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    右旋糖酐酶結構、性質及其應用研究進展

    2022-09-27 15:09:10李配婷范廣宇藍雨絲劉楠楠
    食品工業(yè)科技 2022年19期
    關鍵詞:右旋糖酐低聚糖產酶

    李配婷,范廣宇,藍雨絲,劉楠楠,

    (1.江蘇海洋大學,江蘇連云港 222005;2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院(連云港),江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室,江蘇連云港 222005;3.連云港海關,江蘇連云港 222042)

    右旋糖酐是由腸膜明串珠菌()和鏈球菌()等微生物以蔗糖為底物,在右旋糖酐蔗糖酶的作用下合成的-D-吡喃葡聚糖,主要由-1,6 糖苷鍵構成,并含有少量的-1,2、-1,3、-1,4 分支。右旋糖酐的分子量范圍分布廣,從5 kDa 到500 kDa。右旋糖酐因分子質量(Mw)和分支度不同有不同的應用價值,被廣泛用于醫(yī)藥及化工等行業(yè),但分子量較大的右旋糖酐是蔗糖行業(yè)的主要污染物,會增加蔗汁的粘度,延長結晶時間,影響目標產品的產量和質量,給蔗糖行業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。

    目前,降解右旋糖酐的方法很多,常見的是酸解法和酶解法,酸解法耗能高、污染大,而酶解法反應溫和,反應速度快,可以與右旋糖酐發(fā)酵同時進行。右旋糖酐酶可專一性地水解右旋糖酐中的-1,6 糖苷鍵,廣泛應用于醫(yī)藥、食品、口腔等各個行業(yè)。在制糖工業(yè)中,右旋糖酐酶可以水解蔗汁中的右旋糖酐,降低蔗汁的粘度,防止儀器堵塞,加快結晶效率,增加目標產品的回收率和質量。右旋糖酐酶在降解右旋糖酐的同時生成的主要產物異麥芽低聚糖,能夠促進腸道內有益菌的增殖、抑制有害菌的形成,促進腸道的蠕動并且異麥芽低聚糖還具有耐酸耐高溫及良好的持水性等功效,已被成功添加到飼料、保健品、乳制品、餅干小食品及烘焙食品中,發(fā)揮其重要功能。

    右旋糖酐酶存在于多種微生物中,不同微生物來源的右旋糖酐酶其酶學性質差距較大,酶活容易受外界因素(如溫度、pH 等)的影響,并且隨著保存及反應時間的延長而衰減,游離的右旋糖酐酶保存時間短并且不易與目標產品分離,這些因素限制右旋糖酐酶在食品工業(yè)中的應用。近年來,國內外學者聚焦于右旋糖酐酶酶學性質的改善,優(yōu)化產酶條件、通過酶分子的改造構建工程菌、誘變技術誘發(fā)突變體、酶固定化技術等已被實驗驗證在提高右旋糖酐酶產酶量、酶的耐熱性能、酶的穩(wěn)定性等方面有不同程度的作用。文章將對右旋糖酐酶的結構和分類、右旋糖酐酶產酶菌株的篩選、酶學性質改善技術及應用進展進行綜述,以期右旋糖酐酶能夠更好地應用于食品工業(yè)中。

