微滴式數(shù)字PCR 定量檢測(cè)歐洲甜櫻桃中摻假蘋果成分的研究

陳 佳，秦 麗 ，劉 浩，楊 帛，張凱江，趙冬梅，郭金穎，張媛媛,

（1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊 050035；2.河北省知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)中心，河北石家莊 050000；3.秦皇島市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北秦皇島 066001）

櫻桃為薔薇科李屬櫻桃亞屬（L.）植物，起源于里海和黑海，又名鶯桃、荊桃、楔桃、英桃、牛桃、櫻珠，是世界溫帶地區(qū)的一種重要水果。歐洲甜櫻桃汁具有獨(dú)特的酸味、富含花青素和花色苷等黃酮類物質(zhì)，具有清除自由基的作用。美國(guó)路易斯安娜州立大學(xué)農(nóng)業(yè)中心的研究表明，歐洲甜櫻桃果汁在改善睡眠時(shí)間和睡眠質(zhì)量方面有顯著效果。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)際上基于不同程度的摻假現(xiàn)象占50%～80%左右，為牟取利益，商家往往在高附加值水果果汁中進(jìn)行摻假，且水果制品中摻假現(xiàn)象也屢見不鮮。利用顏色、味道等因素在歐洲甜櫻桃果汁中添加低價(jià)果汁，有的甚至?xí)砑恿畠r(jià)糖和有機(jī)酸等。易敏體質(zhì)人群可能會(huì)因食用未標(biāo)識(shí)植物源性添加物后引起過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)發(fā)生中毒反應(yīng)。如用葡萄柚汁代替橙汁可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的藥理相互作用。以上種種摻假現(xiàn)象嚴(yán)重破壞了市場(chǎng)的運(yùn)行機(jī)制。

針對(duì)市場(chǎng)中常見的以低價(jià)替代品摻入高價(jià)值食品中的現(xiàn)象，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大量的研究，確定多種鑒別手段，如感官鑒定法、理化法以及分子生物學(xué)方法等。馬澤亮等設(shè)計(jì)了一套基于電子鼻和電子舌的新型智能感官檢測(cè)系統(tǒng)，并將其應(yīng)用于果汁純度鑒定中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)橙汁純度的定量檢測(cè)。ZHANG等根據(jù)不同果汁中黃酮類、花色苷類等特征性物質(zhì)的差別利用代謝組學(xué)方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)藍(lán)莓汁、蔓越莓汁及摻加蘋果汁、葡萄汁的偽品鑒別。WANG等通過使用氣相色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)集，在主成分分析評(píng)分圖中成功地將100%檸檬汁樣品與含有30%檸檬汁的摻假樣品區(qū)分開來。CHEN 等利用ddPCR定量檢測(cè)出添加在牛肉制品中的鴨肉成分，檢出限為10%。苗麗等利用ddPCR 技術(shù)建立了羊肉質(zhì)量和拷貝數(shù)的關(guān)系，檢出限為10%。楊碩等應(yīng)用多重?cái)?shù)字PCR 技術(shù)定量鑒定出了核桃露中的核桃、大豆成分?，F(xiàn)代分子生物學(xué)以其高特異性等優(yōu)勢(shì)在摻假鑒別中應(yīng)用廣泛，主要技術(shù)有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR，RT-PCR）技術(shù)、數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)等。微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)是一種新型的可以絕對(duì)定量核酸的新型技術(shù)手段，數(shù)字PCR 是將含有核酸模板的PCR 反應(yīng)體系分配到很多反應(yīng)單元中進(jìn)行核酸擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后收集每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，分析后得出樣品中核酸濃度的一種技術(shù)。此技術(shù)直接檢測(cè)樣品中核酸的原始濃度，不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品，與傳統(tǒng)熒光定量PCR 相比，數(shù)字PCR 的靈敏度和精確度更高。

本文采用微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)針對(duì)歐洲甜櫻桃源性成分設(shè)計(jì)特異性引物，建立了歐洲甜櫻桃制品的數(shù)字PCR 定量檢測(cè)方法進(jìn)行摻假檢測(cè)，克服了馬澤亮等依賴于一定的人為主觀因素，不能實(shí)現(xiàn)樣本的絕對(duì)定量及ZHANG 等、WANG 等、CHEN 等、苗麗等摻假檢測(cè)檢出限較高的弊端。實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定量和5%的檢出限。并根據(jù)市場(chǎng)上歐洲甜櫻桃果汁及其制品的分類、添加物進(jìn)行綜合分析選取添加蘋果汁建立摻假模型并驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，為歐洲甜櫻桃果汁以及高附加值漿果的摻假鑒定和質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

