駝乳制品中抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性乳酸菌的篩選及益生特性研究

曹 英，侯 敏 ，易光平，買爾哈巴·艾合買提，薛 杉，陳鋼糧，崔衛(wèi)東

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，新疆烏魯木齊 830091；3.新疆阿勒泰蝗蟲鼠害預測預報防治中心，新疆阿勒泰 836500；4.新疆旺源生物科技集團有限公司，新疆福海 836400）

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，餐后食物中碳水化合物被-淀粉酶和-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖和果糖等被機體消化吸收引起血糖水平的升高，因此，抑制-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性，可減緩餐后血糖升高，對預防和控制糖尿病起關鍵性作用。目前，常用的降糖藥物如阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等都屬于-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物，長期服用會對人體產(chǎn)生一定的副作用，因此開發(fā)各類副作用小、能兼顧治療并發(fā)癥的藥物，特別是天然物質(zhì)在治療糖尿病方面受到日益重視。

駝乳營養(yǎng)價值豐富，有一定的保健功效，對糖尿病、肺結核、肝炎和胃腸道等疾病的治療有改善作用，有研究表明這與駝乳中蘊含的益生菌資源有關。乳酸菌就是其中之一，它作為一種益生菌對預防和調(diào)節(jié)糖尿病具有一定的作用，一方面通過產(chǎn)生胞外多糖、-氨基丁酸等活性物質(zhì)可緩解糖尿病癥狀，達到降低血糖的目的，另一方面可通過調(diào)節(jié)腸道菌群、增強免疫力、提高抗氧化能力等，對肥胖、糖尿病等慢性代謝疾病起到一定的改善作用。目前，對駝奶及其奶制品中的乳酸菌資源的開發(fā)還有待提升，但是已經(jīng)證明駝乳以及乳制品中有一定的乳酸菌資源。Elvira 等從駝乳和發(fā)酵駝乳中分離得到17 株乳酸菌，羅伊氏乳桿菌占比53%，乳酸乳球菌屬占23%。李遠等從新疆采集的4 份酸駝乳中分離得到22 株乳酸菌，其中乳桿菌屬有16 株占72.72%，其次是乳酸乳球菌屬有3 株占13.63%。駝奶及發(fā)酵駝奶中的乳酸菌對-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制性的研究也較少。分離自馬腸道中的唾液乳桿菌MW1 對-葡萄糖苷酶抑制率高達46.36%，且對酸性、膽鹽、胃腸液環(huán)境的耐受性較好。有研究發(fā)現(xiàn)，人體腸道中的1 株乳桿菌菌株具有抑制-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性能力，并且可以降低體內(nèi)血糖反應。因此，對駝乳及駝乳制品中的益生菌資源的挖掘，借助駝乳及其中的乳酸菌對血糖的調(diào)節(jié)作用，并開發(fā)-淀粉酶和-葡萄糖苷酶降解功能的微生物類食藥產(chǎn)品，對有效替代高價格、高成本的預防和治療糖尿病保健品具有重要意義。

本研究從新疆阿勒泰地區(qū)駝乳制品中篩選對-淀粉酶和-葡萄糖苷酶有抑制活性的乳酸菌，并評價它們對酸性、膽鹽、腸胃液的耐受性、病原菌的抑制作用以及抗氧化活性，為后續(xù)進一步開發(fā)新疆本地具有降糖活性的駝乳制品提供一定的資源支持和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮駝奶和自制的酸駝奶樣品 采集位于阿勒泰吉木乃縣萬駝園地區(qū)牧民自家，用離心管將樣品用干冰低溫保存，快速運回實驗室置于-20 ℃冰箱中暫時保存；大腸桿菌0517、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌

