IFN-γ的含量；B.IL-12的含量；C.TNF-α的含量；D.IL-10的含量；E.IL-1β的含量；F.IL-6的含量A.IFN-γ content; B.IL-12 content; C.TNF-α content; D.IL-10 content; E.IL-1β content; F.IL-6 content圖4 硒對成熟BMDCs上清液中細胞因子含量的影響(n=5)Fig.4 Effect of selenium on cytokine content in supernatant of mature BMDCs(n=5)

2.5 硒對成熟BMDCs刺激同種異體淋巴細胞增殖能力的分析

由圖5A可知，硒對成熟BMDCs刺激同種異體淋巴細胞增殖能力隨硒質(zhì)量濃度的遞減，呈現(xiàn)遞增趨勢。當硒質(zhì)量濃度為0.09 mg·L時，成熟BMDCs刺激同種異體淋巴細胞增殖能力顯著高于除PHA組之外的其他各組(<0.05)。

A.同種異體淋巴細胞的增殖；B.抗原呈遞能力A. Proliferation of allogeneic lymphocytes; B. Ability of antigen presenting圖5 硒對成熟BMDCs刺激同種異體淋巴細胞增殖和抗原呈遞能力的影響(n=6)Fig.5 Effects of selenium stimulated on proliferation of allogeneic lymphocytes and ability of antigen presentation by mature BMDCs(n=6)

2.6 硒對成熟BMDCs抗原呈遞能力的分析

由圖5B可知，隨硒質(zhì)量濃度的遞減，硒對成熟BMDCs抗原呈遞的能力呈現(xiàn)遞增趨勢。當硒質(zhì)量濃度為0.09 mg·L時，成熟BMDCs抗原遞呈能力最高，且顯著高于其他各組(<0.05)。

2.7 硒對腹腔巨噬細胞吞噬活性的分析

當硒的質(zhì)量濃度為0.18～0.09 mg·L時，腹腔巨噬細胞吞噬活性顯著高于空白組和LPS組(<0.05)，且當質(zhì)量濃度為0.09 mg·L時，吞噬活性顯著強于除PHA組之外的其他各組，達到71.85%(圖6)。

A.腹腔巨噬細胞的吞噬活性流式圖；B.腹腔巨噬細胞的吞噬活性統(tǒng)計圖A. Flow chart of phagocytic activity of peritoneal macrophage; B. Statistical chart of phagocytic activity of peritoneal macrophage圖6 硒對腹腔巨噬細胞吞噬活性的影響(n=3)Fig.6 Effect of selenium on phagocytic activity of peritoneal macrophage(n=3)

2.8 硒對腹腔巨噬細胞上清中細胞因子含量的分析

由圖7可知，硒的各組質(zhì)量濃度組中IL-6的含量顯著低于空白組(BG)(<0.05)；當硒的質(zhì)量濃度為0.72～0.09 mg·L時，IL-10的含量顯著低于空白組(BG)和LPS組(<0.05)；當硒的質(zhì)量濃度為0.72 mg·L時，TNF-α的含量顯著高于空白組(BG)(<0.05)；當硒的質(zhì)量濃度為0.36～0.09 mg·L時，IFN-γ的含量顯著高于空白組(BG)(<0.05)；當硒的質(zhì)量濃度為0.72～0.09 mg·L時，NO的含量顯著高于空白組(BG)(<0.05)，且在質(zhì)量濃度為0.18 mg·L時含量最高。

A. IL-6的含量；B. IL-10的含量；C. TNF-α的含量；D. IFN-γ的含量；E. NO的含量A. IL-6 content; B.IL-10 content; C.TNF-α content； D. IFN-γ content; E. NO content圖7 硒對腹腔巨噬細胞上清液中細胞因子含量的影響(n=5)Fig.7 Effect of selenium on cytokine content in supernatant of peritoneal macrophages(n=5)