歐洲甜櫻桃、蘋果原料及歐洲甜櫻桃果汁及制品 購(gòu)自石家莊市大型超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)；深加工食品DNA 提取試劑盒（非離心柱型）、天根商品化試劑盒、三氯甲烷 北京酷來博科技有限公司；ddPCR 實(shí)驗(yàn)耗材 美國(guó)Bio-Rad 公司。

AdVantage Pro 真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)VirTis公司；A11BS25 分析研磨機(jī) 德國(guó)IKA 公司；Sigma 3K15 冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma 公司；NanoDrop 2000微量核酸蛋白測(cè)定儀 美國(guó)Thermo 公司；C1000 Touch Thermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀、DG8 cartridge 微滴生成卡、Holder 微滴發(fā)生器 美國(guó)Bio-Rad 公司；BCD 235STCY 冰箱 青島海爾股份有限公司；SHAB 水浴恒溫振蕩器 常州潤(rùn)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 購(gòu)自超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)所用鮮果均用果實(shí)部分，鮮果先進(jìn)行去皮去核處理，后進(jìn)行真空冷凍干燥處理，將干燥后的漿果實(shí)驗(yàn)樣品在分析研磨機(jī)中進(jìn)行組織研磨處理，漿果實(shí)驗(yàn)樣本分開處理，避免交叉污染，確保實(shí)驗(yàn)樣本的準(zhǔn)確性，市售樣本的處理方式按相同方法進(jìn)行處理。

1.2.2 基因組DNA 的提取 基因組DNA 的提取采用深加工食品DNA 提取試劑盒的改良版。a.歐洲甜櫻桃與蘋果各稱取5、10、20、30、40、50 mg，向其中加入500 μL GMO緩沖液（Buffer GMO）與40 μL（20 mg/mL）蛋白酶K（Proteinase K），渦旋混勻1 min。60 ℃孵育2 h。孵育過程中始終保持振蕩（1500 r/min）。b.加入GMO緩沖液（Buffer GMO）200 μL，三氯甲烷400 μL，混勻后靜置10 min。c.12000 r/min離心5 min（4 ℃），轉(zhuǎn)移上清。d.加入0.7 倍上清液體積的異丙醇，混勻，12000 r/min 離心5 min（4 ℃），留沉淀。e.加入700 μL 70%乙醇，渦旋振蕩5 s，在離心機(jī)上以12000 r/min 離心2 min，去除上清液。重復(fù)此步驟一次。f.開蓋，徹底晾干殘留乙醇。g.加入50 μL TE 緩沖液，混勻，測(cè)定DNA 含量和純度。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)所用引物均通過NCB 數(shù)據(jù)庫(kù)（National Center of Biotechnology Information，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）尋找到其各個(gè)物種的特異性基因序列，根據(jù)歐洲甜櫻桃、蘋果漿果源性的多個(gè)靶基因序列設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，具體引物及篩選結(jié)果見表1。引物設(shè)計(jì)由軟件DNAman 和Primer5.0 得到，所設(shè)計(jì)的探針5′端和3′端分別采用FAM 熒光基團(tuán)和TAMRA 淬滅基團(tuán)進(jìn)行修飾。

表1 漿果實(shí)驗(yàn)所需引物和探針Table 1 Primers and probes required for berry experiments

1.2.4 微滴式數(shù)字PCR 反應(yīng) 反應(yīng)條件：數(shù)字PCR反應(yīng)條件包括2×ddPCR Super Mix 為10 μL、上游引物的用量為1.2 μL（10 μmol/L）、下游引物的用量為1.2 μL（10 μmol/L）、探針的用量為0.4 μL（10 μmol/L）、DNA 模板為4.0 μL、ddHO 3.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性，10 min；94 ℃變性，1 min；56 ℃退火，45 s；進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，98 ℃，10 min；4 ℃保存。