均來自實驗室保藏；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、NA 培養(yǎng)基、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限公司，葡萄糖 天津盛奧化學試劑有限公司；乙酸鈉、硫酸鎂、吐溫80、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉 天津市致遠化學試劑有限公司；檸檬酸氫二銨 天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；硫酸錳 天津市福晨化學試劑廠；可溶性淀粉、甘油 天津市鑫鉑特化工有限公司，胃蛋白酶（1:30000）、胰蛋白酶（1:250）、牛膽鹽、PBS 緩沖溶液、-淀粉酶（50 ku）、-葡萄糖苷酶（100 U）、對硝基苯基--D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、DNS 試劑 上海源葉生物科技有限公司；阿卡波糖 上海麥克林生化科技有限公司；人工胃液 稱取0.3 g 胃蛋白酶、溶于100 mL 50 g/L 的NaCl 溶液中，用1 mol/L HCl 調(diào)整pH 為3.0 后，經(jīng)0.22 μm 的微孔過濾膜過濾除菌備用；人工腸液 稱取0.1 g 胰蛋白酶、溶于100 mL50 g/L 的NaCl 溶液中，用1 mol/L NaOH 調(diào)整pH 為8.0 后，經(jīng)0.22 μm 的微孔過濾膜過濾除菌備用。

Presoo17 型微量高速離心機、YXQ-LS-75SⅡ型壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-2FD 型超凈工作臺 上海博迅醫(yī)療生物儀器公司；ZWY 型恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；UV-6550 型紫外分光光度計 日本自動化設備公司；DK-8D 型電熱恒溫水槽 上海齊欣科學儀器有限公司；SepectraMaxM5e型酶標儀 METTLER TOLEDO；pH 計 梅特勒托利多科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 駝乳樣品中乳酸菌的分離純化 在超凈工作臺中取10 mL 的樣品加入90 mL 的無菌水中，形成稀釋液，吸取1 mL 稀釋液加入到9 mL 無菌試管水中，依次稀釋成10、10、10。每個稀釋度的樣品吸取200 μL 涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上，每個梯度做3 個平行，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)形態(tài)、顏色、大小挑選單菌落繼續(xù)劃線純培養(yǎng)。直至平板上全部為單菌落，對挑選的菌株進行編號，并記錄顏色、大小、形態(tài)，將篩選得到的單菌落進行甘油保藏。

1.2.2 乳酸菌產(chǎn)酸特性 將甘油保存的乳酸菌活化2～3 代，按照3%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r/min 的搖床中恒溫培養(yǎng)18 h，將發(fā)酵液在6000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，在含有1.5% CaCO的MRS 固體培養(yǎng)基平板上選擇合適的間距打孔，取100 μL 的發(fā)酵上清液加入孔中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，測量溶鈣圈直徑。

1.2.3-淀粉酶抑制活性的測定 樣品處理：將凍存于甘油管的乳酸菌活化2～3 代后，以3%的接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，發(fā)酵液在6000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，保留上清液備用。

參考文獻[12]的方法加以修改，將125 μL 樣品上清液與1 mg/mL-淀粉酶溶液等體積混合，于37 ℃孵育10 min，然后將混合液加入至37 ℃的250 μL的1.5%的可溶性淀粉溶液中，于37 ℃反應15 min，再加入500 μL DNS 溶液，在沸水浴中反應5 min 后迅速冷卻至室溫，稀釋20 倍后靜置30 min，并于540 nm 處測定吸光值。用PBS 溶液（0.1 mol/L，pH=6.8）作為-淀粉酶溶液和待測樣品的空白對照，每組設定3 個平行。

式中：A 為樣品組，含有樣品溶液和-淀粉酶溶液；B 為樣品空白組，含有樣品溶液不含-淀粉酶溶液；C 為對照組，不含樣品溶液含-淀粉酶溶液；D 為空白組，不含樣品溶液不含-淀粉酶溶液。

1.2.4-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 樣品處理同1.2.3，測定方法參考文獻[13]并加以修改，取1.5 mL的離心管加入50 μL 的樣液，再加入100 μL 濃度為0.2 U/mL 的-葡萄糖苷酶溶液，將混合物于37 ℃孵化10 min，再加入50 μL 濃度為5 mmol/L 的對硝基苯酚--D-吡喃葡葡糖苷溶液，繼續(xù)在37 ℃恒溫水浴鍋中反應20 min，再加入50 μL 濃度為0.2 mol/L NaCO終止反應，將反應液于405 nm 處測量吸光度值。

式中：A 為樣品組含有樣品溶液以及-葡萄糖苷酶溶液；B 為樣品空白組含有樣品溶液不含-葡萄糖苷酶溶液；C 為對照組不含有樣品溶液含-葡萄糖苷酶溶液；D 為空白組不含有樣品溶液以及-葡萄糖苷酶溶液。

