催化劑對(duì)凱氏定氮法測(cè)定苜蓿青貯中粗蛋白質(zhì)含量的影響

劉瑞芳，張志遠(yuǎn)，陳 球，王藝偉，蘇利紅

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

粗蛋白質(zhì)是飼料中最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其含量直接影響動(dòng)物的生長(zhǎng)速度、新陳代謝、繁殖發(fā)育和生產(chǎn)性能。飼料中蛋白質(zhì)含量是評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一（伊麗君和孫強(qiáng)，2020）。因此，快速、準(zhǔn)確測(cè)定飼料中粗蛋白質(zhì)含量，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要意義（于菲等，2019；丁進(jìn)海，2015；朱宇旌等，2011）。飼料中粗蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法有多種，常用的是國(guó)標(biāo)測(cè)定法——?jiǎng)P氏定氮法。凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)的過程包括消化、蒸餾、吸收和滴定4個(gè)環(huán)節(jié)，消化是影響蛋白質(zhì)測(cè)定效率和成敗的關(guān)鍵（藍(lán)億陽等，2019；劉慶等，2015）。國(guó)標(biāo)法用硫酸銅和硫酸鉀作催化劑進(jìn)行消化，因其使用量較大易造成消化液冷卻后出現(xiàn)大量結(jié)晶而影響后續(xù)的測(cè)定，同時(shí)消化時(shí)間較長(zhǎng)（張澤泉等，2017；曲玲等2015）。在確保測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，如何縮短檢測(cè)時(shí)間、降低試驗(yàn)成本、提高試驗(yàn)效率是飼料粗蛋白質(zhì)測(cè)定需要改進(jìn)的首要問題。本試驗(yàn)通過研究添加硒粉的混合催化劑對(duì)飼料粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定的影響，旨在篩選最佳的組合水平。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料 玉米青貯由西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)基地提供。采用四分法將試樣縮減至1 kg，65℃烘箱烘干、粉碎、過40目篩，制成的風(fēng)干樣裝于密閉容器備用。

1.2 試劑及配制方法

1.2.1 主要試劑 硫酸銅·5H2O、硫酸鉀（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、碳酸鈉（分析純）、硼酸（分析純）、硒粉（分析純），購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲基紅（分析純）、溴甲酚綠（分析純），購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸（98%，分析純），濃鹽酸（分析純），購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

1.2.2 試劑配制

（1）40% NaOH溶液：準(zhǔn)確稱取400 g氫氧化鈉（分析純），用蒸餾水溶解，定容至1000 mL。

（2）混合指示劑：準(zhǔn)確稱取0.1 g甲基紅，用無水乙醇將其溶解，定容至100 mL，制成甲基紅0.1%的乙醇溶液；準(zhǔn)確稱取0.5 g溴甲酚綠，用無水乙醇將其溶解，定容至100 mL，制成溴甲酚綠0.5%的乙醇溶液；然后將兩者等體積混合，裝于棕色試劑瓶，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）2%硼酸溶液：準(zhǔn)確稱取20 g硼酸（分析純），用蒸餾水將其溶解，定容至1000 mL。

（4）0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：用移液管準(zhǔn)確移取8.3 mL濃鹽酸（分析純），緩慢注入蒸餾水中，搖勻，定容至1000 mL，然后用碳酸鈉標(biāo)定后備用。

1.3 主要儀器 半自動(dòng)凱氏定氮儀（型號(hào)為KDNAA），由上海新嘉電子科技有限公司生產(chǎn)；消化爐（型號(hào)為AED-AV），由北京博瑞賽儀器有限公司生產(chǎn)；鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)為DHG-9123），由湖南湘儀儀器有限公司生產(chǎn)；粉碎機(jī)（型號(hào)為FW-500D），由天津鑫博得儀器有限公司生產(chǎn)；分析天平（型號(hào)為ATY220），由日本島津有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 硒粉用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 用分析天平準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g（精確至0.0002 g），小心無損地將試樣放入干凈的消化管底部（每個(gè)水平稱取5個(gè)平行樣），然后加入0.2 g硫酸銅·5H2O，1.0 g硫酸鉀和不同量的硒粉（0.05、0.10、0.15、0.2、0.3、0.4g），使其與試樣均勻混合。再向消化管中緩慢加入12 mL濃硫酸，然后置于420℃的消化爐上消化2 h，待消化管中液體徹底透明清亮結(jié)束消化。將堿管和水管分別插入裝有40%氫氧化鈉溶液和蒸餾水的桶中，設(shè)定加堿量為5 mL和蒸餾時(shí)間為6 min，打開冷凝水和電源，對(duì)凱氏定氮儀管路清洗3～5次后，將消化管置于凱氏定氮儀，同時(shí)用裝有20 mL 2%硼酸和2滴混合指示劑的三角瓶吸收氨氣。蒸餾結(jié)束后，立即用0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收液，當(dāng)溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為滴定終點(diǎn)，記錄鹽酸用量。