    1 右旋糖酐酶的分類和結構

    根據(jù)催化反應類型,可以將右旋糖酐酶分為內切型右旋糖酐酶(endodextranase,EC3.2.1.11)和外切型右旋糖酐酶(exodextranase,EC3.2.1.70)。內切型右旋糖酐酶隨機內切水解右旋糖酐的-1,6 糖苷鍵,根據(jù)產酶微生物的來源和底物不同,水解產物各有差別,主要是異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖和異麥芽寡糖等的混合物。外切型右旋糖酐酶從右旋糖酐鏈的還原端或非還原端一次切掉1~3 個葡萄糖基,分別可以得到葡萄糖、異麥芽糖和異麥芽三糖。根據(jù)氨基酸序列同源性,右旋糖酐酶被列入GH49和GH66 家族,其主要結構之間存在較大差異:GH49家族的右旋糖酐酶(Aodex)主要有結構域N 和催化結構域C(見圖1A),GH66 家族的右旋糖酐酶(SmDex)主要包括催化結構域A、結構域N 和碳水化合物結合結構域C(見圖1B)。通過定點突變技術將AoDex 中的五個氨基酸突變?yōu)楦拾彼?,突變體經(jīng)發(fā)酵表達后,發(fā)現(xiàn)Q418、D420、E423、D439 四處的氨基酸經(jīng)突變后,右旋糖酐酶幾乎沒有酶活力,最終確定了這四個氨基酸殘基是右旋糖酐酶(AoDex)催化域中的關鍵氨基酸。GH66 家族的右旋糖酐酶利用葡聚糖作為底物,通過分子內轉糖基化作用從葡聚糖合成低聚環(huán)異麥芽糖。用親和標記試劑1-乙基-3-[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亞胺(EDC)和-環(huán)氧烷基-葡糖苷(EAG)修飾酶,發(fā)現(xiàn)若Asp189、Asp340、Glu412 被替換,右旋糖酐酶(SmDex)將失去活性。解析右旋糖酐酶的結構對理解該酶反應機制非常重要。目前右旋糖酐酶蛋白的解析手段有X 射線晶體衍射法、核磁共振及冷凍電鏡等技術,幾種解析手段各有優(yōu)缺點,在后續(xù)研究中,可以結合多種手段更精確地解析右旋糖酐酶的結構,并進一步認識右旋糖酐酶的作用機制從而提高對功能預測的準確度及改造效率。與此同時,隨著蛋白質模板的增多、序列搜索技術和比對工具的優(yōu)化以及片段拼接方法的發(fā)展,人工智能得到飛速發(fā)展,構建重組氨基酸序列,合成目標右旋糖酐酶,可有效提高酶的改造效率,擴展其應用領域。

    圖1 GH49 家族的右旋糖酐酶AoDex(A)和GH66 家族的右旋糖酐酶SmDex(B)的結構Fig.1 The structure of the dextranase AoDex(A)of the GH49 family and the dextranase SmDex(B)of the GH66 family

    2 右旋糖酐酶生產菌株

    隨著右旋糖酐酶及其水解產物的需求不斷增大,對右旋糖酐酶的開發(fā)也隨之增多。右旋糖酐酶的來源非常豐富,真菌、細菌、酵母等不同微生物來源的右旋糖酐酶在酶學性質等方面呈現(xiàn)出差異,見表1。對不同來源右旋糖酐酶的酶學性質的研究主要集中在所產右旋糖酐酶的最大產酶量(即最大酶活)、酶的分子量、右旋糖酐酶的最佳反應條件(包括最佳作用溫度和pH)、以及右旋糖酐酶的穩(wěn)定性等。不同右旋糖酐酶的酶活差距較大,其中來自sp.NK458菌株所產右旋糖酐酶的酶產量高達900 U/mL。右旋糖酐酶的分子量主要分布在40~140 kDa 之間,也有例外,其中,分泌的右旋糖酐酶的分子量為26.5±1.5 kDa,KIBGE-IB25所產的右旋糖酐酶的分子量為158 kDa。酶的最適反應溫度集中在40~60 ℃,不同的最適作用溫度有不同的工業(yè)應用價值,sp GN02菌株所產右旋糖酐酶的最適反應溫度為20 ℃,若用于工業(yè)生產,能大大降低能耗;從澳大利亞大自流盆地的熱水中分離出一種革蘭氏陰性產孢嗜熱厭氧菌產右旋糖酐酶的最適反應溫度高達70 ℃,可用于制糖業(yè)的煮糖工藝中降解右旋糖酐。右旋糖酐酶的最適pH 多集中在4.5~7.0 之間,sp.NK458 適合在堿性環(huán)境中反應,最適反應pH 為9.0,可以根據(jù)作用環(huán)境的酸堿性選擇滿足需要的右旋糖酐酶。另外,右旋糖酐酶的酶活力隨著反應時間的延長而衰減,直至失活,因此右旋糖酐酶的不同環(huán)境下穩(wěn)定性也是專家學者重點關注的點,LP621菌株所產的右旋糖酐酶在在80 ℃條件下作用2 h時仍能夠保留58%的相對酶活,適合在高溫環(huán)境下作用。

    表1 不同微生物來源的右旋糖酐酶及酶學性質Table 1 Dextranase from different microorganisms and their enzymatic properties

