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    母乳低聚糖分離與純化工藝技術(shù)現(xiàn)狀

    2022-09-27 07:29:06李云飛欒慶民李珍珍張莉薛雅鶯孔劉娟李克文
    中國乳品工業(yè) 2022年9期
    關(guān)鍵詞:低聚糖乳糖純度

    李云飛, 欒慶民, 李珍珍, 張莉, 薛雅鶯, 孔劉娟, 李克文

    (1.保齡寶生物股份有限公司, 山東禹城 251200;2.山東省功能糖提取與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東禹城 251200;3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海 200240)

    0 引言

    母乳低聚糖(HMO)是母乳中第三大成分(乳糖、脂質(zhì)、低聚糖等), 對嬰兒生長發(fā)育具有特殊的生物活性功能, 是嬰兒配方奶粉母乳化不可或缺的成分[1]。HMO自然資源非常有限, 但是嬰幼兒配方奶粉市場對此需求量很大。近些年, 人們努力尋找和研發(fā)HMO可利用資源, 其中包括從牛羊乳汁中分離提取HMO, 人工化學(xué)合成、酶催化合成和利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)合成HMO, 在HMO生產(chǎn)源頭上取得了長足進(jìn)步, 發(fā)表了大量的研究論文和專利文獻(xiàn)[2-4]。然而, 關(guān)于HMO下游的生產(chǎn)技術(shù)報道卻非常少。本文基于國內(nèi)外相關(guān)研究論文和專利文獻(xiàn), 分析工業(yè)化生產(chǎn)、分離HMO技術(shù)現(xiàn)狀和趨勢, 期望能為我國HMO生產(chǎn)提供參考。

    1 HMO資源與合成途徑

    HMO組成比較簡單, 由5種單糖通過不同數(shù)量或不同連接方式構(gòu)成[5]。5種單糖是:D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、L-巖藻糖(Fuc)和N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸, Neu5Ac)。HMO結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜, 目前已發(fā)現(xiàn)有200余種, 其中結(jié)構(gòu)已明確的約100種, 聚合度3-14約50種, 占HMO質(zhì)量的99%[6]。HMO分子鏈多以乳糖為還原端, 而以Galβ-1,3-GlcNAc(乳糖-N-二糖, I型)或Gal-β1,4-GlcNAc(N-乙酰氨基乳糖, II型)通過β-1,3或者β-1,6與乳糖連接或重復(fù)連接, 構(gòu)成分子鏈的核心結(jié)構(gòu)。巖藻糖通過α-1,2、α-1,3、α-1,4, 或者唾液酸通過α-2,3、α-2,6對分子鏈修飾, 如表1所示, 形成中性低聚糖和酸性低聚糖兩類[7-8], 即巖藻糖基化中性低聚糖(占比35%~50%)、非巖藻糖基化中性低聚糖(42%~55%)和唾液酸化酸性低聚糖(12%~14%)[9]。

    1.1 從牛乳或山羊乳中分離提取

    牛乳或山羊乳中的低聚糖(Bovine Milk Oligosaccharides,BMO;Caprine Milk Oligosaccharides,CMO)是奶酪加工過程中的副產(chǎn)品, 往往隨乳清一起廢棄掉, 不但浪費(fèi)資源, 而且也帶來環(huán)境污染問題[10]。隨著人們對HMO生物功能的認(rèn)知, 從BMO或CMO中分離HMO或者HMO相似低聚糖得到重視。BMO中唾液酸化低聚糖含量比較豐富, 如表1所示, 尤其是3’-唾液酸乳糖(3’-SL)和6’-唾液酸乳糖(6’-SL)是HMO主要成分, 具有促進(jìn)嬰兒大腦神經(jīng)發(fā)育功能。CMO既含有唾液酸化低聚糖, 也含有巖藻糖基化中性低聚糖, 在組成和結(jié)構(gòu)方面與HMO更相似[11], 是生產(chǎn)HMO較好的資源。然而, 由于常乳中BMO或CMO含量非常低, 而且其分子組成和結(jié)構(gòu)也與HMO略有不同, 例如, BMO除了HMO 5種單糖外, 還含有N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc), 在成分方面Galβ-1,3-GlcNAc(乳糖-N-二糖, I型)和中性低聚糖含量很少[9,12]。這些差異增加了HMO工業(yè)化分離、富集和純化困難。

