右旋糖酐酶酶學性質研究

問清江，慕 娟，孫曉宇，丁 浩

(陜西省微生物研究所， 陜西 西安 710043)

右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)屬于糖苷水解酶，專一性裂解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷鍵，使右旋糖酐分子降解為小分子的右旋糖酐、異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶可用于醫(yī)藥工業(yè)和食品工業(yè)，防治齲齒，酶解高分子右旋糖酐制造血漿代用品，在甘蔗制糖業(yè)中處理微生物發(fā)酵產生的大分子右旋糖酐而降低黏度增蔗糖產率[1～3]。右旋糖酐(Dextran)是主要由葡萄糖α-1,6糖苷鍵連接而成的葡聚糖。是世界上第一個工業(yè)化生產的微生物多糖，也是美國FDA批準的第一種可用于食品和藥品的微生物胞外多糖。由腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)產生的右旋糖酐蔗糖酶合成的右旋糖酐含有95%的α-(1,6)糖苷鍵，同時含有少量其它糖苷鍵的分支結構[4]。右旋糖酐具有安全、無毒等多種優(yōu)點，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品等多個領域。臨床上應用的常有3種規(guī)格產品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20，是目前公認的優(yōu)良血漿代用品之一。具有增加血容量、改善微循環(huán)、防止彌散性血管內凝血的作用，主要用于治療失血性休克[5]。藥用右旋糖酐傳統(tǒng)生產工藝是鹽酸水解高分子右旋糖酐得到不同分子量的右旋糖酐，水解效率低，而且引入氯離子產生大量的氯化物嚴重影響了右旋糖酐產品質量，容易產生不良反應。采用右旋糖酐酶水解右旋糖酐，專一性提高水解效率，水解條件溫和，減少氯化物對產品品質的不良影響。對右旋糖酐酶進行酶學性質研究，為右旋糖酐的酶水解前期探究和技術儲備。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 右旋糖酐酶(寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司)。

1.1.2 右旋糖酐(自制)。

1.1.3 試劑 葡萄糖, Sigma公司產品；3, -二硝基水楊酸(DNS),化學純；其他試劑為市售分析純。

1.1.4 儀器 752分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；HH-4A電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐酶的最適反應溫度 適當稀釋酶液，分別在40、45、50、55、60、65℃反應溫度下測定右旋糖酐酶活力，繪制最適溫度曲線確定最適反應溫度。

1.2.2 右旋糖酐酶的最適反應pH 分別用pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0緩沖液適當稀釋酶液，并在相對應不同pH值條件下進行酶促反應，測定右旋糖酐酶活力，繪制最適pH曲線確定最適反應pH。

1.2.3 右旋糖酐酶的最適反應底物濃度 分別在右旋糖酐濃度0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%條件下進行酶促反應，測定右旋糖酐酶活力，繪制底物濃度曲線確定最適反應底物低濃度。

1.2.4 右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性 酶液分別在45、50、55、60、65℃下放置1 h，每隔10 min取樣測定其殘余活力，繪制右旋糖酐酶熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.5 右旋糖酐酶的酸堿穩(wěn)定性 分別用pH2.2、3.0、5.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.6 、10.0的緩沖液適當稀釋酶液，4℃放置24 h，測定其殘余酶活，繪制右旋糖酐酶酸堿穩(wěn)定性曲線。

1.2.6 金屬離子對右旋糖酐酶活力的影響 在適當稀釋的酶液中分別加入Mn2+、 Ba2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Fe3+、Mg2+，使酶促反應體系中金屬離子濃度為5 mmol·L-1，測定右旋糖酐酶活力。

1.2.7 右旋糖酐酶底物特異性 分別以重均分子量T-10、T-40、T-70、T-500、T-1000、T-10000的右旋糖酐為底物進行酶促反應，測定右旋糖酐酶活力。

1.2.8 右旋糖酐酶活力的測定 采用DNS法測定右旋糖酐酶活力。配制1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液，分別量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖標準溶液，用蒸餾水補齊1 mL，再加入2mLDNS，沸水浴2 min，流水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm測定光吸收值，繪制葡萄糖糖標準曲線，得出回歸方程用于葡萄糖和右旋糖酐酶活力測定。將酶液用一定pH值的緩沖液適當稀釋后，取0.5 mL的酶液加入到0.5 mL1%的右旋糖酐溶液中，50℃準確反應10 min，加入2 mLDNS終止反應，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對照，0.5 mL1%的右旋糖酐溶液50℃準確反應10 min，先后加入2 mLDNS和0.5 mL的酶液，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL。以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值，樣品和空白對照的吸光值之差根據(jù)回歸方程得出反應液中的葡萄糖量，從而確定酶活。酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘催化右旋糖酐產生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位(IU)。

2 結果與分析

2.1 右旋糖酐酶的最適反應溫度

圖1溫度對右旋糖酐酶反應的影響

在40、45、50、55、60、65℃不同溫度條件下進行酶促反應,檢測右旋糖酐酶活力，結果見圖1。從圖1可以看出，隨著溫度的升高，由于反應速率的提高，右旋糖酐酶活力呈現(xiàn)增加趨勢，55℃時酶活力最高；隨后右旋糖酐酶活力出現(xiàn)降低趨勢，與酶的熱穩(wěn)定性有關。該右旋糖酐酶的最適反應溫度為55℃。

2.2 右旋糖酐酶的最適反應pH

在pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0不同pH條件下進行酶促反應，檢測右旋糖酐酶活力，結果見圖5。隨著pH值的升高，右旋糖酐酶活力呈現(xiàn)增加趨勢，pH 5.0時酶活力最高；隨后右旋糖酐酶活力出現(xiàn)降低趨勢。該右旋糖酐蔗糖酶的最適反應溫度為pH 5.0。