憲法學(xué)研究要立足于新時(shí)代堅(jiān)持和發(fā)展中國(guó)特色社會(huì)主義的偉大實(shí)踐。積極回應(yīng)社會(huì)發(fā)展中重大的憲法關(guān)切，更加注重原創(chuàng)性和本土性研究，把憲法學(xué)的宏大敘事與具象表達(dá)、研究的開放性與自主性結(jié)合起來。堅(jiān)持中國(guó)特色社會(huì)主義的政治優(yōu)勢(shì)和制度優(yōu)勢(shì)，努力提煉并不斷豐富發(fā)展具有中國(guó)特色和中國(guó)氣派的憲法學(xué)理論體系、概念體系、話語(yǔ)體系，不斷增強(qiáng)中國(guó)憲法學(xué)的解釋力、傳播力和影響力。

操作步驟：a.先將所需實(shí)驗(yàn)?zāi)０灏匆欢ㄌ荻冗M(jìn)行稀釋，制成實(shí)驗(yàn)樣品轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生卡中，同時(shí)加入微滴發(fā)生油70 μL，放入微滴發(fā)生器中，進(jìn)行微滴化處理。b.將制備好的微滴轉(zhuǎn)移到96 孔板中，應(yīng)用封膜儀進(jìn)行封膜處理。c.將封好膜的96 孔板，放到PCR 擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。d.擴(kuò)增結(jié)束后將96 孔板放到QX200 Droplet Reader 中，根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)排版進(jìn)行信息錄入，讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)微滴發(fā)出的熒光信號(hào)的強(qiáng)度判定陽(yáng)性和陰性結(jié)果，并記錄下每個(gè)樣品的陽(yáng)性和陰性的微滴數(shù)。信號(hào)采集完畢后，軟件Quantasoft將計(jì)算出最終結(jié)果并以圖像形式給出。

1.2.5 特異性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)所需物種均設(shè)計(jì)多對(duì)引物，經(jīng)篩選得到最優(yōu)引物。在特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，歐洲甜櫻桃和蘋果分別作為目標(biāo)物種，杏、蘋果、桃、梨、歐洲甜櫻桃、葡萄、樹莓、小櫻桃、蔓越莓、黑加侖作為非目標(biāo)物種，無菌雙蒸水作為空白對(duì)照。

1.2.6 質(zhì)量與拷貝數(shù)關(guān)系曲線的建立

1.2.6.1 歐洲甜櫻桃及蘋果兩種漿果質(zhì)量與提取DNA濃度的關(guān)系 歐洲甜櫻桃和蘋果實(shí)驗(yàn)樣本各稱5、10、20、30、40、50 mg，進(jìn)行基因組DNA 的提取，每個(gè)質(zhì)量重復(fù)3 次，減少實(shí)驗(yàn)誤差，經(jīng)Nanodrop 2000測(cè)定DNA 的含量，從而建立質(zhì)量和其DNA 濃度之間的關(guān)系。

1.2.6.2 歐洲甜櫻桃和蘋果DNA 濃度與數(shù)字PCR的拷貝數(shù)關(guān)系的建立 將提取得到的歐洲甜櫻桃基因組DNA 進(jìn)行系列稀釋，稀釋梯度為5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，蘋果基因組DNA 進(jìn)行系列稀釋，稀釋梯度為5、10、20、40、60 ng/μL，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，為得到準(zhǔn)確的拷貝數(shù)，需對(duì)其稀釋的精確性有較高要求，以無菌雙蒸水作為對(duì)照，得到不同稀釋梯度下的拷貝數(shù)，從而建立DNA 濃度和其拷貝數(shù)之間的關(guān)系。

1.2.7 摻假模型的建立 在歐洲甜櫻桃摻假模型的建立中，歐洲甜櫻桃為主要被摻假對(duì)象，蘋果為摻假對(duì)象，摻假模型以50 mg 為最大摻假質(zhì)量進(jìn)行設(shè)計(jì)，歐洲甜櫻桃與蘋果摻假比例為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。之后將摻假的試驗(yàn)樣本進(jìn)行DNA 提取，并將提取好的基因組DNA 進(jìn)行10 倍稀釋，取4 μL 進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR 檢測(cè)，所得結(jié)果通過公式推算出實(shí)際值和測(cè)量值的差異，進(jìn)而衡量所建立公式的準(zhǔn)確性。

1.2.8 市售樣本分析 本文選自市場(chǎng)上常見歐洲甜櫻桃果汁及制品進(jìn)行摻假實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)前處理、基因組提取、稀釋等方法均與上文樣本保持一致。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測(cè)