    表1 部分常乳低聚糖結(jié)構(gòu)與含量[8,10-12] g/L

    1.2 化學(xué)合成或酶促合成法

    在化學(xué)合成中, 由于所用原料或者中間體化學(xué)結(jié)構(gòu)不同, 在反應(yīng)過程中往往經(jīng)歷構(gòu)象反轉(zhuǎn)、脫氧或者脫氫等環(huán)節(jié)[13]。又由于每個糖分子都具有多個性質(zhì)相似的羥基, 而兩個糖分子之間的羥基可以形成多種糖苷鍵, 使反應(yīng)產(chǎn)物或者中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常繁雜。為了避免產(chǎn)生不希望的化學(xué)結(jié)構(gòu), 在反應(yīng)過程中對中間體不斷地分離與純化, 對反應(yīng)物基團(tuán)不斷地加保護(hù)和脫保護(hù)處理, 使反應(yīng)過程步驟繁多, 收率低, 以及帶來有毒有害等物質(zhì), 這是阻礙HMO化學(xué)合成工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸[14-15]。目前糖化學(xué)合成工程已有許多改進(jìn)的方法, 例如, 模塊順序合成法、一鍋法和固相合成法等, 合成過程和收率獲得明顯提高[16]。酶促合成法涉及到兩種酶, 糖苷酶(Glycosidases)和糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyl transferases)。糖苷酶具有合成糖苷鍵和水解糖苷鍵的雙重作用, 對底物選擇性不高;而糖基轉(zhuǎn)移酶需要核苷化糖基供體。由于酶的選擇性催化, 大大減少了底物基團(tuán)保護(hù)和脫保護(hù)步驟。酶促合成法取決于酶的性質(zhì)和核苷化糖基供體, 高活性酶和豐富的核苷化糖基供體(例如, UDP-L-巖藻糖)是工業(yè)化酶促合成HMO的關(guān)鍵[17-18]。在分離純化環(huán)節(jié), 反應(yīng)液中非目標(biāo)HMO(或HMO異構(gòu)體)、催化用酶、催化用重金屬、底物及其它衍生物是突出問題。

    1.3 微生物全細(xì)胞合成法

    微生物全細(xì)胞合成法是利用經(jīng)過基因修飾的工程菌在細(xì)胞內(nèi)合成HMO。目前研究較多的宿主菌有大腸桿菌E.coil K12,大腸桿菌E.coil BL21(DE3)[19], 谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、乳酸乳球菌、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等微生物[20]。通過高表達(dá)異源糖基轉(zhuǎn)移酶基因和核苷化糖基供體合成酶基因, 獲得高產(chǎn)率HMO。從遺傳背景掌握, 基因操作方便性, 生長繁殖速度等角度, 大腸桿菌無疑是首選菌。丹麥格禮卡姆公司(Glycom)、德國詹內(nèi)懷恩公司(Jennewein)、美國GlycoSyn公司和比利時Inbiose(杜邦營養(yǎng))公司均利用大腸桿菌E.coil K12或大腸桿菌E.coil BL21(DE3)作為生產(chǎn)菌種生產(chǎn)出2’-FL、LNnT、LNT和DFL(Difucosyllactose)等HMO產(chǎn)品[21-22], 發(fā)酵罐容積已達(dá)到200 m3以上, 2’-FL效價可達(dá)280 g/L[23]。并且作為食品新資源, 先后獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)的GRAS(generally recognized as safe)安全認(rèn)定和歐盟食品安全局新食品認(rèn)證(Novel Foods European Food Safety Authority, NF EFSA)[21,24]。大腸桿菌E.coil BL21(DE3)也被我國食品安全風(fēng)險評估中心(食品添加劑新品種征求意見書)明確為2’-FL的加工助劑(食安通)[25]。在分離純化環(huán)節(jié), 發(fā)酵液中微生物細(xì)胞和碎片、微生物代謝副產(chǎn)品(蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、非目標(biāo)糖酸)、底物等物質(zhì)是突出問題, 尤其是大腸桿菌細(xì)胞外膜脂多糖產(chǎn)生的內(nèi)毒素, 給食品藥品帶來潛在的風(fēng)險, 是分離純化環(huán)節(jié)特別突出的問題。

