液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討白鮮皮治療濕疹的作用機(jī)制＊

石 蕓，徐 華，徐長麗，金俊杰，秦昆明＊＊，高 珣，李偉東＊＊

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210046；2. 江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院 連云港 222005；3. 南京海源中藥飲片有限公司 南京 210061）

1 引言

白鮮皮為蕓香科植物白鮮Dictamnus dasycarpusTurcz.的干燥根皮，味苦，性寒，有清熱燥濕，祛風(fēng)解毒之功效。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，白鮮皮中主要含有檸檬苦素類、黃酮類、生物堿類和揮發(fā)油類成分[1]。白鮮皮中檸檬苦素類成分具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種藥理活性[2]。生物堿類成分有著良好的抗炎作用，如白鮮堿對(duì)炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用[3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白鮮皮揮發(fā)油中烯烴類成分相對(duì)含量最高，以單萜類成分為主，其次是倍半萜類成分[4]，這類化合物與白鮮皮的抑菌、抗腫瘤和抗炎活性有關(guān)[5]。

白鮮皮臨床常用于濕疹等多種皮膚病的治療，療效確切。裴小平等研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度白鮮皮提取液均可改善濕疹模型小鼠的皮膚損害，而高濃度的白鮮皮提取液與地塞米松洗劑效果相當(dāng)；其機(jī)制可能與下調(diào)炎癥因子IL-17 和IL-22、上調(diào)IL-10 的表達(dá)相關(guān)[6]。楊旭等[7]以大鼠白鮮皮組與模型組比較，大鼠的皮損評(píng)分明顯下降，濕疹臨床表現(xiàn)為紅斑、丘疹、抓痕/剝脫均出現(xiàn)減輕的現(xiàn)象。同時(shí)指出白鮮皮治療濕疹具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但現(xiàn)階段白鮮皮治療濕疹作用機(jī)制沒有得到充分研究。為了進(jìn)一步研究揭示白鮮皮臨床用于治療濕疹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，本文采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）分析白鮮皮中主要成分組成，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)研究主要潛在活性成分的作用靶點(diǎn)和作用通路，從而闡明其藥效作用機(jī)制。

2 研究思路與方法

通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）對(duì)白鮮皮主要成分進(jìn)行分析，結(jié)合文獻(xiàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行成分快速識(shí)別鑒定；利用SwissADME 數(shù)據(jù)庫對(duì)白鮮皮潛在活性成分進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選與治療濕疹作用相關(guān)的主要作用靶點(diǎn)，并采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)主要成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，最終得到成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。

圖1 研究流程圖

3 研究與分析

3.1 材料與方法

3.1.1 材料與試劑

白鮮皮飲片選購自南京海源中藥飲片有限公司（批號(hào)：170101；產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）經(jīng)南京海源中藥飲片有限公司執(zhí)業(yè)中藥師丁斐鑒定為蕓香科植物白鮮Dictamnus dasyarpusTurcz.的干燥根皮。乙腈、甲醇（美國Tedia 公司，色譜純），甲酸（上海凌峰，分析純），其余試劑均為市售分析純。

3.1.2 儀器與設(shè)備

LCMS-2020 高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司，ESI 電噴霧離子源），配置LC-20AD泵、CTO-20A 柱 溫 箱、SIL-20A 自 動(dòng) 進(jìn) 樣 器、SPDM20A 二極管陣列檢測(cè)器。AG-285 型萬分之一電子天平（瑞典METTLER TOLEDO）、R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋。

3.1.3 樣品溶液的制備

稱取白鮮皮粉末1 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，藥渣加甲醇30 mL 再超聲提取一次，過濾，合并兩次濾液，減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓ㄈ葜?0 mL，作為供試品溶液，備用。

3.1.4 LC-MS分析條件

色譜條件：采用YMC-Pack ODS-A 色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序：0 min，5%B；0-45 min，5%B→30%B；45-55 min，30%B→45%B；55-85 min，45%B→60%B；85-105 min，60%B→90%B；105-110 min，90%B。檢測(cè)波長：254 nm；柱溫35℃，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離（ESI），離子源溫度280℃，毛細(xì)管電壓4.5kV，檢測(cè)器電壓1.5 kV，干燥氣流速5 L·min-1，霧化氣流速1.5 L·min-1。正、負(fù)離子模式下，獲得質(zhì)譜總離子流圖，全掃描質(zhì)譜范圍100-1000 m/z。

