母乳低聚糖檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

楊軼涵, 喬為倉(cāng), 張明輝, 姜鐵民, 李瑩, 胡聚峰, 余曉雯, 陳歷俊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 哈爾濱 150030；2.北京三元食品股份有限公司國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心北京市乳品工程技術(shù)研究中心母乳研究技術(shù)創(chuàng)新中心北京 100163）

0 引言

母乳是嬰兒生命早期階段營(yíng)養(yǎng)的唯一來(lái)源。在母乳中, 母乳低聚糖（Human milk oligosaccharide,HMO）是僅次于乳糖和脂肪的第三大固體成分。目前許多研究表明, 母乳低聚糖對(duì)人體健康有著許多有利的影響。它可以促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng), 抑制病原菌的繁殖；可以直接調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞, 誘導(dǎo)其分化和凋亡, 并具有預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)和抗病毒等功能[1]。母乳低聚糖從組成結(jié)構(gòu)來(lái)看可能有上千種, 但目前分離出來(lái)的只有兩百種左右, 確定結(jié)構(gòu)和名稱(chēng)的HMO只有157種[2]。母乳低聚糖的檢測(cè), 現(xiàn)階段大部分還是對(duì)已有標(biāo)品的HMO進(jìn)行定性定量檢測(cè), 但對(duì)于檢測(cè)母乳樣本中HMO種類(lèi)的高通量定性檢測(cè)仍是一個(gè)需要攻克的難題, 所以母乳低聚糖的分離檢測(cè)仍有較大的挑戰(zhàn)。

1 母乳低聚糖的結(jié)構(gòu)

在母乳中, HMO是3-10個(gè)共價(jià)連接的單糖的短鏈聚合物, 是僅次于乳糖和脂肪的第三大固體成分[3]。母乳低聚糖由半乳糖（galactose,Gal）, 葡萄糖（glucose,Glc）, N-乙酰氨基葡萄糖（(N-acety lglucosamine,GlcNAc）, 巖藻糖（fucose,Fuc）和唾液酸（sialic acid, Sia）5種基礎(chǔ)單糖所組成[4]。其中唾液酸在母乳中存在形式是N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）。HMO通常根據(jù)其化學(xué)電荷可分為兩類(lèi)：不含電荷的單糖（Glu, Gal, GlcNAc, Fuc）組成的中性HMO和帶有N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）負(fù)電荷殘基的酸性HMO。唾液酸化的HMO占總HMO的12%～14%, 中性HMO可進(jìn)一步分為巖藻糖基化HMO和非巖藻糖基化HMO。其中巖藻糖基化的HMO占總HMO的35%～50%, 非巖藻糖基化的HMO占總HMO的42%～55%[5]。

所有的HMO在其還原端都帶有乳糖[6]。在酶的作用下, 以β-1,3或β-1,6糖苷鍵連接乳糖-N-二糖或N-乙酰氨基乳糖延展母乳低聚糖的核心結(jié)構(gòu), 如圖1所示。在核心結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上, 糖鏈可以繼續(xù)延伸或進(jìn)行巖藻糖基化和唾液酸化。α-1,2糖苷鍵連接Gal末端將乳糖巖藻糖基化形成2’-巖藻糖乳糖（2'-Fucosyllactose,2′-FL）, 或者以α-1,3糖苷鍵連接還原末端Glc巖藻糖基化形成3-巖藻糖乳糖（3-Fucosyllactose,3′-FL）。另外, 在α-2,3或α-2,6糖苷鍵連接Gal末端將乳糖唾液酸化, 分別生成3’唾液酸乳糖（3'-Sialyllactose,3′-SL）和6’唾液酸乳糖（6'-Sialyllactose,6′-SL）[7]。復(fù)雜低聚糖的乳糖部分和聚乳糖胺區(qū)部分都在α-2,3和α-2,6位唾液酸化, 同時(shí)也能在α-1,2、α-1,3和/或α-1,4位巖藻糖基化。

圖1 母乳低聚糖的核心結(jié)構(gòu)