    2 HMO分離純化工藝

    分離純化是工業(yè)化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié), 反應(yīng)液或發(fā)酵液中含有大量的底物、中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物, 這些雜質(zhì)不但降低了HMO的功能, 而且部分是有毒有害物質(zhì)。HMO作為食品新資源, 目前允許添加的僅有2’-FL、LNnT、LNT、DFL、3-SL[21]。HMO用于其功能分析、安全性評價、以及分析檢驗(yàn)等材料, 要求其應(yīng)有足夠高的純度[26]。分離純化過程主要包括離心沉淀、膜分離、活性炭吸附、色譜分離、結(jié)晶、生物降解等工藝環(huán)節(jié), 具體環(huán)節(jié)和順序取決于被分離體的大小、帶電性質(zhì)、表面活性等性質(zhì)[27]。其中納濾、滲濾、色譜和結(jié)晶等工藝是生產(chǎn)高純度產(chǎn)品的常用技術(shù), 在HMO分離方面有多項(xiàng)專利技術(shù)和相關(guān)文獻(xiàn)報道。

    2.1 納濾與滲濾(Nanofiltration and Diafiltration,NF,DF)

    納濾(NF)和滲濾(DF)均屬于壓力驅(qū)動型分離技術(shù), 其分離機(jī)理是基于空間位阻和靜電力協(xié)同效應(yīng), 如圖1所示。影響NF或DF分離因素非常復(fù)雜, 包括膜表面材料理化性質(zhì)、截留分子量大小、料液pH、流動狀態(tài)、溫度、黏度、顆粒理化特性、跨膜壓力、滲濾容積系數(shù)(Diavolume,DV)等等因素。在HMO分離純化方面, 研究所用NF有效面積從實(shí)驗(yàn)室級(160 cm2)、到中試規(guī)模(2.5 m2)和工業(yè)化規(guī)模(175 m2)[28], 成果與問題主要集中在:(1)利用酶解與生物發(fā)酵相結(jié)合的方法去除雙糖和單糖。由于乳糖分子量(342.30 u)與HMO主要成分(2’-FL, 3-FL, 3’-SL, 6’-SL)分子量(487.4~633.55 u)相近, 且乳糖含量很高, 而低聚糖含量很低, 使后續(xù)分離、富集和純化難度增大。利用米曲霉半乳糖苷酶將乳糖完全水解, 再經(jīng)過釀酒酵母發(fā)酵降解乳糖分解后的葡萄糖和部分半乳糖, 使分離難度降低。該方法在中試規(guī)模上分離BMO或CMO取得了較好的效果[28-30]。例如, 牛初乳乳清(200~300 L, 低聚糖含量0.21 g/L, 乳糖含量21.22 g/L)酶解后發(fā)酵20 h, 葡萄糖被完全降解, 單糖僅剩0.06 g/L, 納濾截留物中低聚糖(3’-SL,6’-SL, 6’-SLN)含量達(dá)95%, 產(chǎn)品純度達(dá)99%[31]。(2)截留分子量(Molecular Weight Cutoff,MWC)對低聚糖收率和純度的影響。MWC大, 低聚糖收率下降, 純度提高;MWC小, 低聚糖收率提高, 純度下降。收率和純度兩個指標(biāo)相互制約[32-33]。多位學(xué)者結(jié)合跨膜壓力和料液透過率等因素, 對MWC 150~1 400 u范圍進(jìn)行了研究, 結(jié)果表明, PA 200~400 u對乳糖截留太多, PVDF1 000 u對3’-SL截留太少, 而SPES 600~800 u效果最好[34]。相似的研究結(jié)果還有利用磺化聚醚砜納濾膜分離低聚糖, MWC 500~700 u分離純化效果較好[35], 而MWC 700~1 000 u低聚糖流失過多[29]。(3)滲濾次數(shù)或者滲濾容積系數(shù)DV(滲濾用水/濾液體積之比)對低聚糖純化的影響。為了提高HMO純度, 在損失一定收率前提下通過納濾(濃縮系數(shù)CF達(dá)到5-10)再滲濾的方法可實(shí)現(xiàn)。研究表明, 牛初乳乳清經(jīng)過納濾至CF10后, 采用間歇式滲濾10次, 截留物中單糖從20%降至1%, 而低聚糖從99%降至95%[35]。采用切流滲濾(容積系數(shù)DV4.6)后, 滲濾前低聚糖與原料液單糖之比為10, 滲濾后低聚糖與原料液單糖之比為100, 低聚糖濃縮純化效果明顯[28]。用納濾(MWC1 ku)并滲濾分離山羊乳清, 當(dāng)滲濾容積系數(shù)達(dá)DV3時, 鹽離子和95%乳糖已被洗脫掉, 80%以上的低聚糖被截留, 低聚糖收率較低與MWC偏大有關(guān)[36]。(4)跨膜壓力選擇??缒毫εc濾膜透過率呈正相關(guān), 但是, 壓力過大加劇截留層壓實(shí)密度和濃差極化后果[35,37]。研究表明, 壓力從0.5~3.5 MPa, 山羊乳清透過率從1.92增加至11.33 Lm-2h-1, 截留物中低聚糖從50.5%增加至89.2%;從3.5~4.0 MPa, 透過率無明顯變化。但是當(dāng)納濾至CF10時, 濃差極化后果明顯, 透過率從10.22 Lm-2h-1降至5.33 Lm-2h-1, 截留層密度從988.3 kg/m3增加至1010.2 kg/m3[38]。(5)膜材料與pH選擇。料液pH影響膜表面材料的電荷強(qiáng)度, pH增加, 膜材料(磺化聚醚砜納濾膜)表面負(fù)電荷增強(qiáng), 對于酸性HMO具有靜電排斥效應(yīng), 起到濾膜的排阻作用, 有利于分離純化。然而, 研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液中含有鹽離子時, pH(4.5, 7.0, 8.5)增加, 酸性低聚糖(3’-SL)截留率并沒有增加, 而中性低聚糖(及葡萄糖和半乳糖等單糖)截留率卻減少。文章認(rèn)為pH增加對膜孔有增大效應(yīng), 導(dǎo)致更多的中性低聚糖透過膜面;而對于酸性低聚糖而言, 靜電相斥作用和膜孔增大作用相互抵消, 其截留率或者透過率無明顯變化[34-35,39-40]。

