ARID1A通過阻斷Wnt/β-catenin通路抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

謝婷婷，譚明華，吳利英，楊 紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710032；*通訊作者,E-mail:yhong32@163.com)

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種妊娠中晚期潛在的多系統(tǒng)性疾病，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和新生兒發(fā)病及死亡的重要病因[1]，但其確切病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。大量研究[2-6]表明，胎盤在PE的發(fā)病機(jī)制中處于中心地位，而滋養(yǎng)層細(xì)胞作為胎盤的主要成分，滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤不足所引起的子宮螺旋動脈重塑障礙是導(dǎo)致PE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。研究證實滋養(yǎng)層細(xì)胞在胎盤發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其有限的遷移和侵襲能力可導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲缺陷和螺旋動脈重構(gòu)異常[7]。因此，研究調(diào)控胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和浸潤能力的關(guān)鍵因素至關(guān)重要。

富含AT的相互作用結(jié)構(gòu)域蛋白1A(AT-rich interactive domain 1A, ARID1A)是染色體重塑復(fù)合物SWI/SNF家族BAF亞基中的一個關(guān)鍵成員。已有大量研究[8-10]發(fā)現(xiàn)ARID1A在多種腫瘤中存在突變。目前已證實ARID1A作為抑癌基因影響許多腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，在腫瘤的增殖、侵襲、遷移以及細(xì)胞周期等方面發(fā)揮重要作用[11]。大量文獻(xiàn)表明腫瘤進(jìn)展與胎盤發(fā)育過程有許多共通之處，正常滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移、侵襲特性及逃避免疫系統(tǒng)的能力與癌細(xì)胞極其相似。目前研究數(shù)據(jù)顯示在人類子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)卵巢癌中，ARID1A是一種公認(rèn)的腫瘤抑制因子[12-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)ARID1A在PE絨毛膜組織中高表達(dá)[15]。但是，ARID1A對滋養(yǎng)細(xì)胞遷移侵襲能力等的影響及其在PE發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚，本研究通過觀察ARID1A對滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，并闡明其潛在的作用機(jī)制，以明確ARID1A在PE發(fā)病機(jī)制中的作用，為PE提供潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取2018年11月至2020年9月本院收治的PE患者30例，設(shè)為PE組，另選取同期健康妊娠分娩的正常孕婦30例，設(shè)為正常組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合PE診斷標(biāo)準(zhǔn)；②分娩孕周≥28周；③單胎；④無原發(fā)性糖尿病、高血壓、冠心病等內(nèi)外科并發(fā)癥。PE組排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除自發(fā)性流產(chǎn)或?qū)m內(nèi)死胎；②胎兒先天性疾病，染色體異常；③通過輔助生殖技術(shù)而懷孕。胎盤組織標(biāo)本收集前征得所有孕產(chǎn)婦同意并簽署知情同意書，組織收集后均-80 ℃凍存。分別采用RT-qPCR法和Western blot法檢測胎盤中ARID1A的mRNA和蛋白表達(dá)水平。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意(倫理批準(zhǔn)號：No. 2019823)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)用含10%胎牛血清(FBS；美國Gibco公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

為了研究ARID1A對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，取對數(shù)生長期的HTR-8/SVneo細(xì)胞，采用Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)試劑轉(zhuǎn)染ARID1A過表達(dá)載體。實驗分組為：control組(無處理)、NC組(轉(zhuǎn)染空載體)、ARID1A組(轉(zhuǎn)染ARID1A過表達(dá)載體)。采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力，采用Transwell法檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲能力，采用RT-qPCR和Western blot法檢測各組細(xì)胞中ARID1A的mRNA和蛋白表達(dá)水平，采用Western blot法檢測MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)水平。

為了研究ARID1A調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的分子機(jī)制，采用Wnt/β-catenin通路的激動劑氯化鋰(LiCl)處理細(xì)胞。實驗分組為：control組(無處理)、NC組(轉(zhuǎn)染空載體)、ARID1A組(轉(zhuǎn)染ARID1A過表達(dá)載體)、ARID1A+LiCl處理組(轉(zhuǎn)染ARID1A過表達(dá)載體后再用50 mmol/L的LiCl處理)。采用Western blot法檢測Wnt/β-catenin信號相關(guān)蛋白Wnt1、β-catenin和Cyclin D1表達(dá)量。