    3 右旋糖酐酶酶活及酶學性質改進技術

    不同來源的右旋糖酐酶被開發(fā),探索范圍也從陸地微生物向海洋微生物發(fā)展。但大多數(shù)野生菌株右旋糖酐酶產量普遍不高,酶學性質難以滿足工業(yè)生產的需求,需要有效的技術來提高右旋糖酐酶的產量和改善酶學性質,減緩酶活下降速度,延長右旋糖酐酶保存時間。目前已報道的技術有:優(yōu)化產酶條件、通過酶分子改造構建工程菌、化學或物理方法創(chuàng)建突變體、酶固定化技術等。

    3.1 產酶條件的優(yōu)化

    影響產酶的因素主要有碳源、氮源、溫度、初始pH、裝瓶量、轉速等,產酶條件的優(yōu)化技術主要是在單因素基礎上,通過有效的實驗工具(如正交化試驗、響應面技術等)確定多變量系統(tǒng)的最優(yōu)條件,提高酶產量,進而促進工業(yè)化生產。麻少瑩等通過正交實試驗設計,優(yōu)化并確定最佳發(fā)酵條件,優(yōu)化后,菌株酶活力由原來的79.0 U/mL 提高到231.5 U/mL,酶活力提高了193%。楊齊等通過響應面法優(yōu)化腐皮鐮刀菌()產右旋糖酐酶的發(fā)酵培養(yǎng)基,右旋糖酐酶活力從98 U/mL 提升至228 U/mL,酶活力提升了1.3 倍;黃瑞杰等利用響應面法對圓弧青霉()產右旋糖酐酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的裝瓶量、溫度、初始pH、搖床轉速四個因素進行優(yōu)化,右旋糖酐酶的酶活力較優(yōu)化前提高了30.10%±0.08%;曹研研等通過響應面優(yōu)化技術對棘孢青霉菌F1001 產右旋糖酐酶的發(fā)酵條件中的蛋白胨和誘導劑右旋糖酐的添加量以及裝瓶量三個因素進行優(yōu)化,優(yōu)化后右旋糖酐酶的酶活力高達453 U/mL,比優(yōu)化前提高了88%。

    3.2 通過酶分子改造構建工程菌

    右旋糖酐酶存在于多種微生物中,安全問題和生產率一直是工業(yè)應用的制約因素。為了解決這些問題,研究人員專注于構建工程菌提高右旋糖酐酶產量,進一步改善右旋糖酐酶酶學性質并解析水解產物,以滿足食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)的巨大需求。目前已通過克隆成功表達的宿主有大腸桿菌()、畢赤酵母()、釀酒酵母()等,通過構建工程菌成功提高了重組右旋糖酐酶的酶活并且酶學性質得到了改善:如吳敏等通過克隆棘孢青霉右旋糖酐酶基因并在畢赤酵母中表達,用甲醇誘導并優(yōu)化培養(yǎng)條件后,重組右旋糖酐酶的酶活力高達240.74 U/mL;董冬雪等通過截短酶蛋白序列N 端和C 端方式改造海洋氧化節(jié)桿菌KQ11 右旋糖酐酶,結果N 端和C 端截短后突變酶的最適溫度較野生菌均提高了5 ℃,其中N 端截短的突變酶最適pH 由5.5 變?yōu)?.5,并且小分子量水解產物含量較野生菌顯著提高。

    3.3 創(chuàng)建突變體

    酶的結構決定酶學性質從而影響其功能,大量的研究通過物理誘變如紫外線(UV)照射技術、常壓和室溫等離子體(ARTP)等技術誘發(fā)突變體,提高產酶量并改善酶學性質。Zohra 等通過用UV 照射地衣芽孢()獲得的最高產酶突變體產酶量是野生菌株的7 倍。Wang 等通過采用ARTP 技術誘變KQ11 菌株,突變菌株的酶活比野生菌株高出50%。乙基甲基砜(EMS)是一種廣泛使用的化學誘變劑,已被廣泛用于微生物物種的改造。Yang 等通過ARTP-EMS 聯(lián)用技術誘變野生型球毛殼菌(),突變菌株第578 位的氨基酸殘基從His 變?yōu)長eu,這種改變使得酶在70 ℃條件具有更好的熱穩(wěn)定性并且酶的最大產量高達824.73 U/mL,極大地提高了酶的產量及在高溫下的穩(wěn)定性。

