基于超聲-等離子體改性曲拉制備酪蛋白酸鈉的工藝研究

董爽, 王世榮, 尚雅蕾, 宋昱珠, 李曉宇, 鄭鳳華

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院, 山東 淄博 255000）

0 引言

酪蛋白酸鈉是以牦牛乳為主要生產(chǎn)原料進(jìn)行精致加工得到的一種白色酸性固體, 溶于水后呈淡黃色液體[1-2], 是集乳化性、起泡性、保水性等功能特性和高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值于一體的優(yōu)良食品配料[3-4]。曲拉是藏區(qū)牧民利用牦牛乳預(yù)煮加熱、殺菌、發(fā)酵、加熱凝塊、脫水所制得的粗酪蛋白, 是我國(guó)所特有的資源[5-7]。曲拉中含有豐富的蛋白質(zhì), 有利于提高人體免疫力、維持人體腸道正常菌群的穩(wěn)定和平衡等功能[8-9], 其中酪蛋白含量占蛋白質(zhì)總含量的80%左右, 是一種理想的制備酪蛋白酸鈉的原料。目前, 用曲拉制取酪蛋白酸鈉有酸析法[10]、直接浸泡法[11]、再提純法[2]等。以上方法雖然取得一定成效, 但由于工藝復(fù)雜、化學(xué)物質(zhì)殘留、純度低、提取率低等缺點(diǎn), 未得到充分的推廣和應(yīng)用, 需要探究一種清潔環(huán)保, 可有效提高酪蛋白溶出率的方法。

超聲波為頻率20 kHz至100 MHz的機(jī)械波, 其在介質(zhì)中傳播時(shí)會(huì)引起介質(zhì)粒子高頻率的機(jī)械振動(dòng), 有助于提高蛋白質(zhì)的溶解率[12-13]。Moulton等研究[14]通過超聲波技術(shù)對(duì)大豆蛋白進(jìn)行提取, 發(fā)現(xiàn)大豆蛋白質(zhì)提取率由30%提高到80%。梁漢華等研究[15]通過利用低頻超聲波技術(shù)處理了大豆?jié){體和其他豆渣, 促使蛋白質(zhì)和固形物的萃取率提高。朱建華等人[16]利用超聲處理技術(shù)從玉米中提取水分和稻谷蛋白質(zhì), 研究了超聲處理時(shí)間、超聲處理能力和功率等因素對(duì)提取效果的作用, 結(jié)果有效地證實(shí)了超聲處理技術(shù)能夠有效地改善蛋白質(zhì)的溶出度。等離子體是一種準(zhǔn)中性電離氣體, 由電子、離子、自由基、激發(fā)態(tài)原子和大量結(jié)合的中性分子組成[17-18]。其中, 低溫等離子體能夠使食品的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變, 使食物中酶失活[19]并誘導(dǎo)表面親/疏水性改變[20]。研究表明, 延長(zhǎng)等離子體處理時(shí)間會(huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開并重聚形成大的蛋白質(zhì)聚集體, 使得蛋白質(zhì)部分氧化, 泡沫穩(wěn)定性有顯著提高[21]。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 超聲波和等離子體對(duì)于曲拉中蛋白質(zhì)溶出均具有明顯效果, 但其增溶工藝及具體的影響規(guī)律尚不明晰。

基于此, 本研究將超聲波技術(shù)和等離子體技術(shù)相結(jié)合對(duì)曲拉進(jìn)行改性處理, 提高酪蛋白溶出率, 從而增加酪蛋白酸鈉產(chǎn)率。本研究有助于提高曲拉的工業(yè)利用率, 為高效制取酪蛋白酸鈉提供了新的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

曲拉, 甘南州科瑞乳品開發(fā)有限公司；酪蛋白酸鈉, 和政縣華龍乳制品有限公司。

JY 99-ⅡD型超聲清洗機(jī), 北京佳源興業(yè)科技有限公司；CTP-2000R型介質(zhì)阻擋低溫等離子體處理儀, 南京蘇曼科技有限公司；HwS-28型電熱恒溫水浴鍋, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Sorvall BP 8型高速離心機(jī), 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；CM-3600A型色差儀, 紹興市衛(wèi)星醫(yī)療設(shè)備制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酪蛋白酸鈉的制備工藝[22-23]