2.1.2 硫酸銅用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g（精確至0.0002 g），小心無損地將試樣放入干凈的消化管底部（每個(gè)水平稱取5個(gè)平行樣），然后加入1.0 g硫酸鉀、硒粉（2.1.1篩選的最佳量）、不同量的硫酸銅·5H2O（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4 g），使其與試樣均勻混合，后續(xù)測(cè)定步驟同上。

2.1.3 硫酸鉀用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g（精確至0.0002 g），小心無損地將試樣放入干凈的消化管底部（每個(gè)水平稱取5個(gè)平行樣），然后加入硒粉（2.2.1篩選的最佳量）、硫酸銅·5H2O（2.1.2篩選的最佳量）和硫酸鉀（2、2.5、3、3.5、4、5 g），使其與試樣均勻混合，后續(xù)測(cè)定步驟同上。

2.2 正交試驗(yàn)

在結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)影響粗蛋白質(zhì)含量的催化劑（硒粉、硫酸銅和硫酸鉀）用量進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)（如表1）。

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的處理因素及水平 g

2.3 空白測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0.5 g蔗糖代替試樣，按上述步驟進(jìn)行空白測(cè)定，消耗0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積不得超過0.2 mL。

2.4 改進(jìn)法和國(guó)標(biāo)法對(duì)粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定的比較 準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g（精確至0.0002 g），每種方法稱取5個(gè)平行樣，改進(jìn)法稱取硒粉0.2 g、硫酸銅0.2 g、硫酸鉀3 g作催化劑；國(guó)標(biāo)法稱取硫酸銅0.4 g、硫酸鉀6 g作催化劑。兩種方法硫酸用量、消化溫度和消化時(shí)間均相同且同上，后續(xù)方法和測(cè)定步驟同上。

2.5 結(jié)果計(jì)算

CP/%=c×（V1－ V2）×0.014×F/M×100。

式中：c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；V1為滴定試樣時(shí)所需的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液體積，mL；V2為滴定空白時(shí)所需的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液體積，mL；0.014為1 mL的1 mol/L鹽酸相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量；M為樣品的質(zhì)量，g；CP為粗蛋白質(zhì)含量。

F為氮轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)的系數(shù)（取均值6.25）。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 硒粉、硫酸銅和硫酸鉀最適添加量試驗(yàn)用單因素方差分析。在單因素方差分析中用Duncan’s法對(duì)不同添加量組間均數(shù)進(jìn)行多重比較。3種催化劑和3種添加劑量正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用雙因素方差分析檢驗(yàn)催化劑和添加量組合間差異，篩選3種催化劑最佳劑量組合。用SAS 21.0軟件中ANOVA過程執(zhí)行單因素和雙因素方差分析，主效應(yīng)和多重比較顯著水平為P＜0.05，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 硒粉用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 由表2可知，隨著硒粉用量的增加，粗蛋白質(zhì)含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。其中處理4所測(cè)玉米青貯的粗蛋白質(zhì)含量最高，顯著高于處理1和處理2（P＜0.05），與其他處理差異不顯著（P＞0.05）。從結(jié)果分析可知，可能由于處理1和處理2的硒粉用量偏少，樣品消化不徹底，從而導(dǎo)致測(cè)定的粗蛋白質(zhì)含量偏低。處理5和處理6所測(cè)粗蛋白質(zhì)含量低于處理3和處理4，可能由于硒粉用量過多導(dǎo)致氮的損失所致，該結(jié)果與陸曉濱等（2003）、楊文華（2017）的報(bào)道結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)果表明，硒粉的最佳用量為0.2 g。