3.1.5 白鮮皮潛在活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過對(duì)白鮮皮質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、TCMSP 數(shù)據(jù)庫等平臺(tái)，鑒定白鮮皮中的主要化學(xué)成分。利用SwissADME 對(duì)各成分進(jìn)行篩選，保留胃腸道（Gastrointestinal,GI）吸收評(píng)分和生物利用度評(píng)分高的成分，作為潛在活性成分。Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）可以用來預(yù)測(cè)白鮮皮潛在活性成分的作用靶點(diǎn)。將白鮮皮潛在活性成分的MOL 文件，導(dǎo)入軟件，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，預(yù)測(cè)潛在活性成分的作用靶點(diǎn)。

3.1.6 濕疹相關(guān)疾病靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中，其功能信息包括指向濕疹的關(guān)系、突變和多態(tài)性、基因表達(dá)、基因功能、途徑、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用等，能較全面獲取濕疹相關(guān)疾病靶點(diǎn)，分別檢索關(guān)鍵詞Rubella（風(fēng)疹）、Eczema（濕疹）、Damp heat sores（濕熱瘡毒），搜索相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，根據(jù)Relevance score篩選出大于平均值的靶點(diǎn)。

3.1.7 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵作用靶點(diǎn)分析

將白鮮皮主要成分作用靶點(diǎn)與三種疾病的靶點(diǎn)（風(fēng)疹Rubella、濕疹Eczema、濕熱瘡毒Damp heat sores）進(jìn)行交集，繪制韋恩圖得到交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，得到靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出蛋白相互作用數(shù)據(jù)。利用Excel 篩選出核心靶標(biāo)蛋白，利用R 語言繪制關(guān)鍵靶點(diǎn)的柱形圖。

3.1.8 KEGG通路富集分析

利用Metascape 軟件對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，將靶點(diǎn)信息上傳后，設(shè)置基因物種為“H.sapiens”，采用Express Analysis 進(jìn)行基因分析，點(diǎn)擊Analysis Report Page，下載所有的注釋結(jié)果（All in One Zip），根據(jù)所得結(jié)果繪制氣泡圖。

3.1.9 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

篩選出富集靶點(diǎn)蛋白較多的信號(hào)通路。將白鮮皮潛在活性成分、關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和主要信號(hào)通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape3.7.0 軟件，繪制得到成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

3.1.10 主要成分與靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接驗(yàn)證

通 過ZINC（https://zinc. docking. org/substances/home/）下載白鮮皮4 種潛在活性成分的3D 結(jié)構(gòu)。通過PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載核心靶蛋白數(shù)據(jù)文件，利用Pymol 軟件對(duì)蛋白受體進(jìn)行除去水分子和加氫操作。利用Autodock Vina 軟件確定分子對(duì)接的坐標(biāo)和盒子的大小，通過Autodock Tools將處理后的主要潛在活性成分和蛋白質(zhì)受體分子進(jìn)行對(duì)接。并將結(jié)合活性較強(qiáng)的9 個(gè)對(duì)接結(jié)果導(dǎo)入Pymol 軟件，繪制成三維圖進(jìn)行可視化展示。

3.2 結(jié)果

3.2.1 白鮮皮主要成分的液質(zhì)聯(lián)用分析

通過對(duì)白鮮皮主要成分進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，得到各主要成分在正負(fù)離子模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示：白鮮皮主要成分在正負(fù)離子模式下均具有較好的響應(yīng)。其中，正離子模式下的峰數(shù)量大于負(fù)離子模式。將各成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)譜信息進(jìn)行對(duì)照[8-9]，確定各化合物的分子量，最終鑒定了12 個(gè)主要成分，結(jié)果見圖2和表1。

圖2 白鮮皮在正（A）、負(fù)（B）離子模式下的總離子流圖

表1 白鮮皮中主要成分的鑒定

3.2.2 白鮮皮的潛在活性成分及作用靶點(diǎn)

通過SwissADME 對(duì)白鮮皮主要成分進(jìn)行篩選，保留GI 吸收評(píng)分和生物利用度評(píng)分高的成分，共獲得4個(gè)潛在活性成分，分別為去甲基川陳皮素、黃柏酮酸、黃柏酮和檸檬苦素（圖3）。

圖3 白鮮皮的潛在活性成分

利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫對(duì)白鮮皮潛在活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，設(shè)置Probability＞0，篩選得到作用靶點(diǎn)共307 個(gè)。其中，KDR、CDK5R1、CDK5、PIM1 等靶點(diǎn)是去甲基川陳皮素、黃柏酮酸、黃柏酮的共同靶點(diǎn)，推測(cè)是白鮮皮發(fā)揮藥效作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。對(duì)各成分作用靶點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，檸檬苦素作用靶點(diǎn)較少，但其結(jié)構(gòu)與黃柏酮酸、黃柏酮相似，均為萜內(nèi)酯類化合物。該類化合物具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，推測(cè)是白鮮皮治療濕疹的主要藥效物質(zhì)[10]。因此，檸檬苦素可能是在空間結(jié)構(gòu)上與其它兩種成分存在差異，導(dǎo)致與靶點(diǎn)的結(jié)合能力不同。

