一種以羊肝為原料的寵物誘食劑發(fā)酵工藝研究

孫 蓓，金 杰，劉曉娟，肖欣欣，李 晴，朱中原，王利斌，王龍剛，王維婷，*

（1.江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校，江蘇徐州 221116；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與營養(yǎng)研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室，山東濟南 250100；3.江蘇聯(lián)益生物科技有限公司，江蘇淮安 211700）

近年來，隨著經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展，人們生活節(jié)奏不斷加快，家庭及人際關(guān)系日益疏遠，寵物在家庭生活中的地位越來越高，成為許多人的精神寄托。寵物行業(yè)因此也得到迅速擴張，據(jù)互聯(lián)網(wǎng)寵物行業(yè)各細分市場收入統(tǒng)計，寵物食品收入占比39.3%，是寵物行業(yè)的主要部分（吳孝杰等，2019）。

目前按照形態(tài)寵物食品可分為干型（干物質(zhì)80%～90%）、濕型（干物質(zhì)15%～40%）、半干型（干物質(zhì)50%）3種類型。國內(nèi)半干型寵物食品多數(shù)以屠宰下腳料為基礎(chǔ)原料，調(diào)整pH后經(jīng)熱處理制成，與國外發(fā)酵類半干型產(chǎn)品相比，技術(shù)含量低，競爭力差。張建斌等（2015）利用鯰魚魚骨為主要原料，雞肝為輔料，采用酶解、美拉德反應(yīng)和發(fā)酵等方式，獲得了較好的發(fā)酵效果。雖然國內(nèi)目前的肉制品發(fā)酵已被廣泛應(yīng)用并帶來各種優(yōu)點（吳麗紅和賀稚非，2005），但與之類似可以用于指導企業(yè)生產(chǎn)的關(guān)于發(fā)酵類寵物食品的產(chǎn)品和技術(shù)方面的研發(fā)鮮有報道，因此，有必要開展相關(guān)研究，以提升行業(yè)及企業(yè)競爭力。

羊肝含有豐富的維生素，如維生素A、B族維生素，是一種營養(yǎng)豐富的動物源性食品原料（姚碧霞等，2008；楊月欣，2005；FrΦslie，1983）。與其他動物肝臟相較，羊肝中的鐵、銅和γ-亞麻酸含量更高（Bah，2015）。

本團隊前期經(jīng)選育、培養(yǎng)得到了一種以肝臟為底物的可調(diào)節(jié)寵物腸道菌群的復(fù)合發(fā)酵菌種，在本研究中以冷凍羊肝臟為基礎(chǔ)原料，對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，希望能為寵物發(fā)酵系列產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 冷凍羊肝：購自濟南市惠民廣場馬家牛羊肉店；復(fù)合菌種：乳酸菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、酵母菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌、土豆淀粉（食品級）：甘肅正陽現(xiàn)代農(nóng)業(yè)附有有限公司；乳糖（食品級）：河南春祥化工產(chǎn)品有限公司；白糖（食品級）：河北省邢臺市隆堯縣東方食品城；雞油（食品）：山東頂嘉油脂有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 pH計（FE28）：梅特勒-托利多儀器有限公司；電子分析天平（BSA124S-CW）：斯多利斯科學儀器（北京）有限公司；可調(diào)高速勻漿機（FSH-2）：常州市偉嘉儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DH6-92435-III）：上海新苗實業(yè)有限公司；色差色差計（CR-400）：柯尼卡美能達（中國）投資有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 100 g羊肝泥與雞油、蔗糖乳糖混合糖粉、土豆淀粉混勻后高溫高壓滅菌處理15 min，隨后接種復(fù)合菌，37℃條件下發(fā)酵7 d。發(fā)酵完成后，測定發(fā)酵物pH、發(fā)酵損失，并對發(fā)酵產(chǎn)物進行氣味、色澤的感官評價，并進行綜合評分。

單因素試驗分析了雞油、混合糖粉、發(fā)酵底物濕度（土豆淀粉添加量）對發(fā)酵結(jié)果的影響，從中篩選出參數(shù)進行響應(yīng)面分析，并根據(jù)結(jié)果完成驗證試驗。

糖粉總添加量為7 g，響應(yīng)面分析中計算比例為乳糖：蔗糖（m：m）：1：6記為0.14，2：5記為 0.28，3.5：3.5記 為 0.5，5：2記 為 0.71，6：1記為0.85。

1.3.2 pH值的測定 準確稱取10 g樣品于燒杯中，加入100 mL氯化鉀溶液，12000 rpm勻漿60 s，把勻漿完的溶液用保鮮膜封住，靜置30 min，打開保鮮膜，充分搖勻。校準pH計后測定溶液pH，重復(fù)3次并記錄數(shù)據(jù)，分別測量發(fā)酵物發(fā)酵前后的pH。