1.2.5 16S rRNA 基因測序及系統(tǒng)發(fā)育學分析 將篩選得到的34 株菌由上海生工生物工程技術服務有限公司進行16S rRNA 基因鑒定，將測定序列提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲取登錄號，得出所鑒定菌株種屬關系。對有抑制-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性的乳酸菌序列，使用MEGA 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.3 乳酸菌益生特性測定

1.3.1 生長曲線和產(chǎn)酸性的測定 將篩選得到的對-淀粉酶和-葡萄糖苷酶有抑制活性的菌株，按照3%的接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃、120 r/min 進行搖床培養(yǎng)，每隔2 h 對發(fā)酵液取樣測定在600 nm 下的吸光度值，以未接菌的MRS 液體培養(yǎng)基作為空白調(diào)零。同時測定發(fā)酵液的pH。

1.3.2 耐酸、耐膽鹽實驗 活化3 代后的菌株，按照3%的接種量接種于pH 為1.0、2.0、3.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)分別在0、6、12 h 測OD處的吸光度值，以未接種的MRS 液體培養(yǎng)基作為空白調(diào)零。

活化后的菌株按照3%的接種量接種于膽鹽添加濃度為1、2、3 g/L 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)分別在0、3、6 h 取樣，測定其OD處的吸光度值，以未添加膽鹽的MRS 液體培養(yǎng)基作為空白調(diào)零。

1.3.3 腸胃液耐受實驗 將活化后的菌液，用滅菌PBS 緩沖溶液清洗3 次（6000 r/min、4 ℃、10 min）菌泥中加PBS 緩沖溶液吹打混勻后制成供試菌液，并調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×10CFU/mL。處理后的菌懸液接種于含9 mL 過濾除菌處理的pH3.0 的人工胃液中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在0、3 h 取樣進行合適的梯度稀釋涂布，平板計數(shù)法測定其活菌數(shù)，計算存活率。

式中：N為人工胃液處理3 h 后的活菌數(shù)；N為人工胃液處理0 h 后的活菌數(shù)。

將在模擬胃液中孵育3 h 后的菌液，接種于經(jīng)過濾除菌的人工腸液中，繼續(xù)置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在0、4 h 取樣進行合適的梯度稀釋涂布，平板計數(shù)測定其活菌數(shù)，計算存活率。

式中：N為人工腸液處理4 h 后的活菌數(shù)；N為人工腸液處理0 h 后的活菌數(shù)。

1.3.4 抗氧化實驗

1.3.4.1 羥自由基清除能力的測定 參考羥自由基試劑盒的方法，在對照管中分別加入試劑一150 μL、試劑二150 μL、HO 750 μL、試劑三300 μL，37 ℃反應20 min 測定吸光度值；空白管中分別加入試劑一150 μL、HO 900 μL、試劑三300 μL，37 ℃反應20 min 測定吸光度值；測定管中分別加入試劑一150 μL、試劑二150 μL、HO 450 μL、試劑三300 μL、樣品300 μL，37 ℃反應20 min 測定吸光度值。

式中：A—不加樣品的比色皿吸光度值；A—不加樣品和試劑二的比色皿吸光度值；A—加樣品和所有試劑的比色皿吸光度值。

1.3.4.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定 參考超氧陰離子自由基試劑盒的方法，在對照管中分別加入試劑一40 μL、試劑二160 μL、HO 100 μL、充分混勻，25 ℃反應1 min，試劑三200 μL、充分混勻，37 ℃反應30 min，試劑四200 μL、試劑五200 μL、充分混勻，37 ℃顯色20 min，測定吸光度值；在測定管中分別加入試劑一40 μL、試劑二160 μL、充分混勻，25 ℃反應1 min，樣品100 μL、試劑三200 μL、充分混勻，37 ℃反應30 min，試劑四200 μL、試劑五200 μL、充分混勻，37 ℃顯色20 min，測定吸光度值。