3.2.3 疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)交集venn圖的構(gòu)建

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中分別獲取Rubella（風(fēng)疹）靶點(diǎn)674 個(gè)、Eczema（濕疹）靶點(diǎn)2737 個(gè)、Damp heat sores（濕熱瘡毒）靶點(diǎn)234 個(gè)，根據(jù)Relevance score 保留大于平均值的靶點(diǎn)，共篩選風(fēng)疹有效靶點(diǎn)90 個(gè)，濕疹有效靶點(diǎn)789 個(gè)，濕熱瘡毒有效靶點(diǎn)72 個(gè)。將白鮮皮的潛在活性成分作用靶點(diǎn)與疾病的主要靶點(diǎn)進(jìn)行交集，結(jié)果見圖4。

圖4 藥物與疾病靶點(diǎn)交集韋恩圖

從圖中可以看出，靶點(diǎn)TNF（腫瘤壞死因子）[11]與藥物和3 種疾病均有交集，預(yù)測(cè)其為白鮮皮治療濕疹的關(guān)鍵靶點(diǎn)。該靶點(diǎn)為白鮮皮中黃柏酮酸的作用靶點(diǎn)，推測(cè)白鮮皮在治療濕疹等皮膚疾病時(shí)，黃柏酮酸為重要藥效成分。從靶點(diǎn)交集中可以發(fā)現(xiàn)，DYRK1A為白鮮皮作用于濕疹和風(fēng)疹的交集靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)是黃柏酮的作用靶點(diǎn)，推測(cè)在治療濕疹和風(fēng)疹時(shí)，黃柏酮可以同時(shí)起效。白鮮皮同時(shí)作用于濕疹和濕熱瘡毒的交集靶點(diǎn)有NOS2、MPO、CASP1、MMP9，其中NOS2、MPO、MMP9是去甲基川陳皮素的作用靶點(diǎn)。

3.2.4 靶點(diǎn)蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)分析

STRING 數(shù)據(jù)庫運(yùn)用一種獨(dú)特基于對(duì)一個(gè)常用參考數(shù)據(jù)集不同類型相關(guān)性基準(zhǔn)打分框架，為每一個(gè)PPI 整合一個(gè)置信分?jǐn)?shù)，用于評(píng)估數(shù)據(jù)的可靠性，方便對(duì)數(shù)據(jù)的取舍，推斷、加權(quán)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化，促進(jìn)生物過程模塊化分析，同時(shí)該數(shù)據(jù)庫信息量大，具有一定的置信度的優(yōu)點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用分析，結(jié)果見圖5。圖中淺藍(lán)色和紫色線條表示已知的相互作用，綠色、紅色和深藍(lán)色線條為預(yù)測(cè)的相關(guān)作用關(guān)系。白鮮皮潛在活性成分作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)中，共有48個(gè)節(jié)點(diǎn)、297條邊，平均度值為12.4。

圖5 靶點(diǎn)蛋白相互作用圖

由圖中可知，TNF、AKT1、MAPK1、MMP9、EGFR、MMP2、SRC、MPO 等靶點(diǎn)度值較大，在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著重要的連接作用，可能是白鮮皮治療濕疹等皮膚病的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。其中TNF 靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)度最大，這與靶點(diǎn)交集處理時(shí)發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)果一致。TNF 是一種炎性反應(yīng)介質(zhì)，通過誘導(dǎo)前列腺素E2膠原酶的分泌以及滑膜細(xì)胞的合成，容易導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[12]，在白鮮皮治療皮膚病時(shí)發(fā)揮著重要作用。

3.2.5 KEGG通路富集分析

通過KEGG 通路富集分析，共篩選得到14 條信號(hào)通路（P＜0.01），涉及48 個(gè)潛在靶點(diǎn)基因，考慮到結(jié)果假陽性率，研究過程中采用bonferroni進(jìn)行了校正。取前10 條富集靶點(diǎn)蛋白數(shù)較多的通路，結(jié)果見表2。微生信是一個(gè)在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)可視化工具（http://www.bioinformatics.com.cn），將Metascape 得到的通路富集數(shù)據(jù)，按照微生信富集氣泡圖模塊的要求處理，設(shè)置參數(shù)，X 軸為Rich factor，按P值進(jìn)行排序，得到富集氣泡圖（圖6）。