    3.4 固定化酶

    酶活力隨著時間的延長而逐漸衰減,甚至在不利條件(如溫度和pH)下,酶的活力驟減至失活,并且游離態(tài)的右旋糖酐酶重復利用率低,而將右旋糖酐酶固定在載體上可以促進酶催化劑的回收,增加酶在不利條件下(如溫度和pH)的穩(wěn)定性。目前已成功固定右旋糖酐酶的載體有親水性聚乙烯亞胺(PEI)改性磁性氧化石墨烯(GO)復合材料(FeO@PDA@GOPEI)載體,羥基磷灰石載體等。固定在FeO@PDA@GO-PEI 載體上的右旋糖酐酶在60 ℃保存10 h 后,仍有80%的相對酶活;固定化的酶酶活下降明顯放緩,重復使用20 次后,仍留有85.78%的相對酶活。本實驗室篩選并純化的右旋糖酐酶固定在本實驗室自己自備的羥基磷灰石載體上,第30 次使用,固定化的右旋糖酐酶酶水解能力保持在70%以上,并且固定化右旋糖酐酶在20 ℃條件下能夠穩(wěn)定保存99 d 以上,顯著延長了酶的保存期限及提高了右旋糖酐酶的重復使用效率。

    4 右旋糖酐酶的應用

    4.1 生產低聚糖

    根據(jù)以往報道,右旋糖酐酶水解右旋糖酐受底物分子量及右旋糖酐酶濃度影響顯著,產物隨底物分子量及酶濃度不同而發(fā)生改變,主要包括低聚合度的右旋糖酐和異麥芽低聚糖,部分產物里面還有葡萄糖。其中酶解產物異麥芽低聚糖因具有改善腸道菌群結構,調節(jié)機體代謝等益生元的功效而受到廣泛的關注,已被成功添加于飲料、乳制品、烘焙食品及動物飼料中。目前,工業(yè)上生產異麥芽低聚糖的方法主要是淀粉經(jīng)液化、糖化、轉苷、分離純化得到,此法操作繁瑣,并且產品中功能性糖分占比較低。研究表明用右旋糖酐蔗糖酶的轉糖基或用右旋糖酐酶降解葡聚糖能夠得到各種聚合度的葡聚糖,但由于單一的游離的酶制取低聚糖時,很難控制產物的分子量及生成比例,并且酶的重復利用率低,導致酶的使用成本高,需要更為有效的方法來實現(xiàn),以促進酶在制取功能性低聚糖方面得到更好的應用。右旋糖酐酶和右旋糖酐蔗糖酶共固定化技術在低聚糖的制備過程中具有協(xié)同作用的優(yōu)勢:如Huang 等建立雙酶和受體反應體系,通過調整右旋糖酐酶和右旋糖酐蔗糖酶的酶活比,控制相應分子量(Mw)低聚糖(IMO)的生成比例;Bertrand 等通過將右旋糖酐酶固定在環(huán)氧活化的整體對流相互作用介質(CIM?)盤上,發(fā)現(xiàn)固定后的右旋糖酐酶酶促降解速度比游離態(tài)的右旋糖酐酶快5 倍,通過調整固定化酶的數(shù)量、底物濃度和流速定量生產聚合度為8~10 的低聚異麥芽糖。