2 母乳低聚糖含量的影響因素

母乳低聚糖存在的種類(lèi)和含量會(huì)因地區(qū)、遺傳、泌乳階段等因素的影響而發(fā)生變化[8]。有研究表明78%的中國(guó)母親的母乳中分泌2′-FL, 而菲律賓僅有46%的母乳中含有2′-FL。瑞典母親母乳中的3’-FL的是岡比亞農(nóng)村母親母乳中3′-FL濃度的0.4倍, 瑞典母親母乳中的二唾液酰乳酸-N-四糖(Disialyllacto-Ntetraose,DSLNT)濃度在216～614 nmol/mL之間, 而岡比亞農(nóng)村母親母乳中DSLNT的濃度在668～870 nmol/mL之間變化[9]。在整個(gè)母乳喂養(yǎng)期間, HMO的質(zhì)量濃度也會(huì)根據(jù)哺乳階段而發(fā)生變化：初乳中20～24 g/L, 成熟乳中12～14 g/L。母乳中HMO的組成也與Lewis血型有著密不可分的關(guān)系。這主要是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT2（Se基因）和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT3（Le基因）決定的[10]。根據(jù)FUT2和FUT3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)情況, HMO分布可以分為4組：Lewis陽(yáng)性分泌型（Se+Le+）、Lewis陽(yáng)性非分泌型（Se-Le+）、Lewis陰性分泌型（Se+Le-）和Lewis陰性非分泌型（Se-Le-）[11]。FUT2以α1-2糖苷鍵將Fuc連接至Gal末端。FUT3以α1-4糖苷鍵將Fuc與I型鏈亞末端的GlcNAc連接起來(lái), 從而在分泌型母乳中產(chǎn)生Lewis b抗原, 而在非分泌型母乳中產(chǎn)生Lewis a抗原。2′-FL和乳糖-N-巖藻五糖（Lacto-N-fucopentaose I,LNFP I）是分泌型母乳中含量最高的HMO。相反, 在FUT2不表達(dá)的非分泌型母乳中不存在這兩種HMO[12]。

3 母乳低聚糖的功能

母乳低聚糖具有促進(jìn)大腦發(fā)育、調(diào)節(jié)胃腸道菌群、抗病毒、預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎和上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)等作用。

母乳低聚糖與腦健康息息相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)：2’-FL可減少腦梗塞, 神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能障礙的風(fēng)險(xiǎn), 增加體內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)。并有助于中風(fēng)后大腦的神經(jīng)修復(fù)[13]。

嬰兒腸道菌群的定植起始于母體子宮內(nèi)的階段, 隨后分娩方式, 母乳喂養(yǎng)方式, 斷奶方式, 遺傳因素, 環(huán)境因素和藥物因素等會(huì)影響嬰兒第一年腸道菌群的定植[14]。HMO可以不被人體胃液所破壞, 也不會(huì)被胃腸道消化酶水解, 可以直到大腸, 刺激有益微生物（主要是雙歧桿菌）的生長(zhǎng)并抑制有害菌的生長(zhǎng)。HMO會(huì)改善嬰兒腸道中的微生物種群。研究表明, 通常在母乳喂養(yǎng)的嬰兒中定殖的擬桿菌屬和雙歧桿菌屬能夠有效地利用HMO作為碳源[15]。雙歧桿菌在利用HMO時(shí), 會(huì)產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸, 從而降低腸道內(nèi)的pH值, 抑制病原菌的生長(zhǎng)[16]。

新生兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟, 母乳喂養(yǎng)可以一定程度上降低嬰兒感染疾病的發(fā)生率。HMO不僅可以促進(jìn)免疫系統(tǒng)的成熟, 刺激上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)和成熟, 保護(hù)嬰兒免受病毒的感染[17], 還可以與胃腸道上皮細(xì)胞以及黏膜和全身免疫細(xì)胞相互作用, 調(diào)節(jié)免疫功能或直接調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[18]。壞死性小腸結(jié)腸炎（Necrotizing enterocolitis,NEC）是早產(chǎn)兒常見(jiàn)的一種疾病, 是早產(chǎn)兒死亡的重要原因。HMO對(duì)新生兒患NEC有較明顯的緩解效果[19]。

4 母乳低聚糖的檢測(cè)