基于ddPCR 技術(shù)，選擇常見不同漿果物種作為DNA 模板對(duì)本研究選用的引物進(jìn)行特異性檢測(cè)分析。結(jié)果顯示本文選用的歐洲甜櫻桃、蘋果的引物和探針與杏、桃、梨、葡萄、樹莓、小櫻桃、蔓越莓、黑加侖不存在交叉反應(yīng)，特異性良好（如圖1～圖2），可用于實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。

圖1 歐洲甜櫻桃引物特異性篩選Fig.1 Screening of cherry specific primers

圖2 蘋果引物特異性篩選Fig.2 Screening of apple specific primers

2.2 質(zhì)量和DNA 提取含量的關(guān)系曲線

分別稱取歐洲甜櫻桃和蘋果的6 個(gè)質(zhì)量梯度（5、10、20、30、40、50 mg），每個(gè)質(zhì)量梯度設(shè)置三個(gè)重復(fù)，應(yīng)用Nanodrop2000 對(duì)其提取的基因組DNA進(jìn)行測(cè)定，得到質(zhì)量和DNA 含量的線性擬合曲線。結(jié)果顯示歐洲甜櫻桃和蘋果在其質(zhì)量范圍內(nèi)與提取的基因組DNA 含量線性關(guān)系良好。如圖3～圖4 所示，歐洲甜櫻桃和蘋果的決定系數(shù)分別為0.9972、0.9977，由以上歐洲甜櫻桃和蘋果的相關(guān)性系數(shù)可知均在0.99 以上，說明數(shù)據(jù)具有一定的準(zhǔn)確性，質(zhì)量和DNA 濃度擬合曲線線性良好。

圖3 歐洲甜櫻桃質(zhì)量和DNA 濃度的關(guān)系Fig.3 Relationship between mass and DNA concentration of cherry

圖4 蘋果質(zhì)量和DNA 濃度的關(guān)系Fig.4 Relationship between mass and DNA concentration of apple

2.3 DNA 含量和拷貝數(shù)的關(guān)系曲線

將提取的歐洲甜櫻桃基因組DNA 分別梯度稀釋為5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，蘋果的DNA梯度稀釋為5、10、20、40、60 ng/μL，取4 μL 進(jìn)行數(shù)字PCR 檢測(cè)，進(jìn)行三次重復(fù)，ddPCR 檢測(cè)結(jié)果見圖5。取其DNA 拷貝數(shù)均值進(jìn)行線性擬合分析，歐洲甜櫻桃和蘋果DNA 拷貝數(shù)均隨DNA 含量的增加而增加，兩者呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系（如圖6～圖7），歐洲甜櫻桃和蘋果的線性決定系數(shù)分別為0.9991、0.9946。

圖5 梯度DNA 含量條件下歐洲甜櫻桃（a）、蘋果（b）的拷貝數(shù)圖譜Fig.5 Copies number map of cherry (a) and apple (b) under gradient DNA content conditions

圖6 歐洲甜櫻桃DNA 濃度和DNA 拷貝數(shù)之間的關(guān)系Fig.6 Linear relationship between DNA copy number and nucleic acid concentration of cherry

圖7 蘋果DNA 濃度和DNA 拷貝數(shù)之間的關(guān)系Fig.7 Linear relationship between DNA copy number and nucleic acid concentration of apple

2.4 質(zhì)量與拷貝數(shù)公式的建立

根據(jù)歐洲甜櫻桃模板樣品質(zhì)量和DNA 含量得到一條線性曲線為y=14.455x+27.584，2=0.9972，其中，x 為歐洲甜櫻桃的質(zhì)量M（mg），y 為歐洲甜櫻桃DNA 濃度（ng/μL）。由DNA 含量與拷貝數(shù)得到另一條線性曲線即y=8.3063x+23.218，2=0.9991，其中，x 為歐洲甜櫻桃DNA 濃度（ng/μL），y 為歐洲甜櫻桃DNA 拷貝數(shù)（copies/μL），其中再以DNA 含量為中間值進(jìn)行換算時(shí)，DNA 濃度先經(jīng)過了10 倍稀釋，再取4 μL 進(jìn)行計(jì)算，由此得到質(zhì)量及DNA 拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，以DNA 含量為中間值換算得到歐洲甜櫻桃質(zhì)量與DNA 拷貝數(shù)之間的計(jì)算公式，歐洲甜櫻桃：M=0.0833C-3.8420。同理，蘋果：M=0.4084C-1.5747，其中，M 代表植物源性成分的質(zhì)量（mg），C 代表每微升的拷貝數(shù)（copies/μL）。