式中：A—不加樣品的比色皿吸光度值；A—加樣品的比色皿吸光度值。

1.3.5 抑菌實驗 采用打孔法評價乳酸菌的抑菌活性。無菌培養(yǎng)皿中倒入20 mL 的NA 培養(yǎng)基，水平放置在超凈工作臺中靜置至凝固，將100 μL 的指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）菌懸液均勻涂布在NA 培養(yǎng)基上，利用打孔器在NA 培養(yǎng)基上打孔，加入乳酸菌上清液100 μL，加入等量的滅菌MRS 液體培養(yǎng)基作為對照，于37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察并測量抑菌圈。每個菌株做3 次平行，取其平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗重復3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，實驗數(shù)據(jù)用SPSS 24 軟件分析，Duncan 多重比較法進行差異性顯著比較，＜0.05 表示有顯著差異性，使用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)鑒定及產(chǎn)酸特性

通過稀釋涂布法，將分離得到的菌落平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h 后，根據(jù)其菌落形態(tài)、表面特征分離得到34 株菌株，經(jīng)革蘭氏染色初步判斷其中27 株為乳酸菌。其菌落形態(tài)和產(chǎn)酸溶鈣圈直徑如表1 所示。由表可以看出34 株菌在含有碳酸鈣的固體MRS 培養(yǎng)基上均產(chǎn)生溶鈣圈，菌株X23 的溶鈣圈直徑最大達到22.33 mm，其中有5 株菌株的溶鈣圈直徑達到20 mm 以上，有23 株菌株的溶鈣圈直徑達到15 mm 以上，6 株菌株的溶鈣圈直徑在11～15 mm 之間。證明分離得到的菌株均能產(chǎn)生酸性物質(zhì)使碳酸鈣溶解。

表1 34 株菌株的菌落形態(tài)和溶鈣圈直徑Table 1 Colony morphology and diameter of calcium soluble circles of the 34 strains

2.2 菌株的16S rRNA 基因鑒定

為了確定分離得到34 株菌株的種屬，將菌株的16S rRNA 基因鑒定結果進行分析，與GenBank 中已知的相似序列進行比對，結果如表2 所示。34 株菌株的同源性都在97%以上，大于分類研究閾值97%，其中1 株，2 株，5 株，sp 2 株，2 株，1 株，7 株，3 株，2 株，4 株，sp 1 株，1 株，1 株，2 株。其中桿菌有13 株占總細菌數(shù)的38.24%，為優(yōu)勢種（66.67%）。球菌有21 株占總細菌數(shù)的61.76%，分屬于、和3 個屬，為優(yōu)勢種（33.33%）。

表2 菌株的 16S rRNA 鑒定結果Table 2 Results of 16S rRNA identification

續(xù)表 2

2.3 具有降糖活性乳酸菌的篩選

從上述的27 株乳酸菌中，通過DNS 和pNPG法篩選得到6 株對-淀粉酶和-葡萄糖苷酶有抑制活性的乳酸菌。由表3 可知，6 株乳酸菌對-淀粉酶抑制率在50%到90%之間，與陽性對照阿卡波糖抑制率有顯著差異（＜0.05），其中菌株X23、X33、X34對-淀粉酶的抑制率達到了80%以上，抑制率分別為80.97%、83.01%和88.59%，X34 對-淀粉酶的抑制活性顯著高于其余5 株乳酸菌（＜0.05）。X31對-葡萄糖苷酶的抑制率最高為15.43%，與其余5 株乳酸菌之間有顯著性差異（＜0.05），其次是X12 抑制率為13.39%，X23 和X29 對-葡萄糖苷酶的抑制率無顯著性差異（＞0.05），抑制率分別為12.91%和12.62%。篩選的6 株乳酸菌對-淀粉酶和-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用。

表3 乳酸菌對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率Table 3 Inhibition of α-amylase and α-glucosidase by lactic acid bacteria

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將6 株乳酸菌的測序結果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對分析，并將結果上傳至GenBank，發(fā)現(xiàn)6 株乳酸菌與GeneBank 數(shù)據(jù)庫中參考菌株的同源性達到99%以上。利用MEGA 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果如圖1 所示，可以確定菌株X12、X23、X31 和X33 為植物乳桿菌，X29 和X34 為副干酪乳桿菌。

圖1 6 株乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構建Fig.1 Construction of a phylogenetic tree of six strains of Lactobacillus