母乳中除了HMO之外, 還含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)和糖胺聚糖等生物活性物質(zhì)。所以在對(duì)HMO進(jìn)行檢測(cè)時(shí), 這些生物活性物質(zhì)是必須要被去除的雜質(zhì), 但HMO的分離純化有許多的困難。首先, 母乳低聚糖中含有較多的乳糖, 乳糖的存在會(huì)影響后續(xù)HMO的分析檢測(cè)。因此在對(duì)HMO進(jìn)行檢測(cè)前均需先進(jìn)行樣品前處理, 之后再對(duì)其進(jìn)行定性、定量的分析。其次HMO種類(lèi)繁多, 存在大量的同分異構(gòu)體, 容易發(fā)生共同洗脫的現(xiàn)象不易分離[20]；并且沒(méi)有內(nèi)在的發(fā)色基團(tuán), 使其在儀器上的靈敏度較低, 這些因素都會(huì)使得HMO的分離與檢測(cè)有著較大的困難[21-22]。

4.1 母乳低聚糖的分離方法

在對(duì)HMO進(jìn)行分析測(cè)定之前, 需要對(duì)樣本進(jìn)行前處理, 即將母乳低聚糖與母乳中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等其他成分進(jìn)行分離。脂質(zhì)可以通過(guò)低溫高速離心的方式除去, 除蛋白的方法有以下幾種, 如表2所示。有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)變性沉淀, 進(jìn)而去除蛋白獲得低聚糖, 但易造成母乳低聚糖的損失。超濾法是將較高分子量的成分保留在膜的一側(cè), 從而將所需成分從液體中分離出來(lái), 是膜分離的方法之一。超濾操作簡(jiǎn)單, 且不需要任何的化學(xué)試劑。

在分離HMO時(shí), 乳糖也是不可忽視的成分。在母乳中, 乳糖的含量大概是HMO的7倍。對(duì)母乳低聚糖進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí), 乳糖會(huì)影響HMO的分析結(jié)果, 因此在某些實(shí)驗(yàn)中乳糖的去除也是不可忽視的。實(shí)驗(yàn)室中通常采用C18固相萃取樹(shù)脂和多孔石墨化碳(PGC)來(lái)對(duì)HMO和乳糖進(jìn)行分離, 兩者均利用了碳水化合物的親水性[28]。在固相萃取過(guò)程中, 低聚糖被吸附在固相萃取柱中, 而其他物質(zhì)則可以順利通過(guò)吸附劑, 從而達(dá)到分離純化的目的。但用此方法對(duì)低聚糖進(jìn)行分離時(shí), 易造成低聚糖的大量損失[29]。葡聚糖凝膠層析也是分離純化HMO的有效方法之一, HMO按照分子量的大小依次被洗脫出來(lái)。但隨著洗脫時(shí)間的增加, 洗脫下來(lái)的乳糖含量會(huì)逐漸增多, 因此該方法需嚴(yán)格控制洗脫時(shí)間[30]。除此之外, 還可以通過(guò)離子交換柱層析法和活性炭柱層析法等方法來(lái)去除乳糖[31-32]。

表1 母乳除蛋白的主要方式

4.2 母乳低聚糖的檢測(cè)方法

目前母乳低聚糖的檢測(cè)可以通過(guò)毛細(xì)管電泳、高效液相色譜、高效陰離子交換色譜、親水相互作用液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振等技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

4.2.1 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis,CE）在外加電場(chǎng)的作用下分離樣品, 首先被分離洗脫出來(lái)的是帶正電荷的物質(zhì), 然后是中性物質(zhì), 最后是帶負(fù)電的物質(zhì)。毛細(xì)管電泳時(shí)同分異構(gòu)體共同洗脫的情況比較常見(jiàn), 因此分離樣品時(shí)可以通過(guò)使用較長(zhǎng)的毛細(xì)管色譜柱或者在合理的時(shí)間范圍內(nèi)使用不同的分離緩沖液和凝膠來(lái)提高分析物各組分之間的分離度[33]。Bao Y等人通過(guò)CE-UV在205 nm的紫外吸光度處, 在35 min內(nèi)定量檢測(cè)母乳中12種主要的HMO, 來(lái)檢測(cè)不同泌乳階段、不同母親母乳中的低聚糖含量變化[34]。隨后Galeotti F等人在此方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)條件, 在乳糖含量較高的情況下, 分離中性HMO和酸性HMO, 并在254 nm的紫外吸光度處, 對(duì)17種中性和酸性HMO標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離和檢測(cè)[35]。此后Albrecht S等人首次使用毛細(xì)管電泳與電噴霧質(zhì)譜（Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）聯(lián)用的方法, 對(duì)母乳和嬰兒糞便中的低聚糖進(jìn)行分離和測(cè)定, 得出HMO經(jīng)在腸胃道的消化后的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[36]。并且CEESI-MS/MS這種方法, 可以用aminoxyTMT衍生試劑來(lái)標(biāo)記中性和唾液酸化的HMO, 提高定量分析的準(zhǔn)確性和同分異構(gòu)體的分辨率[37]。