2.5 摻假模型的數(shù)字PCR 檢測(cè)

在歐洲甜櫻桃的摻假模型中，共設(shè)置9 個(gè)摻假比例，分別為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。稱取已知混合比例的摻假模型并提取基因組DNA。為驗(yàn)證本方法的適用性和準(zhǔn)確性盡可能模擬市售樣品中存在的摻假情況。取4 μL 稀釋10 倍的基因組DNA 進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行三次重復(fù)，并將測(cè)得的拷貝數(shù)均值代入公式中得到目標(biāo)物種的質(zhì)量。結(jié)果如表2～表3 顯示，歐洲甜櫻桃與蘋果的摻假模型中相對(duì)誤差最大為-19.17%，所得結(jié)果均在統(tǒng)計(jì)學(xué)25%許可范圍內(nèi)。通過分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，本研究所建立的歐洲甜櫻桃、蘋果ddPCR 定量方法可有效應(yīng)用于市售制品的檢測(cè)。

表2 已知比例歐洲甜櫻桃與蘋果摻假模型櫻桃分析結(jié)果Table 2 Analysis results of cherries with known proportion of cherries and apple adulteration model

表3 已知比例歐洲甜櫻桃與蘋果摻假模型蘋果分析結(jié)果Table 3 Analysis results of apple with known proportion of cherries and apple adulteration model

2.6 市售樣本分析

通過對(duì)市場(chǎng)上市售漿果樣本檢測(cè)結(jié)果（見表4）分析可知：歐洲甜櫻桃市售樣本存在摻假情況，其中，樣品Y-1 中測(cè)得歐洲甜櫻桃含量為0，蘋果源性15.37%，樣品Y-2 中測(cè)得歐洲甜櫻桃含量為0，蘋果源性0，樣品Y-3 中測(cè)得歐洲甜櫻桃含量為0，蘋果源性3.17%，樣品Y-4 中測(cè)得歐洲甜櫻桃含量為0，蘋果源性4.15%。通過對(duì)市售樣本的檢驗(yàn)，說明標(biāo)稱含有歐洲甜櫻桃成分的果汁中存在摻假現(xiàn)象，應(yīng)進(jìn)一步開展相關(guān)檢測(cè)工作以保障食品安全，同時(shí)，也驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)所建立的定量檢測(cè)摻假方法具有一定的實(shí)用性和適用性。

表4 市售樣品分析結(jié)果Table 4 Commercial sample analysis results

3 結(jié)論

本文采用微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)對(duì)漿果中歐洲甜櫻桃品種進(jìn)行摻假定量檢測(cè)，通過歐洲甜櫻桃和蘋果兩種漿果的質(zhì)量及其DNA 含量，DNA 含量及其擴(kuò)增DNA 拷貝數(shù)之間的線性擬合關(guān)系，得到歐洲甜櫻桃和蘋果兩種漿果的質(zhì)量和擴(kuò)增DNA 拷貝數(shù)的計(jì)算公式：M=0.0833C-3.8420、M=0.4084C-1.5747，從而可以快速鑒別歐洲甜櫻桃的摻假情況。

為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，構(gòu)建歐洲甜櫻桃摻假模型，計(jì)算歐洲甜櫻桃的實(shí)際摻入量，經(jīng)擴(kuò)增得到的實(shí)驗(yàn)值和實(shí)際加入的摻假質(zhì)量相差不大，最大相對(duì)誤差為-19.17%，都在誤差范圍內(nèi)，上文所述歐洲甜櫻桃數(shù)據(jù)變異系數(shù)小，說明數(shù)據(jù)具有一定的可靠性。

綜上所述，微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行歐洲甜櫻桃的定量檢測(cè)，這為市場(chǎng)上果汁中歐洲甜櫻桃摻假的定量問題提供了一種技術(shù)手段，同時(shí)本研究也為除歐洲甜櫻桃、蘋果這兩種漿果之外的其它漿果的定量檢測(cè)提供了一種檢測(cè)方向，健全了定量檢測(cè)體系。