參考胡濤等研究[2]的方法用曲拉制備酪蛋白酸鈉, 具體試驗(yàn)步驟如下。

曲拉懸浮液→超聲處理→等離子體處理→調(diào)整pH至8.5→磁力攪拌→過濾→離心取上清液→加酸沉淀→酪蛋白凝塊→加水研磨→堿溶→加熱→冷凍干燥→酪蛋白酸鈉

1.2.2 超聲協(xié)同等離子體改性處理

固定基礎(chǔ)水平為超聲處理時(shí)間7 min, 超聲處理功率應(yīng)400 W, 等離子體處理時(shí)間5 min, 等離子體處理功率60 W, 分別在超聲處理時(shí)間1、3、5、7、9、11 min；超聲處理功率300、350、400、450、500 W；等離子體處理時(shí)間1、3、5、7、9 min；等離子體處理功率40、50、60、70、80 W下處理曲拉懸浮液, 獲得不同處理?xiàng)l件的樣品。之后用5 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系的pH為8.5, 經(jīng)過300 r/min磁力攪拌均勻, 55℃下加熱30 min。經(jīng)過100目紗布過濾后取濾液進(jìn)行離心脫脂（3 000 r/min 20 min）, 收集上清液采用雙縮脲法測(cè)定溶解的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以上清液蛋白質(zhì)濃度為響應(yīng)值, 設(shè)置四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn), 優(yōu)化超聲-等離子體處理曲拉制酪蛋白酸鈉的工藝條件, 自變量因素編碼及水平, 見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.3 仿制奶酪的制備工藝

以酪蛋白酸鈉為蛋白基制備仿制奶酪。首先, 將各物料按比例（54.0%飲用水、17.0%植物油、15.0%酪蛋白酸鈉、0.5%瓜爾豆膠、10.0%馬鈴薯淀粉、1.5%白砂糖、1.5%三聚磷酸鈉、0.5%乳酸）依次加入并攪拌均勻。置于80℃水浴鍋加熱10 min后對(duì)混合物料進(jìn)行高速剪切。隨著溫度升高, 混合物從液態(tài)狀逐漸變?yōu)轲こ頎?。?dāng)中心溫度達(dá)到70℃時(shí)換成攪板繼續(xù)攪拌5 min。待冷卻后得到光滑、均一、可拉絲的仿制奶酪。為了分析超聲-等離子體的作用效果, 實(shí)驗(yàn)中以市售酪蛋白酸鈉（市售組）以及未經(jīng)超聲-等離子體處理, 其余步驟處理參數(shù)與優(yōu)化組保持一致的酪蛋白酸鈉樣品為對(duì)照（對(duì)照組）。

1.4 仿制奶酪功能性質(zhì)的測(cè)定

色度值：采用色差儀測(cè)定奶酪樣品的L*、a*、b*值。

感官評(píng)定：組織10名感官評(píng)價(jià)人員, 根據(jù)表2中仿制奶酪的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)從口感、風(fēng)味、組織狀態(tài)等方面對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)定。

表2 仿制奶酪感官評(píng)價(jià)

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)每組均設(shè)置3次平行試驗(yàn), 結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差, 采用IBM SPSS Statistics 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì), 采用Origin 8.0進(jìn)行圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響

如圖1所示, 與未經(jīng)超聲處理的樣品（0 min）相比, 經(jīng)過超聲處理后, 曲拉溶液中的蛋白質(zhì)濃度均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。表明超聲處理可有效促進(jìn)曲拉中蛋白質(zhì)的溶解, 提高溶解度。此外, 隨著超聲處理時(shí)間增加, 曲拉上清液中蛋白質(zhì)濃度呈先下降后增加再下降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲處理3～9 min時(shí), 隨著超聲處理時(shí)間的增加, 蛋白質(zhì)溶解度不斷增加, 在9 min時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。這是因?yàn)槌暡ㄒ鹚肿拥膹?qiáng)烈振動(dòng), 增強(qiáng)了介質(zhì)之間的相互作用, 促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的溶解, 增大了溶解度[12]。然而當(dāng)在較長(zhǎng)的超聲時(shí)間下（9 min）, 曲拉溶液中蛋白質(zhì)發(fā)生了部分聚集[24], 導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度不升反降。

圖1 超聲處理時(shí)間對(duì)曲拉溶液中蛋白質(zhì)濃度的影響

2.1.2 超聲處理功率對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響

由圖2可知, 不同超聲功率下曲拉溶液中蛋白質(zhì)濃度均顯著高于未處理（P＜0.05）。隨著超聲處理功率的增加, 蛋白質(zhì)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì), 在超聲處理功率350 W時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)?？梢娫谝欢ǔ暪β氏拢?00～350 W）, 曲拉中蛋白質(zhì)溶出率與超聲功率呈正相關(guān)。此外, 在350 W之后蛋白質(zhì)溶解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 這可能是與蛋白質(zhì)在較高的超聲強(qiáng)度下發(fā)生了部分變性有關(guān)。