CE除了可以檢測(cè)HMO之外, 還可以研究HMO與其他碳水化合物之間的相互作用。Nakajima等人用毛細(xì)管親和電泳法（CAE）研究了24種HMO和PAI、RCA120、SBA、WGA、UEA-I和AAL等6種凝集素之間的相互作用, 并基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 構(gòu)建了可以用來(lái)確認(rèn)非還原末端單糖的數(shù)據(jù)庫(kù)。并且可以利用此庫(kù), 通過(guò)凝集素的組合來(lái)表征中性HMO[38]。

4.2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（High-performance liquid chromatography,HPLC）可用于對(duì)于母乳低聚糖的定量檢測(cè)和結(jié)構(gòu)表征。但由于母乳低聚糖的紫外線(xiàn)吸收能力差, 缺乏熒光特性, 因此高效液相色譜法在搭配熒光探測(cè)器時(shí), 需要對(duì)其進(jìn)行衍生化, 增加檢測(cè)的靈敏度。常用的衍生試劑有：2-氨基苯甲酰胺（2-Aminobenzamide,2-AB）, 2-氨基苯甲酸（2-Aminobenzoic acid,2-AA）和2-氨基吖啶酮（2-Aminoacridone,2-AMAC）等[39]。但該方法需要通過(guò)萃取或離子交換色譜等方法來(lái)去除多余的衍生試劑, 以避免其對(duì)于分析的干擾。高效液相色譜除了可以搭配熒光探測(cè)檢測(cè)器外, 還可以搭配紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等。Christensen等人開(kāi)發(fā)了一種高效液相色譜-折射率檢測(cè)的（HPLC-RI）方法, 可以快速地在19 min內(nèi)對(duì)全脂奶粉、嬰幼兒配方奶粉和谷物棒中的2′-FL和3′-FL的定性定量的檢測(cè)[40]。楊新磊等人通過(guò)超高效液相色譜與蒸發(fā)光散射檢測(cè)器聯(lián)用, 通過(guò)乳糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就可以完成糖漿中不同聚合度半乳糖的定量檢測(cè)[41]。

4.2.3 高效陰離子交換色譜法

離子色譜（Ion Chromatography）是分析陰陽(yáng)離子的一種液相色譜法。它的原理是根據(jù)被測(cè)分析物的可解離性與固定相表面帶電荷的功能基團(tuán)相互作用, 使待分析的物質(zhì)保留在固定相上, 不同的離子因與固定相作用力的不同而得以分離的液相色譜方法[42]。該方法檢測(cè)準(zhǔn)確, 分析速度快, 靈敏度高, 無(wú)需衍生, 并且可以同時(shí)測(cè)定多個(gè)待分析物質(zhì)的量, 避免了HMO因衍生化而產(chǎn)生的誤差, 適用于復(fù)雜HMO混合物的定性和定量分析[43-44]。

高效陰離子交換色譜（High-pH anion-exchange chromatography,HPAEC）可以用于對(duì)HMO進(jìn)行分離, 常與脈沖安培檢測(cè)器（Pulsed amperometric dector,PAD）進(jìn)行聯(lián)用。PAD檢測(cè)靈敏度較高, 但它只能在堿性條件下使用, 因此通常情況下, 離子色譜檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相是NaOH和NaOAc[45]。1996年Thurl等人首次用HPAEC-PAD對(duì)14種中性HMO和6種酸性HMO進(jìn)行定量加檢測(cè)[46]。此后, 許多研究實(shí)驗(yàn)都用高效陰離子交換色譜法來(lái)對(duì)HMO進(jìn)行檢測(cè)研究：朱偉等人用HPAEC-PAD測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖等8種功能性低聚糖含量[47]。Coppa G V等人則用該檢測(cè)方法定量測(cè)定18位母親在哺乳期三個(gè)月內(nèi)21種母乳低聚糖在不同階段的動(dòng)態(tài)變化, 發(fā)現(xiàn)所有的HMO在產(chǎn)后第4天的含量最高, 而到了第30天時(shí)則減少了20%[48]。