    圖1 從乳清中分離HMO工藝流程[28]

    2.2 模擬移動床色譜分離

    模擬移動床色譜(Simulated Moving Bed Chromatography,SMB)在制糖業(yè)、食品、制藥和精細(xì)化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域得到推廣應(yīng)用, 尤其對兩組分混合液分離, 具有處理量大、產(chǎn)品純度高、洗脫劑耗量低等諸多優(yōu)點(diǎn)[41-42]。常規(guī)SMB由4個色譜柱和進(jìn)出口閥門等管件構(gòu)成, 形成吸附劑再生區(qū)(I)、提純區(qū)(II)、吸附區(qū)(III)和洗脫劑再生區(qū)(IV)。其中提純區(qū)(II)和吸附區(qū)(III)是主工作區(qū), I、IV再生區(qū)是保障吸附劑和洗脫劑可再循環(huán)利用區(qū)。4個進(jìn)出口按一定時間間隔沿流動相流動方向同步移動, 從而形成固定相逆向移動的模擬效果如圖2所示。SMB在分離低聚半乳糖和低聚果糖方面已有較多報道[43-45], 但是在分離HMO方面報道非常少。主要研究內(nèi)容是:(1)色譜柱數(shù)量和配置方案。色譜柱數(shù)量與設(shè)備投資、運(yùn)行成本及分離性能之間相互制約, 是優(yōu)化研究SMB系統(tǒng)的主要內(nèi)容。德國詹尼溫公司(Jennewein Biotechnologie GmbH)專利技術(shù)介紹了其利用SMB系統(tǒng)分離中性HMO的基本框架, 即每個區(qū)可配置1~3個色譜柱, 整個系統(tǒng)色譜柱數(shù)量在4~12個范圍[46]。對于糖組分較多的混合液, SMB系統(tǒng)可以串聯(lián)應(yīng)用。如圖3所示, 兩組SMB系統(tǒng)共24個色譜柱。第一組SMB系統(tǒng)將單雙糖與三糖及以上低聚糖分離, 第二組將三糖與四糖及以上低聚糖分離。中性HMO 2’-FL從R1口流出, 純度93.0%, 其它雜質(zhì)包括3’-FL(1.1%)、DFL(0.9%)和乳糖(1.0%)[47]。為了強(qiáng)化分離能力, 可以增加提純區(qū)和吸附區(qū)色譜柱的配置數(shù)量, 例如Andreas G.等將8個色譜柱按I區(qū)1個, II區(qū)3個, III區(qū)3個, IV區(qū)1個配置[41]。對于廉價洗脫劑(如水), 洗脫劑沒有必要再生循環(huán)使用, 洗脫劑再生區(qū)IV可以取消[43,48-49]。(2)吸附劑選擇。研究報道較多的是陽離子(H+、K+、Na+、Ca2+)凝膠樹脂吸附劑和尺寸排阻吸附劑。由于離子凝膠吸附劑同時具有離子配位體效應(yīng)和尺寸排阻效應(yīng), 在葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、低聚糖等分離中應(yīng)用較多。用3種離子(K+、Na+、Ca2+)型聚苯乙烯樹脂吸附分離葡萄糖、果糖、蔗糖和低聚果糖, 結(jié)果表明, 葡萄糖和果糖分子量相同, 利用尺寸排阻很難分離, 但是果糖羥基具有更多的直立-平伏鍵, 與離子配位強(qiáng)度大于葡萄糖, 從而得以分離[44-45]。K+離子與糖有較高的親和性, 但是其選擇性能較差, Ca2+型吸附劑分離低聚果糖與小分子糖效果更好。由于離子型吸附劑需要用較強(qiáng)的酸或堿水溶液洗脫與再生[50], 吸附劑穩(wěn)定性也是其選擇因素之一。用尺寸排阻凝膠樹脂(顆粒50~100μm)和配體(離子)交換樹脂(Ca2+離子, 顆粒75~150μm)兩種吸附劑試驗(yàn), 配體(離子)交換樹脂吸附乳糖能力為90~110 g/d, 而尺寸排阻凝膠樹脂吸附能力為24~28 g/d, 前者明顯高于后者。然而, 經(jīng)過近一年的運(yùn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 配體(離子)交換樹脂顆粒在使用過程中出現(xiàn)塌陷和收縮, 使分離純化效果顯著下降。從SMB連續(xù)化生產(chǎn)特性角度, 尺寸排阻凝膠色譜柱更適合于工業(yè)化生產(chǎn)[41]。(3)運(yùn)行參數(shù)選擇。從圖2可知, SMB系統(tǒng)流動相流動狀態(tài)由兩個進(jìn)口和兩個出口流量決定, 固定相模擬移動速率由4個進(jìn)出口同步轉(zhuǎn)換時間決定, 因此, 常規(guī)SMB系統(tǒng)具有5個獨(dú)立變量(即進(jìn)出口轉(zhuǎn)換時間間隔t*(0<t<t*)和4個區(qū)的流動速率)。優(yōu)化5個變量比較復(fù)雜, 往往由試驗(yàn)或者由理想線性模型初步預(yù)測, 再經(jīng)過實(shí)際運(yùn)行修正而確定[51]。隨著理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)研究的不斷進(jìn)展, 進(jìn)出口轉(zhuǎn)換時間t*不斷被細(xì)分, 系統(tǒng)獨(dú)立變量不斷增加, 使系統(tǒng)運(yùn)行更趨完善, 逐步達(dá)到精準(zhǔn)預(yù)測和控制各組分的前鋒位置, 降低組分間交叉污染程度[52-54]。