1.2.2 RT-qPCR檢測目的mRNA表達(dá)量 采用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取組織和細(xì)胞總RNA，使用NanoDrop2000(美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行定量。運用PrimeScript RT Reagent試劑盒(日本TaKaRa公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，操作參照說明書。使用SYBR PreMix Ex Taq II試劑(日本TaKaRa公司)在ABI 7500型定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上進(jìn)行RT-qPCR檢測，運用2-ΔΔCt方法計算ARID1A的mRNA相對含量。

1.2.3 Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)水平 采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA蛋白試劑盒(美國Thermo Fisher公司)測定蛋白濃度。取40 μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜(美國Millipore公司)，采用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，加入一抗：anti-ARID1A、anti-MMP-2、anti-MMP-9、anti-Wnt1、anti-β-catenin、anti-Cyclin D1或anti-β-actin(英國Abcam公司)，于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入HRR標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液ECL(美國Millipore公司)顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，利用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。以β-actin為內(nèi)參計算蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5×103個細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48，72 h后，每孔加入5 mg/ml MTT溶液(美國Sigma-Aldrich公司)20 μl。孵育4 h后，棄上清，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩5 min至結(jié)晶充分溶解。用全自動酶標(biāo)儀于490 nm處測定OD值。

1.2.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力 侵襲實驗：轉(zhuǎn)染后的HTR-8/SVeno細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個/ml。吸取200 μl細(xì)胞懸液加入鋪有Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)的Transwell小室中，小室下層加入600 μl含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去上層未穿透膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色15 min。置于倒置熒光顯微鏡下，隨機(jī)選取5個視野觀察穿膜細(xì)胞并拍照計數(shù)。

遷移實驗：除了Transwell小室未包被Matrigel基質(zhì)膠，其余操作同侵襲實驗。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有實驗均重復(fù)至少3次。計量資料數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗，若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，三組及以上組間比較采用one-way ANOVA方差分析，再采用Bonferroni多重比較。若不服從正態(tài)分布，采用兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗或多個獨立樣本的Kruskal-WallisH檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARID1A在PE患者胎盤組織中高表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與正常胎盤組織相比，PE患者胎盤組織中ARID1A mRNA水平顯著升高(t=10.11，P<0.000 1)；Western blot檢測結(jié)果顯示，PE患者胎盤組織中ARID1A的蛋白表達(dá)水平顯著高于正常胎盤(t=15.53，P<0.000 1，見圖1)。

2.2 ARID1A過表達(dá)抑制HTR-8/SVeno細(xì)胞增殖

采用RT-qPCR和Western blot檢測ARID1A過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與control組相比，ARID1A組的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(F=207.3，P<0.000 1；F=162.8，P<0.000 1，見圖2)。與control組相比，ARID1A組細(xì)胞24，48，72 h增殖能力顯著降低(F=7.51，P=0.015 3；F=23.96，P=0.000 4；F=59.92，P<0.000 1；見圖2)。

2.3 ARID1A抑制HTR-8/SVeno細(xì)胞侵襲和遷移能力

與control組細(xì)胞相比，ARID1A組的細(xì)胞侵襲能力和遷移能力顯著降低(F=78.23，P<0.000 1；F=34.33，P=0.000 3，見圖3)。

2.4 過表達(dá)ARID1A抑制侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)

與control組細(xì)胞相比，ARID1A組細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(F=57.1，P<0.000 1；F=33.52，P=0.000 4，見圖4)。

2.5 ARID1A通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移侵襲

與control組細(xì)胞相比，ARID1A組細(xì)胞Wnt1、β-catenin和Cyclin D1(的蛋白表達(dá)水平顯著降低(F=10.86，P=0.001 1；F=35.58，P<0.000 1；F=28.37，P<0.000 1；見圖5)；與ARID1A組相比，ARID1A+LiCl組Wnt1、β-catenin和Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平顯著增加(F=10.86，P=0.027 9；F=35.58，P=0.000 1；F=28.37，P=0.000 6)。與ARID1A組相比，ARID1A+LiCl組細(xì)胞侵襲(F=78.9，P<0.000 1)和遷移能力(F=36.51，P<0.000 1)顯著增加(見圖6)。

與control組相比，*P<0.05；與NC組相比，#P<0.05；與ARID1A過表達(dá)組相比，&P<0.05圖5 ARID1A過表達(dá)及LiCl處理對HTR-8/SVeno細(xì)胞Wnt、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平的影響Figure 5 Effect of ARID1A overexpression or LiCl treatment on the protein expression of Wnt, β-catenin and Cyclin D1