4.2.4 親水相互作用液相色譜法

親水相互作用液相色譜法（Hydrophilic interaction chromatography,HILIC）的保留分配機(jī)制與氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種效應(yīng)密切相關(guān)。HILIC是分析HMO常用的分析方法之一, 有時(shí)也會(huì)被稱(chēng)為正相色譜法。該方法非常適合分離較大質(zhì)量的HMO和HMO的異構(gòu)體, 但對(duì)相似的質(zhì)量較小的碳水化合物分析效果不佳。Sean等通過(guò)親水相互作用液相色譜與熒光檢測(cè)(HILIC-FLD)將2′-FL和乳糖基-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose,LNnT）分離開(kāi)來(lái), 對(duì)這兩種低聚糖進(jìn)行定性定量的檢測(cè)。隨后將該方法與HPAEC-PAD進(jìn)行比較, 應(yīng)用到商業(yè)工廠樣品中, 發(fā)現(xiàn)FLD在分離低聚糖時(shí), 破壞了產(chǎn)品配方基質(zhì)間的相互作用, 使其分離效果好于HPEAC-PAD[49]。

4.2.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜可以與檢測(cè)結(jié)構(gòu)信息的MS檢測(cè)系統(tǒng)聯(lián)用, 其原理是當(dāng)樣品通過(guò)色譜柱后, 各組分之間實(shí)現(xiàn)分離, 待分離組分到達(dá)離子源時(shí), 將待測(cè)組分進(jìn)行分子離子破碎, 產(chǎn)生大量碎片并對(duì)其進(jìn)行分析。該方法不僅可以通過(guò)峰面積對(duì)其進(jìn)行定量分析, 還可以通過(guò)質(zhì)譜碎片進(jìn)行結(jié)構(gòu)的分析以及定性的檢測(cè)。該方法縮短了分析時(shí)間, 是目前分析低聚糖的重要手段之一。Wu等人通過(guò)液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法產(chǎn)生的診斷峰和特征碎片來(lái)區(qū)分同分異構(gòu)體, 建立了一個(gè)30個(gè)SHMO的數(shù)據(jù)庫(kù)和一個(gè)含有45個(gè)中性HMO的數(shù)據(jù)庫(kù)[50-51]。張文源等人用液相色譜-質(zhì)譜法成功分離出LNFPⅠ和LNFPⅢ；LSTa、LSTb和LSTc；2′-FL和3′-FL；3′-SL和6′-SL等4對(duì)同分異構(gòu)體, 并成功定量測(cè)量了12種HMO[52]。Tedesco等人開(kāi)發(fā)了一種HPAEC與質(zhì)譜檢測(cè)儀聯(lián)用的方法來(lái)測(cè)定蜂蜜樣品中碳水化合物組成, 并用該方法成功地對(duì)7個(gè)單糖、8個(gè)二糖、4個(gè)三糖和1個(gè)四糖進(jìn)行了定量檢測(cè)[53]。Rudd P M用HILIC-HPLC和外聚糖苷酶消化法鑒定了牛初乳中33種不同的結(jié)構(gòu)牛乳低聚糖。并結(jié)合MS, 識(shí)別了含有Neu5Gc的4種唾液酸化結(jié)構(gòu)的牛乳低聚糖[54]。Fong B等人也在此方法的基礎(chǔ)上, 測(cè)定了成熟牛乳、牛初乳和嬰兒配方奶粉中3′-SL, 6′-SL, 3′-SLN、6′-SLN, 二唾液酸乳糖(DSL)和N-乙酰半乳糖胺基乳糖(GNL)等6種HMO的含量[55]。美國(guó)學(xué)者Remoroza等人通過(guò)親水相互作用液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法, 建立了1個(gè)含有74種HMO的質(zhì)譜參考圖庫(kù)[56]。Yan等人則是將固相萃取、親水相互作用色譜法和質(zhì)譜法結(jié)合起來(lái), 測(cè)定了1周至4個(gè)月期間酸性母乳低聚糖的含量變化[57]。