表2 硒粉用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響

3.1.2 硫酸銅用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 由表3可知，處理2～6中所測(cè)粗蛋白質(zhì)含量高于處理1，但差異不顯著（P＞0.05）。處理2～6中，隨著硫酸銅用量的增加，粗蛋白質(zhì)含量無明顯變化，但消化管中出現(xiàn)結(jié)晶的現(xiàn)象明顯增多，特別是處理5和處理6，消化管中的結(jié)晶片為后續(xù)測(cè)定帶來影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，過量使用硫酸銅不影響粗蛋白質(zhì)的含量，但影響消化液的結(jié)晶狀況。該結(jié)論與顏常盛（2020）、李敏等（2015）、張生輝（2009）的研究結(jié)果一致。綜合試樣蛋白質(zhì)含量和消化管中結(jié)晶的程度來考慮，添加0.2 g硫酸銅為宜。

表3 硫酸銅用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響

3.1.3 硫酸鉀用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 硫酸鉀在消化粗蛋白質(zhì)的過程中可提高濃硫酸沸點(diǎn)，加快有機(jī)物分解（梁世岳等，2019）。不同量的硫酸鉀對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響如表4所示，處理2～6測(cè)得的粗蛋白質(zhì)含量均高于處理1，其中處理3顯著高于處理1（P＜0.05），其他處理與處理1差異不顯著（P＞0.05）。隨著硫酸鉀用量的增多，處理4～6中所測(cè)粗蛋白質(zhì)含量低于處理3，但差異不顯著（P＞0.05）。可能由于過量使用硫酸鉀，引起消化液溫度太高而導(dǎo)致氮的損失。國(guó)標(biāo)法測(cè)定粗蛋白質(zhì)時(shí)，硫酸鉀用量為6 g（王志剛等，2017）。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在最佳硒粉和硫酸銅用量的作用下，硫酸鉀的用量明顯減少，其最佳使用量為3 g。

表4 硫酸鉀用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響

3.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)硒粉、硫酸銅、硫酸鉀用量進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量的最佳催化條件。從表5的試驗(yàn)結(jié)果看出，混合催化劑的3個(gè)組分對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響順序依次為硒粉＞硫酸鉀＞硫酸銅，這與（李敏等，2015；陸曉濱等，2003）的研究報(bào)道一致，硒粉可加速消化反應(yīng)的速度及硫酸鉀在消化粗蛋白質(zhì)過程中所起作用大于硫酸銅。試驗(yàn)結(jié)果表明，催化劑的最佳組合為A2B1C2，即硒粉0.2 g、硫酸銅0.2 g、硫酸鉀 3.0 g。

表5 正交試驗(yàn)及結(jié)果分析

3.3 改進(jìn)法和國(guó)標(biāo)法對(duì)粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定的比較 由表6可知，兩種方法對(duì)粗蛋白質(zhì)測(cè)定的結(jié)果無明顯影響，但改進(jìn)法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯低于國(guó)標(biāo)法。國(guó)標(biāo)法使用0.4 g硫酸銅和6 g硫酸鉀作為催化劑。而改進(jìn)法在混合催化劑中添加0.2 g硒粉后，硫酸銅和硫酸鉀的用量明顯減少，且消化管中無結(jié)晶現(xiàn)象。

表6 改進(jìn)法和國(guó)標(biāo)法對(duì)粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定的比較

4 結(jié)論

在國(guó)標(biāo)法測(cè)定粗蛋白質(zhì)采用硫酸鉀和硫酸銅作混合催化劑的基礎(chǔ)上添加高效催化且抑泡的硒粉。通過單一變量試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究改進(jìn)法混合催化劑（硒粉+硫酸銅+硫酸鉀）最佳用量組合，篩選的混合催化劑（0.2 g硒粉+0.2 g硫酸銅+3.0 g硫酸鉀）測(cè)定效果較理想，這為建立高效催化和快速消化測(cè)定粗蛋白質(zhì)的模式開拓了新途徑。