1.3.3 發(fā)酵損失計算 發(fā)酵損失計算公式如下：

發(fā)酵損失 /%=（m1-m2）/m1×100 ；

式中：m1代表發(fā)酵前發(fā)酵物質(zhì)量，g；m2代表發(fā)酵后發(fā)酵物質(zhì)量。

1.3.4 發(fā)酵效果評分計算 色澤分：發(fā)酵產(chǎn)物顏色以褐色為主，發(fā)酵產(chǎn)物顏色有金褐色、褐色、棕紅色、深褐色、土色等顏色，以深褐色得分最高，土色、棕紅色次之，其次褐色、金褐色。

pH：以pH=5.0為滿分，±0.01則減1分。

氣味：以有肉香最佳，醬香其次、酸香次之，有土豆淀粉生粉味道者最差。

綜合上述評分，按照以下公式計算加權(quán)得分：

發(fā)酵產(chǎn)物綜合得分=色澤×0.1+氣味×0.2+pH得分×0.1+發(fā)酵損失×0.6

1.4 單因素試驗

1.4.1 濕度對發(fā)酵結(jié)果的影響 在100 g羊肝泥中添加混合糖粉7 g：乳糖：蔗糖（W：W）2：5，雞油16 g，用土豆淀粉調(diào)整肝泥濕度分別為20%、30%、40%、50%、60%，發(fā)酵后計算發(fā)酵產(chǎn)物的綜合得分。

1.4.2 混合糖粉的比例對發(fā)酵結(jié)果的影響 在100 g羊肝泥中分別添加不同比例混合糖分7 g：乳糖 ：蔗糖（m ：m）1：6、2：5、3.5：3.5、5：2、6：1，雞油16 g，用土豆淀粉調(diào)整肝泥濕度30%，發(fā)酵后計算發(fā)酵產(chǎn)物的綜合得分。

1.4.3 雞油添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響 在100 g羊肝泥中添加混合糖粉7 g：乳糖：蔗糖（W：W）2 ：5，雞油添加量分別為 0、8、16、24、32 g，用土豆淀粉調(diào)整肝泥濕度30%，發(fā)酵后計算發(fā)酵產(chǎn)物的綜合得分。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以發(fā)酵產(chǎn)物綜合得分為指標，設(shè)計響應(yīng)面試驗，建立3因素3水平Box-Behnken中心組合實驗（Huang，2011），數(shù)據(jù)用 Design-Expert軟件統(tǒng)計，各因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

寵物食品的pH適當偏酸有助于寵物形成酸性尿液，有利于抑制細菌的滋生（張松山等，2009；馮秀娟等，2008），但酸性過強會影響適口性。在本研究結(jié)合前期動物采食試驗結(jié)果及后續(xù)加工需要，選取pH=5.0為最佳發(fā)酵底物pH標準，結(jié)合發(fā)酵損失、發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)構(gòu)變化及氣味等指標，綜合分析了發(fā)酵底物濕度（土豆淀粉添加量）、混合糖分、雞油對發(fā)酵結(jié)果的影響。

2.1 羊肝發(fā)酵工藝單因素試驗

2.1.1 濕度對發(fā)酵結(jié)果的影響 由表2可知，發(fā)酵過程中，發(fā)酵底物中大分子量的營養(yǎng)物質(zhì)會被分解為更易消化吸收的小分子，同時也會產(chǎn)生獨特的風味（曹朝輝，2016），但此過程中，有機化合物會被分解為有機酸、二氧化碳和水分，從而造成發(fā)酵損失，增加了生產(chǎn)成本，因此，發(fā)酵損失也是企業(yè)生產(chǎn)工藝篩選的一個非常重要的指標。隨著發(fā)酵底物濕度的增加，肉香味隨濕度增加而更加濃郁，但發(fā)酵損失、pH、發(fā)酵物顏色粘聚性呈先上升后下降的趨勢。濕度20%～30%時發(fā)酵綜合得分較高。

表2 濕度對發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.2 混合糖粉比例對發(fā)酵結(jié)果的影響 由表3可知，隨著乳糖添加量的增加，發(fā)酵損失出現(xiàn)了不規(guī)律的波動，說明碳源比例對發(fā)酵菌種的發(fā)酵效率有一定影響。pH總體呈先下降后上升的趨勢，顏色隨著蔗糖添加量的減少而逐漸加深，同時，發(fā)酵產(chǎn)物中的酸香味減輕并消失，肉香味和醬香味開始增加。在微生物發(fā)酵過程中，菌種生長的主要碳源來自各種糖，主要為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖，乳糖等（周傳云等，2004；張弘等，1992），本試驗選取了購買方便且成本低廉的蔗糖和乳糖作為原料糖。因此，在碳源選擇上，應(yīng)著重考慮其對發(fā)酵產(chǎn)物風味的影響，其次是發(fā)酵損失。