4.2.6 核磁共振技術(shù)

核磁共振技術(shù)（NMR）的原理是低能態(tài)的原子核磁矩在恒定場(chǎng)強(qiáng)和交變場(chǎng)強(qiáng)的相互作用下吸收了由交變場(chǎng)強(qiáng)提供的能量后, 躍遷至高能態(tài)的原子核磁矩, 從而產(chǎn)生核磁共振信號(hào)。NMR技術(shù)常應(yīng)用在HMO結(jié)構(gòu)的分析, 目前研究應(yīng)用比較廣泛的是1H NMR。Van等人提出了一種1H NMR快速分析的方法, 該方法可識(shí)別α1-2、α1-3和α1-4糖苷鍵連接的巖藻糖殘基在HMO樣品中是否存在, 并用該方法對(duì)36種HMO樣本進(jìn)行分析, 成功將36個(gè)樣本分成Lewis陽(yáng)性分泌型；Lewis陽(yáng)性非分泌型；Lewis陰性分泌型和Lewis陰性非分泌型四組[58]。目前1H NMR也可用于檢測(cè)尿液和糞便樣品中的HMO, 來(lái)分析嬰兒腸道中HMO的代謝特征, 而且現(xiàn)在也可以運(yùn)用多維核磁共振光譜對(duì)HMO進(jìn)行分析[59]。

4.2.7 其他

還有一些其他的方法也可用于分析HMO。劉世偉等人通過(guò)二氧化碳超臨界流體色譜法分離了18種母乳低聚糖復(fù)雜的同分異構(gòu)體[60]。Mernie等人通過(guò)薄層色譜-質(zhì)譜法對(duì)25種HMO進(jìn)行快速地分離鑒定, 并通過(guò)該方法對(duì)不同時(shí)期的母乳低聚糖進(jìn)行了定量檢測(cè)[61]。

目前可以就用來(lái)檢測(cè)HMO的方法眾多, 但每種檢測(cè)方法均有利弊, 其效率和準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步地提高, 如表2所示。現(xiàn)階段HMO的定量檢測(cè)較為簡(jiǎn)單, 但HMO的高通量檢測(cè)仍是需要攻克的難題。

表2 母乳低聚糖主要檢測(cè)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

5 結(jié)論

母乳中可能含有上千種低聚糖, 但確定名稱(chēng)和結(jié)構(gòu)的HMO有157種。而且由于地區(qū)、泌乳階段、遺傳等因素的影響, HMO種類(lèi)和含量會(huì)發(fā)生變化。目前可以通過(guò)毛細(xì)管電泳、液相色譜或液相色譜-質(zhì)譜等方法對(duì)HMO進(jìn)行定性定量的檢測(cè)。但目前檢測(cè)大量樣品及多種HMO的高通量定性檢測(cè)還有待進(jìn)一步的發(fā)展。

目前國(guó)際上添加到嬰幼兒配方奶粉中的HMO主要有：2′-FL、LNnT、3′-GL、3′-SL和6′-SL等。但是我國(guó)目前嬰幼兒配方奶粉中允許添加的低聚糖只有低聚半乳糖、低聚果糖、多聚果糖、棉子糖和聚葡萄糖等, 所以我國(guó)第五代嬰幼兒配方奶粉的發(fā)展目標(biāo)之一就是優(yōu)化碳水化合物成分。開(kāi)發(fā)出對(duì)樣品中HMO進(jìn)行高通量定性檢測(cè)的方法, 并與現(xiàn)有的母乳低聚糖定量檢測(cè)方法結(jié)合, 去檢測(cè)不同地區(qū)不同泌乳階段的母乳, 總結(jié)HMO的種類(lèi)和含量的變化規(guī)律。這將以便于以后對(duì)0～6個(gè)月、6～12個(gè)月和12～24個(gè)月不同階段的嬰幼兒配方奶粉中HMO種類(lèi)和含量的添加提供依據(jù), 有利于配制出與母乳最為接近的嬰幼兒配方奶粉。