2.5 乳酸菌的益生特性

2.5.1 乳酸菌的生長曲線和產(chǎn)酸曲線 生長曲線的測定可以反映菌株的生長狀況，對乳酸菌其他性能的研究有參考價值。生長結果如圖2 所示，由生長曲線圖可以看出，6 株乳酸菌在接種的0～2 h 內(nèi)生長緩慢，2 h 后迅速進入生長對數(shù)期，生長旺盛，14 h 后生長速率逐漸減慢，生長的第20 h 乳酸菌的吸光度值達到最高點，20～24 h 菌株生長逐漸進入衰亡期。在6 株乳酸菌中，X23 生長速度最快，說明該菌株適應期與對數(shù)期相比其他菌株較短，6 株乳酸菌在生長第20 h 細菌數(shù)保持相對穩(wěn)定，活菌數(shù)達到最高水平，20 h 后由于培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，菌體死亡速度大于新生速度，出現(xiàn)負增長，吸光度值開始下降。

圖2 6 株乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of 6 strains of lactic acid bacteria

從產(chǎn)酸曲線圖3 中可以看出，6 株乳酸菌在接入MRS 培養(yǎng)基后的0 h 和24 h 發(fā)酵液pH 變化較大，其中X23 發(fā)酵液的pH 從起始的5.54 降低到3.70，其次是X29、X12、X31、X33 和X34。在接種后的2 h 內(nèi)發(fā)酵液的pH 變化不是很大，2～14 h 之間，6 株乳酸菌的發(fā)酵液pH 迅速降低，有5 株乳酸菌X12、X23、X29、X31、X33 在14 h 發(fā)酵液的pH都達到了4.0 以下，菌株X34 在發(fā)酵18 h 時，pH 到達4.0 以下。在18～22 h 內(nèi)菌體濃度最大的時候發(fā)酵液的pH 降到最低，隨后6 株乳酸菌在發(fā)酵的22～24 h 內(nèi)，發(fā)酵液的pH 逐漸趨于穩(wěn)定，這與菌株的生長規(guī)律密切相關。

圖3 6 株乳酸菌的產(chǎn)酸曲線Fig.3 Acid production curves of six strains of lactic acid bacteria

2.5.2 乳酸菌的耐酸性、耐膽鹽能力 由圖4 可知6 株乳酸菌在不同酸度的培養(yǎng)基中生長狀況不同，隨著pH 降低，6 株乳酸菌的生長受到抑制，但均有存活的趨勢，沒有被完全抑制。由圖可以看出6 株乳酸菌對酸性環(huán)境的耐受性強弱為X29＞X34＞X33＞X31＞X23＞X12，其中X29 在pH=1.0 的酸性培養(yǎng)基中脅迫12 h 后，OD 值從0 h 的0.048 增加到12 h的0.083，表現(xiàn)出較高的耐酸性，X12 對酸性環(huán)境敏感耐受性較低?？傮w上6 株乳酸菌對強酸的生長環(huán)境有一定耐受性。

圖4 6 株乳酸菌在不同pH 的培養(yǎng)基中吸光度值Fig.4 Absorbance values of six strains of Lactobacillus in media of different pH values

由圖5 可知不同濃度的膽鹽對菌株的生長影響較大，隨著膽鹽濃度的增加，6 株乳酸菌的生長均受到限制，同一濃度下不同菌株的生長狀況也不相同。其中X12 在3 種不同濃度的膽鹽培養(yǎng)基中吸光度值與其余5 株乳酸菌存在顯著差異（＜0.05），在膽鹽濃度為3 g/L 的培養(yǎng)基中，X12 的吸光度值從第0 h 的0.017 增加到第6 h 的0.315，均顯著高于（＜0.05）其余5 株乳酸菌的吸光度值，表現(xiàn)出較高的膽鹽耐受性。

圖5 6 株乳酸菌在不同膽鹽濃度的培養(yǎng)基中吸光度值Fig.5 Absorbance values of six strains of Lactobacillus in media with different bile salt concentrations