圖2 超聲處理功率對(duì)曲拉溶液中蛋白質(zhì)濃度的影響

2.1.3 等離子體處理時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響

由圖3可知, 在較短的等離子體處理時(shí)間內(nèi)（0.5 min）, 曲拉溶液蛋白質(zhì)濃度相比未處理并沒有顯著增加（P＞0.05）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng), 在1.0 min后蛋白質(zhì)濃度有明顯的增加趨勢(shì), 1.5 min時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)處理曲拉溶液時(shí), 等離子體中的高能粒子可增強(qiáng)蛋白質(zhì)與溶劑之間的相互作用, 蛋白質(zhì)肽鏈?zhǔn)嬲? 暴露出更多的親水基團(tuán), 因而獲得更高的溶解性。但當(dāng)?shù)入x子體處理時(shí)間超過1.5 min后, 蛋白質(zhì)濃度趨于下降, 在處理時(shí)間2.5 min時(shí)蛋白質(zhì)濃度甚至低于未處理。其原因可能是隨著等離子體處理時(shí)間的延長(zhǎng), 曲拉蛋白中羰基不斷增加, 游離巰基不斷減少, 蛋白質(zhì)氧化程度加深, 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)又相互連接, 重聚形成了更大的蛋白質(zhì)聚集體, 蛋白質(zhì)濃度表現(xiàn)為緩慢下降[24]。圖3結(jié)果表明, 等離子體在一定處理時(shí)間內(nèi)（1.0～2.0 min）可有效提高曲拉溶液中蛋白質(zhì)溶解度。

圖3 等離子體處理時(shí)間對(duì)曲拉溶液中蛋白質(zhì)濃度的影響

2.1.4 等離子體處理功率對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響

由圖4可知, 在較低（40 W）和較高（80 W）等離子體處理功率下, 曲拉中蛋白質(zhì)濃度值相比未處理有所降低。而在50～70 W處理功率區(qū)間內(nèi), 蛋白質(zhì)濃度有明顯提高（P＜0.05）。其中等離子體處理功率60 W時(shí), 蛋白質(zhì)濃度達(dá)到峰值。這是由于試驗(yàn)中采用的等離子體放電模式為介質(zhì)阻擋型放電, 低處理功率下不足以導(dǎo)致電壓擊穿, 形成均勻、散漫的放電細(xì)絲, 導(dǎo)致曲拉溶液處理不勻。而在過高的功率下, 處理強(qiáng)度較大, 局部出現(xiàn)由于過度放電產(chǎn)生的電弧, 導(dǎo)致蛋白質(zhì)由于溫度過高發(fā)生變性。

圖4 等離子體處理功率對(duì)曲拉溶液中蛋白質(zhì)濃度的影響

2.2 超聲協(xié)同等離子體處理技術(shù)的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3是通過Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì), 在不同的超聲處理時(shí)間（A）、超聲處理功率（B）、等離子體處理時(shí)間（C）、等離子體處理功率（D）處理?xiàng)l件下曲拉溶液中的蛋白質(zhì)濃度值（Y）。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與方差分析

在表3試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上, 以蛋白質(zhì)濃度為響應(yīng)值, 通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行回歸模型分析, 并建立二次響應(yīng)回歸模型, 得到如下回歸方程：

其中, A為超聲處理時(shí)間, min；B為超聲處理功率, W；C為等離子體處理時(shí)間, min；D為等離子體處理功率, W；Y為曲拉溶液中蛋白質(zhì)濃度, mg/mL。因素之間交互作用的響應(yīng)面及等值線圖如圖5所示。此外, 對(duì)回歸方程進(jìn)行方差, 結(jié)果如表4所示。其中, P＜0.05為顯著, P＜0.01為極顯著。

圖5 因素的交互作用對(duì)曲拉溶液中蛋白質(zhì)濃度的響應(yīng)面立體圖及等值線圖

表4 回歸方程系數(shù)顯著性分析結(jié)果

（續(xù)表4）

由表4結(jié)果可知, 本響應(yīng)面試驗(yàn)建立的模型P＜0.01, 為極顯著, 且失擬項(xiàng)為0.8824, 為不顯著（P＞0.05）, 模型的R-Squared為0.8085, C.V.%為10.62, 表明響應(yīng)面回歸模型可信度較高。一次項(xiàng)A對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響為顯著, D為極顯著, 二次項(xiàng)B2、C2為極顯著, 其余項(xiàng)為不顯著。各因素對(duì)上清液蛋白質(zhì)濃度影響的大小順序依次是D（等離子體處理功率）＞A（超聲處理時(shí)間）＞C（等離子體處理時(shí)間）＞B（超聲處理功率）。