    4.2 蔗糖行業(yè)的應用

    在蔗糖行業(yè)中,由于微生物的污染,糖液中右旋糖酐的濃度會升高,形成“蔗飯”。高分子右旋糖酐的積累會增加蔗汁粘度、減慢過濾速度、降低蒸發(fā)速率、拉長晶體形狀,影響產品的產量和質量,帶來非常嚴重的經(jīng)濟損失。右旋糖酐是白砂糖酸性絮凝物的主要成分,右旋糖酐含量過高的糖產品用于飲料中,飲料容易產生絮凝物渾濁,用于糖果或巧克力制作中,容易引起糖果和巧克力成型困難,糖衣開裂等問題。在制糖過程中,做好車間衛(wèi)生管理,使用殺菌劑等在一定程度上可以減少微生物的污染,從而降低右旋糖酐的生成,但對于已生成的右旋糖酐最好的方法就是用右旋糖酐酶降解右旋糖酐,生成小分子的糖類。目前,美國、澳大利亞、泰國、日本等國家的部分糖廠已經(jīng)在生產中添加成熟的商用右旋糖酐酶制劑來提高澄清、蒸發(fā)速率并且提高煮煉回收率等,使制糖生產過程的操作更加順利,工業(yè)應用效果明顯,并產生了一定的經(jīng)濟效益。國內也有右旋糖酐酶用于降解蔗汁中右旋糖酐含量從而在部分指標得到改善的相關研究,如賀湘等通過模擬糖廠實際生產流程進行發(fā)現(xiàn)在預灰前,在混合汁中加入10 mg/kg 葡聚糖酶,經(jīng)一系列流程后,葡聚糖含量減少了61.32%,沉降時間減少了13.30%,簡純度提高了0.65%。劉樂等在蔗汁中添加氧化節(jié)桿菌KQ11 右旋糖酐酶,發(fā)現(xiàn)在超聲功率600 W、pH6.5,溫度為50 ℃條件下,0.1 U/mL甘蔗汁的酶劑量可以在15 min 之內清除甘蔗汁內83%的右旋糖酐并且將甘蔗汁的粘度降低20%。陸海勤等通過在混合汁中添加了細麗毛殼球菌發(fā)酵生產的右旋糖酐酶降解右旋糖酐,用常規(guī)的亞硫酸法工藝進行澄清處理后,發(fā)現(xiàn)過濾速度和沉降速度均得到了提高,淸汁渾濁度和色值均得到了不同程度的降低,并且還在不同工藝位點添加該右旋糖酐酶,右旋糖酐的含量也有不同程度的減少。但是這些研究所用到的右旋糖酐酶有的是從國外購買,有的酶產量不高,離制備成商業(yè)制劑用于工業(yè)生產中還有一定的距離,從國外購買的商業(yè)酶制劑價格昂貴,導致右旋糖酐酶在國內糖廠的應用暫時沒有得到普及。專家學者們致力于篩選出產右旋糖酐酶的菌株并運用相關技術提高酶活性,改善其在高溫條件下的穩(wěn)定性,為大規(guī)模生產用于制糖工業(yè)的右旋糖酐酶酶制劑打下基礎,如李衛(wèi)娟篩選到一株海洋細菌KQ11,其在優(yōu)化條件下產右旋糖酐酶的酶活力為4.697 U/mL;顧莉莉通過重組球毛殼菌右旋糖酐酶基因,并在畢赤酵母中異源表達,重組的右旋糖酐酶酶活力由初始的2.692 U/mL 提高至47.915 U/mL,純化后的酶最適作用溫度高達60 ℃;黃曾慰等利用重組黃青霉()右旋糖酐酶基因在畢赤酵母()中表達后經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵,酶活達到1218 U/mL,雖與商業(yè)酶制劑的30000 U/mL有一定差距,但產酶水平已取得了突破性進展,具有大規(guī)模生產的潛力。

    5 總結與展望

    右旋糖酐酶及其水解產物的應用引起了國內外學者的關注,不同微生物來源的右旋糖酐酶已被成功純化并且通過優(yōu)化產酶條件、改造酶分子構建工程菌(克隆技術)、酶固定化等技術不同程度地改善了酶活、酶的耐熱性能及酶的穩(wěn)定性等,總結改進方法,發(fā)現(xiàn)固定化技術及克隆技術更有應用前景,并且部分純化的右旋糖酐酶已通過固定化技術作為商業(yè)酶制劑被添加于漱口水、牙膏等產品中。但由于固定化技術和克隆技術還處于發(fā)展階段,國內右旋糖酐酶在制糖行業(yè)的應用大多處于實驗室階段,制糖行業(yè)所用右旋糖酐酶酶制劑大多從國外購入,使用成本較高,導致右旋糖酐酶在制糖工業(yè)中的應用沒有得到普及,隨著固定化技術和基因工程技術發(fā)展的逐漸成熟,右旋糖酐酶在制糖工業(yè)中將會得到更為廣泛的應用。

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