2.5.3 乳酸菌的腸胃液耐受性 對6 株乳酸菌的耐腸胃液耐受性結果如圖6 所示，在模擬胃液中孵育3 h 的乳酸菌，存活率均達到83%以上，其中X29、X31、X33 和X34 在胃液中的存活率達到90%以上。將在胃液中孵育3 h 的乳酸菌接種到人工腸液中孵育4 h，測定乳酸菌對腸液的耐受性，從圖中可以看出，乳酸菌在腸液中孵育4 h 后的存活率均在90%以上，其中X23、X31 和X34 的存活率達到99%以上，對胃液的耐受性6 株乳酸菌之間都存在顯著性差異（＜0.05），X23、X31 和X34 在腸液中的存活率差異不顯著（＞0.05），與剩余3 株乳酸菌之間有顯著性差異（＜0.05），被測定的6 株乳酸菌對腸胃液均表現(xiàn)出較高的耐受性。

圖6 6 株乳酸菌在腸胃液中的存活率Fig.6 Survival of six strains of lactic acid bacteria in gastrointestinal fluid

2.5.4 乳酸菌的抗氧化性能 6 株乳酸菌對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率如表4 所示，乳酸菌發(fā)酵上清液對羥自由基的清除能力較強的菌株依次為X29＞X34＞X31＞X12＞X23＞X33，其清除率分別達到92.43%、91.35%、90.99%、90.90%、90.44%和90.33%，其中X29 對羥自由基的清除率顯著高于其余5 株乳酸菌（＜0.05）。乳酸菌發(fā)酵上清液對超氧陰離子自由基清除率不同，其中清除率最強的是X33 清除率達到94.04%，其次是X23、X12、X31和X29 清除率分別為93.67%、93.40%、93.38%、92.55%，X34 對超氧陰離子自由基的清除能力最低為91.76%，菌株X33 對超氧陰離子自由基的清除率顯著高于其余5 株（＜0.05）。

表4 乳酸菌對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率Table 4 Scavenging rates of hydroxyl radicals and superoxide anion radicals by lactic acid bacteria

2.5.5 乳酸菌的抑菌性能 6 株乳酸菌對食品中常見的3 種食源性致病菌（大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌）的抑菌性測定結果如表5 所示。從表中可以看出，X12、X31 和X33 對3 種病原菌均有明顯的抑制效果，但是X23、X29 和X34 對金黃色葡萄球菌無抑制作用。6 株乳酸菌對3 株病原菌的抑菌圈直徑之間存在顯著差異（＜0.05），菌株X31 對大腸桿菌的抑菌圈直徑達到最大19.63 mm；菌株X23 對沙門氏菌的抑制最大抑菌圈直徑達到19.85 mm；菌株X33 對金黃色葡萄球菌的最大抑菌直徑可達到19.17 mm。不同種屬的乳酸菌產(chǎn)生不同的抑菌代謝產(chǎn)物，導致其對致病菌的抑制活性不同。

表5 6 株乳酸菌對致病菌的抑菌性Table 5 Inhibition of pathogenic bacteria by six strains of lactic acid bacteria

3 結論與討論

通過傳統(tǒng)的稀釋涂布分離法并結合16S rRNA基因序列分析，從新疆阿勒泰地區(qū)駝乳制品中篩選處34 株菌株，經(jīng)鑒定有27 株為乳酸菌，乳明串珠菌屬為該地區(qū)駝乳制品的優(yōu)勢屬，占細菌總數(shù)的35.29%。目前關于駝乳和酸駝乳中乳酸菌的報道研究越來越多，張苗苗等對新疆哈密地區(qū)原駝乳中乳酸菌進行分離鑒定，優(yōu)勢菌屬為明串珠菌屬占35%。Zhao 等從阿拉善某牧場的15 份新鮮駝乳中分離鑒定分離出32 個門、377 個屬和652 個種，其中有72 株乳酸菌，包括，，，ssp.，和。這與研究結果不同，原因可能是采樣的地區(qū)，所處地理環(huán)境和飼養(yǎng)環(huán)境不同影響了菌株的多樣性。