    圖2 模擬移動床色譜(SMB)基本原理[42]

    圖3 多組分糖SMB分離流程[47]

    2.3 結(jié)晶

    結(jié)晶是混合液分離純化技術(shù)之一, 是在一定濃縮基礎(chǔ)上的后續(xù)工藝。結(jié)晶難易程度取決于物質(zhì)的分子量、溶解度和工藝條件, 分子量大的物質(zhì)往往從溶液中首先析出或結(jié)晶, 例如, 雙糖(蔗糖、乳糖等)從單糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)水溶液中分離[55]。分子量相同或者相近的物質(zhì)取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)或者溶解度, 例如, 果糖在水溶液中溶解度高于葡萄糖, 葡萄糖首先結(jié)晶;乳果糖溶解度高于乳糖, 乳糖首先結(jié)晶[56]。對于低聚糖結(jié)晶, 其結(jié)晶難易程度受分子鏈鏈段自由度、支鏈大小和規(guī)整性等因素影響較大[57]。目前HMO合成與分離的低聚糖主要是3糖或4糖聚合物, 多數(shù)情況下呈不定型的漿狀或粉末[58]。例如, 2’-FL水溶液在較低溫度下仍然很穩(wěn)定, 盡管黏度不高, 從分子擴(kuò)散角度有利于結(jié)晶, 但是即使在過飽和狀態(tài)下2’-FL也很難結(jié)晶[59]。針對發(fā)酵液中含有的單雙糖和一定比例的非目標(biāo)巖藻糖基化乳糖或半乳糖、以及巖藻糖基化乳果糖(如3-FL, 2,2’-FL, 2’,3-FL), 丹麥Glycom A/S公司有多項(xiàng)國內(nèi)外專利技術(shù)介紹2’-FL的結(jié)晶方法。在前處理階段, 原料液經(jīng)過除雜、脫色和真空濃縮或者納濾濃縮等工序后, 如圖4所示, 碳水化合物含量達(dá)到50%~68%(或者2’-FL 550~670 g/L), 其中DFL含量與2’-FL之比控制在2∶8至1∶9范圍內(nèi)。在冷卻結(jié)晶階段, 分批加入冰醋酸(用量2~10 L/kg 2’-FL)和晶種, 結(jié)晶結(jié)束后用冷醋酸(或異丙醇或冷丙酮)淋洗、分離與干燥。該方法獲得的結(jié)晶體, 2’-FL收率達(dá)70%~85%, 純度92%~95%;雜糖含量(特別是DFL)小于2%~3%;冰醋酸含量小于2%~3%[60]。相似專利技術(shù)選擇添加甲醇或者乙醇(C1-C6醇溶液), 獲得的結(jié)晶產(chǎn)品(2’-FL)基本不含其它有機(jī)溶劑和水, 經(jīng)過X射線衍射、DSC和IR光譜檢測, 明確了晶胞尺寸和晶系(單斜晶), 是一種α、β端基異構(gòu)體混合的多晶型物(I、II)[61-62]。