3 討論

滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等功能失調(diào)導(dǎo)致螺旋動脈重構(gòu)受損，對PE的病理發(fā)生有重要影響[16]。滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤不足是引起PE特征性病理變化的主要原因，也是PE發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。滋養(yǎng)層細(xì)胞具有較高的侵襲、遷移等特性，與腫瘤細(xì)胞相似，但不同的是滋養(yǎng)層細(xì)胞具有嚴(yán)格的時空限制和精細(xì)調(diào)控，同時僅限于子宮的早期妊娠[4]。因此，深入探究PE的發(fā)病機(jī)制、干預(yù)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和浸潤能力對尋求新的治療手段具有重要意義。ARID1A參與腫瘤細(xì)胞遷移侵襲過程的調(diào)控，且在PE患者胎盤組織中高表達(dá)，故推測ARID1A可能通過調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移侵襲過程參與PE病理機(jī)制的調(diào)控。根據(jù)Fantone等[15]的研究結(jié)果，PE患者(n=9)胎盤中ARID1A陽性細(xì)胞約占90%，健康妊娠分娩的正常孕婦(n=10)胎盤中ARID1A陽性細(xì)胞約占3%，采用GPower3.1.9.2軟件計算得到各組需要的最小樣本量為2。本研究納入PE患者和同期健康妊娠分娩的正常孕婦各30例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARID1A在PE患者胎盤組織中表達(dá)水平顯著高于康妊娠分娩的正常孕婦。Jin等[17]也發(fā)現(xiàn)ARID1A在PE患者胎盤組織中高表達(dá)。Fantone等[15]的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ARID1A在正常胎盤的絨毛狀和絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中特異表達(dá)，在合胞滋養(yǎng)層細(xì)胞無表達(dá)；然而，ARID1A在PE患者的胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和合胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中均有表達(dá)；ARID1A是一個滋養(yǎng)層細(xì)胞分化不良的分子標(biāo)志。這提示ARID1A可能在PE發(fā)病過程中具有重要作用。

與control組相比，*P<0.05；與NC組相比，#P<0.05；與ARID1A組相比，&P<0.05圖6 Wnt/β-catenin通路參與ARID1A對滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲遷移的抑制作用Figure 6 Wnt/β-catenin signaling is involved in the inhibitory effect of ARID1A on cell invasion and migration of HTR-8/SVneo cells

為證實ARID1A在PE發(fā)病過程中具體作用，本研究以HTR-8/SVeno細(xì)胞為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ARID1A顯著抑制細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力。Jin等[17]在滋養(yǎng)層樣細(xì)胞系JEG-3也得出類似的結(jié)論。這提示ARID1A可能通過抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲遷移能力參與PE的發(fā)生發(fā)展。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中重要的效應(yīng)分子，與滋養(yǎng)層細(xì)胞的病變密切相關(guān)[18]。研究證實，PE患者胎盤組織中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平顯著降低，在PE病理發(fā)展中起關(guān)鍵性作用[19,20]。MMP-2表達(dá)失調(diào)和MMP-2活性降低參與妊娠期高血壓患者子宮胎盤異常重構(gòu)和滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲[19,21]。MMP-9下調(diào)也會導(dǎo)致PE滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲遷移過程[22]。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)ARID1A可顯著下調(diào)HTR-8/SVeno細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平，證實ARID1A通過調(diào)控MMP-2和MMP-9表達(dá)從而抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲及遷移能力。

Wnt/β-catenin信號通路通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和增殖，在PE發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[23,24]。有文獻(xiàn)報道，重度子癇前期婦女的胎盤中Wnt1、β-catenin和Cyclin D1水平降低，而DKK1水平升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路的抑制可能導(dǎo)致PE[25]。此外，Wnt/β-catenin信號通路的激活能夠促進(jìn)人滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲[26]。然而，在滋養(yǎng)層細(xì)胞中，ARID1A是否通過Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，ARID1A過表達(dá)能夠抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-catenin和Cyclin D1的表達(dá)水平，而Wnt/β-catenin的激動劑LiCl能夠明顯上調(diào)這些蛋白的表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)ARID1A對滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制作用，這提示ARID1A可能調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移及侵襲。然而，ARID1A調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究證實ARID1A可能通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制人滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVeno的侵襲遷移過程，為PE的治療提供新的潛在靶點。