3 討 論

樹突狀細胞(DCs)發(fā)現(xiàn)于1973年，是機體最強大的抗原提呈細胞，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動中起主要作用，參與一系列微生物病原體的防御。根據(jù)表型和功能成熟水平, 樹突狀細胞分為未成熟和成熟DCs。在不成熟狀態(tài)下，樹突狀細胞可以不斷地吸收各種自身抗原和外源抗原，具有較強的吞噬活性。在攝取抗原或受到某些因素刺激時會分化為成熟DCs，成熟DCs不僅可以啟動抗原特異性免疫，還可以誘導(dǎo)并維持對自身組織抗原的特異性耐受。機體的特異性免疫反應(yīng)是由抗原提呈細胞攝取抗原并在細胞內(nèi)進行處理，然后將抗原信息呈遞給T和B淋巴細胞，刺激T和B細胞增殖，進而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生各種抗原特異性抗體，在細胞免疫和體液免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并且高表達抗原遞呈分子MHCⅡ和共刺激因子CD86、CD80和CD40。

吞噬是生物最古老、最基本的防御機制之一，是單細胞生物最基本的營養(yǎng)過程。當DCs分化成熟后，吞噬能力降低，但由于MHCⅡ類分子的高表達，其抗原捕獲和呈遞能力就有相應(yīng)的增強，同時CD86、CD80和CD40作為DCs的共刺激因子，表達量上調(diào)可誘導(dǎo)T細胞的活化。本研究表明，在硒的安全質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著硒質(zhì)量濃度的降低，未成熟的BMDCs吞噬活性和腹腔巨噬細胞的吞噬活性顯著增強，吞噬活性最高分別能達到61.19%和71.85%。當未成熟BMDCs分化成熟后，表面分子MHCⅡ和共刺激分子CD86和CD80表達量顯著高于空白組，CD40的表達量也明顯增高。當硒質(zhì)量濃度為0.09 mg·L時，BMDCs刺激同種異體淋巴細胞增殖能力和抗原呈遞能力顯著增強。

細胞因子是由多種組織細胞合成分泌的小分子多肽或糖蛋白，具有多種生物學(xué)功能，可以直接表征細胞功能。輔助T細胞(TH)為免疫系統(tǒng)的其他細胞提供輔助功能，在免疫應(yīng)答中起重要作用，而1型輔助性T細胞(Th1)、2型輔助性T細胞(Th2)和17型輔助性T細胞(Th17)是TH的效應(yīng)細胞亞群，一般認為Th細胞前體在抗原的刺激下，Th0細胞選擇性分化為Th1、Th2或TH17細胞。當DCs和巨噬細胞受到刺激時，會分泌各種細胞因子，其中IFN-γ、IL-12和TNF-a是Th1 CD4和CD8T細胞分化的標志，IL-10、IL-6和IL-1β可誘導(dǎo)Th2和Th17分化，主要作為防御細胞內(nèi)外病原體的免疫防線。巨噬細胞被激活時可產(chǎn)生大量NO，具有細胞毒性作用，可殺死細胞內(nèi)的細菌、寄生蟲和腫瘤細胞等，因此，NO分泌的增加可以直接反應(yīng)巨噬細胞的生理功能。本試驗結(jié)果顯示，一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的硒作用于BMDCs和腹腔巨噬細胞，在其上清液中IFN-γ的含量均隨硒質(zhì)量濃度的遞減而增多；在成熟BMDCs上清液中，IL-12的含量在硒的質(zhì)量濃度為0.18 mg·L時含量最高，IL-10隨硒質(zhì)量濃度的遞減而增多，TNF-α的含量隨硒質(zhì)量濃度遞減而降低，IL-6和IL-1β雖然也隨硒質(zhì)量濃度的遞減而增多，但從硒的質(zhì)量濃度0.36 mg·L時與空白組沒有顯著差異；在腹腔巨噬細胞上清液中，NO的含量在硒的質(zhì)量濃度為0.18 mg·L時含量最高，IL-10的含量隨硒質(zhì)量濃度遞減而降低，IL-6的含量隨硒質(zhì)量濃度遞減而增高，TNF-α的含量在硒的質(zhì)量濃度為0.72 mg·L時含量最高。分析細胞因子含量結(jié)果表明，在硒的作用下，DCs和巨噬細胞對TH1型和TH2型免疫應(yīng)答均有促進作用，并且對TH1型免疫應(yīng)答的促進作用更加明顯。

4 結(jié) 論

綜上所述，一定質(zhì)量濃度的硒可以增強對樹突狀細胞和巨噬細胞的調(diào)控作用，且以濃度為0.18～0.09 mg·L時，效果更加顯著，因此值得進一步探究硒對機體免疫功能的影響。