    圖4 2'-FL結(jié)晶分離工藝流程[60]

    3 總結(jié)與討論

    HMO是一種具有生物活性功能的食品新資源, 是嬰兒配方奶粉母乳化的重要組成物質(zhì)。乳清是干酪生產(chǎn)副產(chǎn)品, 資源豐富, 是HMO天然資源之一?;瘜W(xué)合成、酶催化合成和生物發(fā)酵合成也是獲取HMO的人工途徑, 具有工業(yè)化深度開發(fā)的技術(shù)基礎(chǔ)。無論是牛羊乳清還是化學(xué)合成反應(yīng)液, 分離純化HMO是重要的生產(chǎn)環(huán)節(jié)。牛羊乳清中HMO含量很少, 而乳糖含量較高, 是分離純化的主要問題?;瘜W(xué)合成反應(yīng)液除了含有反應(yīng)物和中間物以外, 還有有機(jī)溶劑和重金屬催化劑等殘留物質(zhì)。生物發(fā)酵液除了含有微生物和發(fā)酵底物外, 還有大量的代謝副產(chǎn)品。納濾膜分離、SMB色譜分離和結(jié)晶分離都具有分離純度高的特點(diǎn), 納濾膜分離往往結(jié)合滲濾分離, 在損失一定收率條件下可明顯提高純度。基于膜截留分子量大小和蒸餾塔板理論方法(McCabe-Thiele), 可以對膜分離分級串聯(lián)模式進(jìn)行優(yōu)化[63]。SMB色譜在制糖行業(yè)有較多的應(yīng)用范例, 但是在HMO分離方面報道很少, 試驗(yàn)用原材料稀缺是主要因素。與報道較多的糖漿中分離蔗糖、果糖與葡萄糖、半乳糖與乳糖等分離相比, HMO中組成相同、結(jié)構(gòu)相似的成分較多(如2’-FL、3-FL、2,2’-FL、2’,3-FL等), 酸性糖(3’-SL,6’-SL)也占有較高比例, SMB色譜系統(tǒng)設(shè)計(jì)與優(yōu)化有待深入研究。HMO晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)晶工藝主要出現(xiàn)在有限的專利文獻(xiàn)中, 由于HMO分子量和分子結(jié)構(gòu)不同于小分子糖, 結(jié)晶特性有較大差異。晶種誘發(fā)和有機(jī)酸或醇溶劑分批投放是成功結(jié)晶的關(guān)鍵。3種分離純化技術(shù)(膜分離、SMB色譜、結(jié)晶)在產(chǎn)品收率、純度和生產(chǎn)率方面各有特點(diǎn)。SMB純化性能好, 尤其是結(jié)構(gòu)相似難分離的產(chǎn)品;對于純度要求不是特別高、且生產(chǎn)規(guī)模較大的產(chǎn)品, 膜分離技術(shù)對SMB色譜具有一定的競爭力[64-65];而結(jié)晶分離在產(chǎn)品收率和純度方面略差, 但是設(shè)備投資和運(yùn)行成本均較低[66]。產(chǎn)品分離方案應(yīng)該綜合投資成本、產(chǎn)品規(guī)格和生產(chǎn)規(guī)模等多種因素確定。

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