表3 糖粉比例對發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.3 雞油添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響 由表4可知，雞油添加量對發(fā)酵產(chǎn)物顏色及流變學特性影響不大，但隨著雞油的添加可以減少發(fā)酵損失，并對發(fā)酵產(chǎn)物的風味產(chǎn)生明顯影響，隨著雞油添加量的增加，肉香味明顯增加，這是因為向產(chǎn)品中添加適量脂肪，有利于改善產(chǎn)品的質(zhì)地、口感及色澤，而雞油成本低廉、便于購買，是一種常見的原料脂肪。

表4 雞油添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果 用Design-Expert 8.05b軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行回歸分析，得到發(fā)酵產(chǎn)物綜合評分（Y）對自變量發(fā)酵底物濕度（A）、雞油添加量（B）、混合糖粉比例（C）的二次回歸模擬方程：

Y=63.39+0.41A+1.45B+19.60C+0.01AB+0.02AC-0.06BC-8.86E-003A2-0.04B2-16.83C2

對該回歸模擬方程進行方差分析和差異顯著性檢驗，結(jié)果見表6。

由表5可知，該模型具有顯著性（P＜0.05），模型失擬項0.8894＞0.05不顯著，模型的調(diào)整確定系數(shù)（R2adj）為0.9237，可解釋92.37%響應(yīng)值的變化，相關(guān)系數(shù)（R2）為 0.9666，與 R2adj較接近，表明此模型擬合程度較好，誤差不大，故可用此模型對羊肝發(fā)酵工藝結(jié)果進行分析與預(yù)測。在總的作用因素中，除去B、AC、BC所有項均對結(jié)果有顯著影響。

表5 回歸系數(shù)模型及方差分析

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析與優(yōu)化 由圖1～圖3可以看出回歸方程預(yù)測4個因素對發(fā)酵產(chǎn)物綜合評分的影響：由圖1可知，隨著雞油添加量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物綜和評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，發(fā)酵底物濕度與雞油添加量之間有明顯交互作用。雞油添加量及發(fā)酵底物濕度的加大在發(fā)酵過程中為發(fā)酵產(chǎn)物提供了更佳的風味，但會對產(chǎn)品色澤及凝聚性產(chǎn)生不利影響，影響了綜合得分，發(fā)酵濕度的增加會使發(fā)酵損失增加，雞油添加量的適當增加能對這一缺憾進行彌補。

圖1 發(fā)酵底物濕度和雞油添加量交互作用對發(fā)酵產(chǎn)物綜合評分的影響

由圖2可知，混合糖粉比例和底物濕度影響對綜合評分的交互作用明顯，體現(xiàn)在適當增加糖粉中乳糖含量能減少發(fā)酵底物濕度增加所帶來的發(fā)酵損失，同時減輕了發(fā)酵產(chǎn)物中酸、苦等不良風味的產(chǎn)生。

圖2 發(fā)酵底物濕度和混合糖粉比例交互作用對發(fā)酵產(chǎn)物綜合評分的影響

由圖3可知，雞油與糖粉比例對綜合評分的交互作用主要體現(xiàn)在對整個發(fā)酵產(chǎn)物色澤的改良上。雞油是風味產(chǎn)生的一個重要因素，但其添加量的增加降低了發(fā)酵物的色澤吸引度，而適當增加糖粉中乳糖的添加比例能起到一定的補償效果。

圖3 雞油添加量和混合糖粉比例對發(fā)酵產(chǎn)物綜合評分的響應(yīng)面分析

2.3 最佳工藝參數(shù)確定及驗證性試驗 在本試驗選取的因素范圍內(nèi)，通過Design Expert軟件回歸模型分析得出，最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵底物濕度43.09%，雞油添加量24.22 g，混合糖粉比例乳糖：蔗糖（m：m）為3.15：3.85。在該條件下模型預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物綜合評分能達到96.71分。為便于實際操作，將各因素參數(shù)確定如下：發(fā)酵底物濕度43%，雞油添加量24 g，乳糖：蔗糖（m：m）3.2：3.8。

為了驗證模型結(jié)果，用確定的參數(shù)進行了3次發(fā)酵試驗，發(fā)酵綜合得分平均為（97.01±0.23），與預(yù)測值基本一致，證明了該方程與實際情況擬合度佳，響應(yīng)面分析法可以應(yīng)用于羊肝泥發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化篩選。

3 結(jié)論

羊肝中含有豐富的維生素和微量元素，但因其膻味重及羊副產(chǎn)物綜合開發(fā)利用不足等原因，造成了大量的資源浪費，本研究開發(fā)了一種羊肝泥發(fā)酵工藝，通過響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：每百克羊肝泥用土豆淀粉調(diào)整發(fā)酵底物濕度43%，添加雞油24 g，同時將7 g混合糖粉比例控制為乳糖：蔗糖（m：m）3.2：3.8。該參數(shù)下發(fā)酵羊肝泥產(chǎn)品的綜合評分可達到97分，能較好的控制發(fā)酵損失，并在產(chǎn)品色澤和風味上起到很好的誘食效果。