表2 白鮮皮潛在作用靶點(diǎn)的通路信息

圖6 KEGG通路分析氣泡圖

通過對(duì)各信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，白鮮皮治療濕疹等疾病的幾個(gè)關(guān)鍵通路中，內(nèi)分泌抗性（Endocrine resistance，ER）共 有12 個(gè) 靶 點(diǎn) 參 與，癌 癥 途 徑（Pathways in cancer,PC）共有15 個(gè)靶點(diǎn)參與，TNF 信號(hào)通路共有9 個(gè)靶點(diǎn)參與，磷脂酶D 信號(hào)通路共有8 個(gè)靶點(diǎn)參與，這些通路與白鮮皮抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理活性密切相關(guān)。在這些通路當(dāng)中，SRC、EGFR[13]、BCL2、TNF、MAPK[14]、HDAC、MAO 等為共同作用靶點(diǎn)，這也進(jìn)一步說明白鮮皮通過多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同發(fā)揮治療作用。

3.2.6 白鮮皮“成分-靶點(diǎn)-疾病-通路”網(wǎng)絡(luò)分析

選取KEGG 通路富集分析獲得的13 條信號(hào)通路，以及對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病-通路的網(wǎng)絡(luò)圖（圖7），黃色部分為與信號(hào)通路相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，藍(lán)色菱形為信號(hào)通路，紫色為白鮮皮的潛在活性成分，紅色矩形為疾病。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中，可以比較全面的展示白鮮皮通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同發(fā)揮治療濕疹作用的主要機(jī)制。

圖7 “成分-靶點(diǎn)-疾病-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

通過圖7可知，白鮮皮中去甲基川陳皮素、黃柏酮酸、黃柏酮等潛在活性成分，可以作用于TNF、SRC、BCL2、HDAC 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控TNF 信號(hào)通路、Phospholipase D 信號(hào)通路、Endocrine resistance 等主要信號(hào)通路，通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，產(chǎn)生抗炎、抗菌等作用。其中，組蛋白去乙?；福℉DAC）是重要的染色體重構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控因子，HDAC 抑制劑可以干擾特定的腫瘤細(xì)胞表達(dá)，有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[15]。趙詩雨等[16]研究發(fā)現(xiàn)HDAC 抑制劑能有效抑制炎癥反應(yīng)，篩選具有HDAC 抑制作用的活性成分，抑制活性越強(qiáng)，抗炎效果越好。TNF-α 是一種促炎癥細(xì)胞因子，可以提高毛細(xì)血管的通透性，導(dǎo)致局部缺血和血栓，從而放大炎癥反應(yīng)[12]。白鮮皮主要活性成分通過阻斷這些促炎因子的產(chǎn)生，可以緩解炎癥反應(yīng)?？沟蛲龅鞍祝˙cl2）是主要存在于線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)調(diào)控，活化之后可以抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞的壽命[17]。SRC 是類固醇受體共激活因子，參與信號(hào)通路的調(diào)控，通過激活信號(hào)通路中的下游效應(yīng)因子，可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等，對(duì)癌癥細(xì)胞的產(chǎn)生和發(fā)展有顯著影響[18]。

3.2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇去甲基川陳皮素、黃柏酮酸、黃柏酮和檸檬苦素等主要成分與AKT1、SRC、MMP2、EGFR 等關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行對(duì)接。通常認(rèn)為結(jié)合能越小，配體與受體結(jié)合越牢固。當(dāng)結(jié)合能＜-4.25 kcal·mol-1時(shí)，配體與受體有一定的結(jié)合活性，當(dāng)結(jié)合能＜-5.0 kcal·mol-1，有較好的結(jié)合活性[19]。由表3 可以看出，黃柏酮和檸檬苦素與SRC、AKT1、AGTR1 和EGFR 均有一定的結(jié)合力。AGTR1 與上述4 個(gè)成分的結(jié)合力能較為牢固，推測(cè)白鮮皮成分可能主要通過作用AGTR1 受體來治療濕疹（表3、圖8）。