2.2.3 最優(yōu)工藝的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件對(duì)回歸方程模型進(jìn)行優(yōu)化求解, 得到曲拉溶液最優(yōu)增溶工藝為：超聲處理時(shí)間9 min, 超聲處理功率345.11 W, 等離子體處理時(shí)間1.50 min, 等離子體處理功率70 W?？紤]到實(shí)際試驗(yàn)中設(shè)備的可操作性, 將最優(yōu)工藝參數(shù)校正為：超聲處理時(shí)間9 min, 超聲處理功率350 W, 等離子體處理時(shí)間1.50 min, 等離子體處理功率70 W。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)取平均值, 3次驗(yàn)證試驗(yàn)平均值與理論值接近, 表明該模型準(zhǔn)確、有效。在最優(yōu)工藝條件下, 蛋白質(zhì)濃度達(dá)到2.64±0.10 mg/mL。

2.3 酪蛋白酸鈉應(yīng)用于仿制奶酪中的品質(zhì)評(píng)價(jià)

2.3.1 色度值

為了評(píng)價(jià)酪蛋白酸鈉在真實(shí)食品體系中的應(yīng)用性, 本文以酪蛋白酸鈉為蛋白質(zhì)來源制備了仿制奶酪。按照酪蛋白酸鈉的不同將奶酪樣品分為對(duì)照組、優(yōu)化組和市售組, 分別對(duì)3種仿制奶酪的L*（亮度）、a*（紅綠）、b*（黃藍(lán)）值進(jìn)行測(cè)定, 結(jié)果如表5所示。由表5可知, 對(duì)照組的奶酪L*值最大, 即亮度最大, 相比之下優(yōu)化組的奶酪亮度最低。a*值大小排序?yàn)槭惺劢M＞對(duì)照組＞優(yōu)化組, 優(yōu)化組的奶酪樣品偏綠。由b*值可知, 優(yōu)化組顏色偏黃, 與市售組更為接近, 其b*值無顯著差異（P＞0.05）。這是由于超聲和等離子體處理可能會(huì)引發(fā)一定程度的美拉德反應(yīng), 導(dǎo)致樣品顏色變暗變黃。

表5 不同酪蛋白酸鈉來源的仿制奶酪色度值

2.3.2 感官評(píng)價(jià)

根據(jù)感官評(píng)價(jià)表分別對(duì)3種仿制奶酪樣品進(jìn)行風(fēng)味、口感等方面的感官評(píng)價(jià), 所得結(jié)果如圖6所示。優(yōu)化組奶酪在咀嚼性、膠黏性、咸味、奶酪香氣這4方面優(yōu)化組與市售組接近。但在緊實(shí)度、質(zhì)地與硬度與市售組相比仍有一定差距。其原因主要是由于等離子體改性處理, 使曲拉中蛋白質(zhì)多肽鏈結(jié)構(gòu)松散, 一定程度上降低了結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。在等離子體改性大豆分離蛋白（SPI）中研究中也有類似的結(jié)論[25]。

圖6 不同酪蛋白酸鈉來源的仿制奶酪感官評(píng)分

實(shí)驗(yàn)中對(duì)3組仿制奶酪進(jìn)行拉伸性測(cè)試, 由結(jié)果可知, 經(jīng)過多次拉伸實(shí)驗(yàn), 優(yōu)化組所得奶酪質(zhì)地均勻、細(xì)膩、連續(xù), 其最大拉伸長(zhǎng)度與市售組接近如圖7所示。這表明采用超聲協(xié)同等離子體處理曲拉制備的酪蛋白酸鈉可作為蛋白基應(yīng)用于仿制奶酪中, 其品質(zhì)一定程度上與市售組接近。

圖7 不同酪蛋白酸鈉來源的仿制奶酪拉伸性

3 結(jié)論

綜上可知, 超聲-等離子體處理可有效提高曲拉溶液中蛋白質(zhì)溶解度。各因素對(duì)曲拉中蛋白溶出率的影響程度為等離子體處理功率＞超聲處理時(shí)間＞等離子體處理時(shí)間＞超聲處理功率。響應(yīng)面試驗(yàn)得出曲拉的最優(yōu)增溶工藝條件為超聲處理時(shí)間9 min, 超聲處理功率350 W, 等離子體處理時(shí)間1.50 min, 等離子體處理功率70 W。在最優(yōu)工藝條件下, 曲拉中溶出的蛋白質(zhì)濃度達(dá)到2.64±0.10 mg/mL。優(yōu)化組仿制奶酪在咀嚼性、膠黏性、咸味、奶酪香氣、拉伸性能等方面與市售組接近。