-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制-葡萄糖苷酶活性來控制體內(nèi)碳水化合物的延緩吸收，達到降低餐后血糖的目的，同時-葡萄糖苷酶抑制率是體外篩選乳酸菌是否具有降糖活性的重要指標。乳酸菌在生長繁殖過程中分泌有機酸、胞外多糖、特殊酶系等生物活性物質(zhì)，通過抑制病原菌的生長，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強機體免疫功能，從而有效緩解糖尿病病癥。白璐等發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌通過調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸含量刺激血糖代謝，改善糖尿病小鼠的糖代謝紊亂。Li 等采用pNPG 法篩選出對-葡萄糖苷酶抑制率達到32.19%的植物乳桿菌，通過飼喂發(fā)現(xiàn)能有效改善小鼠胰島素抵抗，提高抗氧化能力。曾珠等從發(fā)酵制品中篩選的副干酪乳桿菌和植物乳桿菌對-葡萄糖苷酶抑制率分別為31%和27%，高于本實驗中乳酸菌對-葡萄糖苷酶抑制率，這可能與菌株的來源不同有關。

為確保篩選的具有抑制酶活性的乳酸菌能有效發(fā)揮降糖作用，對乳酸菌的益生特性進行評價。人體胃液在空腹條件下pH 為0.9～1.8 左右，食用食物后pH 一般保持在3.0 左右。并且人體消化道中含有一定濃度的膽鹽和膽汁酸，益生菌既能夠耐受酸性環(huán)境，又能耐受一定濃度的膽鹽環(huán)境，腸胃液耐受性是篩選益生菌的另一個重要指標，任何益生菌想要到達腸道發(fā)揮益生功能，必須經(jīng)過胃腸道，并且有一定的定值能力。陳歡等從新疆哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中篩選分離得到8 株乳酸菌，其中D-14、D-12 在模擬胃液中的存活率均大于70%。在本實驗中，6 株乳酸菌在pH1.0 的強酸性環(huán)境下脅迫12 h，仍然有一定存活率。隨著膽鹽濃度的增加，乳酸菌的存活率受到一定限制，但沒有被完全抑制生長，表現(xiàn)出較高的耐酸性和膽鹽耐受性。在模擬胃液中的存活率達到85%以上，模擬腸液中孵育4 h 后的存活率在90%以上，表現(xiàn)出較高的腸胃液耐受性。

體內(nèi)存在過多的活性氧會引起機體抗氧化能力下降，氧化應激水平增加，導致機體細胞損傷，這是引發(fā)糖尿病的主要病理機制之一，機體內(nèi)持續(xù)的氧化應激反應造成胰島素抵抗和胰島細胞損傷，引起血糖持續(xù)升高。而乳酸菌在面臨氧脅迫時會產(chǎn)生一系列抗氧化酶包括NADH 氧化酶、NADH 過氧化物酶、過氧化物氫化還原酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶發(fā)生氧化還原反應，清除體內(nèi)的活性氧分子，維持機體氧化還原平衡。本實驗中篩選的乳酸菌對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率均在90%以上，表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。

乳酸菌在代謝過程中能產(chǎn)生細菌素、有機酸、過氧化氫等多種具有抑菌活性的物質(zhì)，是一種天然防腐劑，在食品保鮮等方面有待被加工為更安全、副作用小的新型保鮮劑。Ren 等從發(fā)酵食品篩選的植物乳桿菌對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌長度均達到13 mm 左右，均具有較好的抑菌效果。杜賀超等篩選得到一株抑菌效果最佳植物乳桿菌，發(fā)酵液上清經(jīng)過蛋白酶處理后喪失抑菌活性，證實植物乳桿菌分泌的抑菌物質(zhì)為細菌素。在本實驗中，菌株X12、X31 和X33 對三種病原菌均有明顯的抑制效果，其中X31 對大腸桿菌的抑菌圈直徑達到最大19.63 mm，X23 對沙門氏菌的抑制最大抑菌圈直徑達到19.85 mm，X33 對金黃色葡萄球菌的最大抑菌直徑達到19.17 mm。

綜上所述，本實驗從駝乳制品中篩選的6 株具有潛在降糖活性的乳酸菌，對-淀粉酶和-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，并且表現(xiàn)出良好的益生特性，在產(chǎn)酸能力、耐酸耐膽鹽能力、腸胃液中的存活率較高，抗氧化能力較強，對食品中常見的致病菌有一定的抑制作用，可作為后期研發(fā)功能乳制品的益生菌株。