表3 主要成分與核心靶點(diǎn)基因

圖8 主要成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接

4 討論

濕疹是臨床常見的炎癥性皮膚病，其發(fā)病的因素包括遺傳易感性、免疫功能異常及皮膚屏障功能障礙以及環(huán)境或食物刺激等[20]。目前，對(duì)濕疹的發(fā)病機(jī)制報(bào)道的文獻(xiàn)較少，濕疹是T 細(xì)胞所介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，Th1/Th2 平衡紊亂是其發(fā)生主要免疫學(xué)因素，同時(shí)伴有炎性因子以及嗜酸粒細(xì)胞參與。研究表明，胸腺基質(zhì)淋巴生成素（Thymic stromal lymphopoietin，TSLP）在啟動(dòng)Th2（輔助性T 細(xì)胞）驅(qū)動(dòng)的炎癥性疾病中起總開關(guān)和主調(diào)節(jié)器的作用[21]。TSLP 具體可通過兩種作用途徑促使機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)：TSLP 可啟動(dòng)CD4+T細(xì)胞前體向Th2炎癥細(xì)胞分化，并產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子[21]，促進(jìn)B細(xì)胞分泌過多的免疫球蛋白E（IgE），IgE 介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)是嬰幼兒濕疹的主要原因，其機(jī)制是Th2 炎性反應(yīng)增強(qiáng)，白細(xì)胞介素（IL）4,5,13等炎性因子分泌增多，其中IL-4 可誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換和IgE 合成，合成的IgE 與肥大細(xì)胞表面的IgE 受體結(jié)合，當(dāng)變應(yīng)原刺激導(dǎo)致體內(nèi)特異性IgE 水平升高時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生橋連結(jié)合，促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒，引起Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)[22]。

白鮮皮具有祛風(fēng)、清濕、解毒等功效，臨床常用于風(fēng)/濕疹、瘡毒濕熱、風(fēng)濕熱痹、疥癬瘡癩、黃疸尿赤等癥，具有多重藥效藥理作用[23]。目前，白鮮皮常與其他中藥組成成方制劑用于治療濕疹，對(duì)于白鮮皮提取物治療濕疹的機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。白鮮皮提取物有抗瘙癢、抗過敏的作用，叢歡等[24]研究發(fā)現(xiàn)白鮮皮提取物抑制抗原與IgE 結(jié)合，減少肥大細(xì)胞釋放組胺等炎癥介質(zhì)，減少機(jī)體瘙癢，具有抗瘙癢的作用。本研究采用LC-MS技術(shù)快速分析識(shí)別了白鮮皮的主要成分，共鑒定了多種化合物，最終篩選得到去甲基川陳皮素、黃柏酮酸、檸檬苦素、黃柏酮等4個(gè)潛在活性種分。通過對(duì)這些成分進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，其中TNF、AGTR1、AKT1、SRC、EGFR 等靶點(diǎn)與白鮮皮抗?jié)裾钏幚碜饔镁o密相關(guān)。如AGTR1是血管緊張素受體家族成員之一，許晨等[25]研究發(fā)現(xiàn)，AGTR1 主要通過血管緊張素調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)，而血管緊張素Ⅱ（Angiotensin II）可以通過誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞產(chǎn)生輕度炎癥反應(yīng)，在子癇前期（PE）的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。這些靶點(diǎn)參與調(diào)控13條信號(hào)通路，涉及TNF信號(hào)通路、內(nèi)分泌抗性、癌癥途徑等。這說明白鮮皮在治療皮膚病炎癥反應(yīng)的過程中，可以通過多成分作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)，從而產(chǎn)生更好的治療效果。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于藥物與疾病生物分子的網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)機(jī)制研究，對(duì)研究藥物與生物機(jī)體作用機(jī)制提供了一種新的思路[26]?！熬W(wǎng)絡(luò)”是機(jī)體復(fù)雜生物系統(tǒng)的構(gòu)建基礎(chǔ)?！熬W(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”將病癥生物分子網(wǎng)絡(luò)當(dāng)做靶標(biāo)，從而為設(shè)計(jì)最佳的藥物作用方式提供依據(jù)[27]。

5 結(jié)論

本文通過研究鑒定了白鮮皮中4 種活性成分，首次開展了治療濕疹的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，揭示了白鮮皮治療濕疹的主要潛在活性成分，明確了主要作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，建立了白鮮皮主要成分-靶點(diǎn)-通路-疾病的作用網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子驗(yàn)證，對(duì)于下一步研究白鮮皮治療濕疹作用機(jī)理具有一定的借鑒意義。研究結(jié)果也說明中藥發(fā)揮臨床療效是通過多靶點(diǎn)、多途徑起效的，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法有助于揭示中藥的多靶點(diǎn)作用機(jī)理[28-29]。本研究參考了最新發(fā)布的《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》[26]，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過分子對(duì)接技術(shù)，已經(jīng)驗(yàn)證了本研究結(jié)果的正確性，在下一步研究中，我們將繼續(xù)選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，基于分子生物學(xué)方法驗(yàn)證白鮮皮的藥效作用機(jī)理。