圖2pH對右旋糖酐酶反應的影響

2.3 右旋糖酐酶的最適反應底物濃度

圖3底物濃度對右旋糖酐酶作用的影響

以不同濃度的右旋糖酐為底物進行右旋糖酐酶的酶促反應，結果見圖3。隨著右旋糖酐濃度的增加，右旋糖酐酶的活力增加，當右旋糖酐的濃度為2%時，酶的活力最高，隨后底物濃度繼續(xù)增加，而酶的活力降低。所以右旋糖酐酶水解右旋糖酐的最適底物濃度為2%。

2.4 右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性

酶液分別在45、50、55、60、65℃下放置1h，每隔10 min取樣測定其殘余活力，未經處理酶活力為100%，不同溫度條件下，相對酶活隨時間變化見圖4。45℃和50℃條件下，1h右旋糖酐酶活力損失不大，相對酶活分別為98%和93%；55℃時，1 h右旋糖酐酶相對酶活下降到76%；60℃時，30 min時酶活力急劇下降到45%，1 h右旋糖酐酶相對酶活下降到29%；65℃時，20 min時酶活力急劇下降到27%。該右旋糖酐酶在50℃以下相對穩(wěn)定。

圖4右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性

2.5 右旋糖酐酶的酸堿穩(wěn)定性

圖5右旋糖酐酶的酸堿穩(wěn)定性

將右旋糖酐酶酶液用不同pH緩沖液適當稀釋，4℃放置24 h，測定其殘余酶活力，結果見圖5。酶液于pH8.0處理24 h，檢測出的酶活力最高，殘余酶活92%；pH 2.2殘余酶活64%以上； pH 9.6殘余酶活74%以上，之后右旋糖酐酶活力急速下降，pH 10.0殘余酶活僅剩19%。結果說明，右旋糖酐酶在pH 2.2～9.6范圍內相對穩(wěn)定，具有較好的酸堿穩(wěn)定性，在右旋糖酐酶的應用中具有相對寬泛的pH范圍。

2.6 右旋糖酐酶底物特異性

以不同分子量的右旋糖酐作為底物進行右旋糖酐酶的酶促反應，結果見圖6。隨著分子量的增大，右旋糖酐酶活力增加，也就是酶的親和力隨底物分子量的增加而增強。T-10最小，T-40 和T-70相近，隨后繼續(xù)增大，T-10 000親和力最大，大大高于T-1 000。右旋糖酐分子量的增大，單個葡聚糖分子的空間體積會上升，與酶蛋白分子結合的幾率會增加，同時單個底物分子可進行切割的位點相應增加也會提高酶促反應的效率。這樣有利于右旋糖酐酶降解制備低分子量的右旋糖酐產品。

圖6右旋糖酐酶底物特異性

2.7 金屬離子對右旋糖酐蔗糖酶活力的影響

不同金屬離子對右旋糖酐酶活性影響見表1，對該酶具有激活作用金屬離子是Mn2+和Ca2+， Mn2+具有顯著的激活作用，Ca2+有微弱的激活作用；Ba2+和Mg2+基本不影響該右旋糖酐酶的作用；具有抑制性的離子順序為Cu2+> Fe3> Zn2+，Cu2+抑制作用最強，對該右旋糖酐酶的抑制力接近40%。

表1 金屬離子對右旋糖酐酶活力的影響

3 討論

右旋糖酐酶是專一性地降解右旋糖酐中的1,6-糖苷鍵，可以將腸膜狀明串珠菌發(fā)酵產生的高分子右旋糖酐酶解為一定分子量分布的右旋糖酐，用于醫(yī)藥等行業(yè)。從溫度對右旋糖酐酶作用影響曲線(圖1)可以看出，反應的最適溫度為55℃，在55℃測出的酶活力遠遠高于其他溫度，說明該右旋糖酐酶在55℃反應速率最高；酶的熱穩(wěn)定性顯示，50℃以下比較穩(wěn)定，55℃就有明顯的活力損失。因此在該右旋糖酐酶用于水解右旋糖酐的溫度選擇是時，既要考慮酶的最適反應溫度，也要考慮它的耐熱性。該右旋糖酐酶作用的最適pH為pH 5.0，酶的酸堿穩(wěn)定性研究表明：在pH2.2～9.6范圍內相對穩(wěn)定，具有良好的酸堿穩(wěn)定性，在右旋糖酐酶的應用中具有寬泛的pH范圍。該右旋糖酐酶作用的最適底物濃度為2%，但是這一數(shù)據(jù)是和酶濃度相關，在具體應用中需要根據(jù)實際情況進一步確定。酶的底物特異性顯示酶的親和力隨底物分子量的增加而增強，尤其是對分子量1 000萬以上的右旋糖酐的親和力遠遠大于100萬以下的右旋糖酐，這一特點有益于酶法降解高分子右旋糖酐制備一定低分子量的右旋糖酐。金屬離子對酶作用應先結果表明，Ba2+和Mg2+對該右旋糖酐酶的作用基本無影響；對該右旋糖酐酶具有抑制性的離子順序為Cu2+> Fe3> Zn2+，Cu2+抑制作用最強；Mn2+具有顯著的激活作用。作用機理有待進一步研究，但在該右旋糖酐酶的應用中應注意到金屬離子的影響。右旋糖酐酶的酶學性質研究，為右旋糖酐酶代替鹽酸水解右旋糖酐生產醫(yī)用右旋糖酐奠定基礎，有助于醫(yī)用右旋糖酐的生產工藝改進，提高產品品質和生產效率，降低生產企業(yè)環(huán)保符合，使醫(yī)用右旋糖酐的生產綠色高效。