蘆丁減輕LPS誘導的牙周膜干細胞炎癥、成骨分化和成脂作用

蘭 婷,賈 如

(1西北婦女兒童醫(yī)院口腔科，西安 710061；2西安交通大學附屬口腔醫(yī)院修復科；*通訊作者,E-mail:jiaru1987@mail.xjtu.edu.cn)

牙周炎是一種慢性炎性疾病，可引起牙齦脫離和牙槽骨崩解[1]。文獻表明，牙周炎與骨質(zhì)疏松癥等全身性疾病相關(guān)[2]，而且牙周炎與免疫反應有關(guān)，并受革蘭氏陰性細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的影響[3]，但目前尚未完全闡明LPS-宿主相互作用的具體機制。牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)主要分布于牙周膜組織，其功能主要負責牙周韌帶和牙槽骨的穩(wěn)態(tài)[4,5]，PDLSCs具有成骨分化潛力，可以修復和再生受損的牙周骨組織[6]。研究表明，PDLSCs可遷移至牙周病變的部位并介導牙周再生[7]，PDLSCs在免疫缺陷小鼠中移植后會產(chǎn)生牙骨質(zhì)/牙周韌帶(periodontal ligament，PDL)樣組織[8]。然而，炎性環(huán)境會損害PDLSCs的成骨分化[8]，文獻研究結(jié)果也表明，多種炎性因子對PDLSCs成骨分化具有抑制作用[9]。

蘆丁也稱為維生素P或紫槲皮苷，是一種黃酮醇類黃酮，主要存在于果蔬植物中，其具有許多藥用價值，如抗癌、抗炎和抗氧化活性。文獻表明，蘆丁能夠治療炎性疾病和促進骨骼的再生[10]，蘆丁還可以在骨髓間充質(zhì)干細胞中發(fā)揮骨保護作用[11]。同時也有研究表明，蘆丁對骨細胞具有成骨促進作用，影響骨細胞的增殖活性[12]。Toll樣受體(toll-like receptor，TLRs)是一類跨膜受體，可以識別并結(jié)合相應病原體相關(guān)分子，激活信號轉(zhuǎn)導途徑并誘導炎癥細胞因子等一些免疫效應分子的表達[13]。TLR4是LPS和脂質(zhì)A的受體，當LPS與TLR4結(jié)合時可激活白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促炎性細胞因子的表達[14]。研究表明，LPS誘導PDLSCs的Toll樣受體4/髓樣分化因子88(Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88, TLR4/MyD88)復合物的激活，并進一步引發(fā)細胞因子的釋放[15]。但TLR4在PDLSCs分化中的確切作用，以及潛在的分子機制尚未得到詳細研究。本研究通過以PDLSCs細胞為載體，觀察蘆丁和LPS對PDLSCs細胞作用后所產(chǎn)生的成骨分化、炎癥反應、氧化應激以及TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達水平的變化，以探究蘆丁是否可以減緩LPS對誘導PDLSCs成骨分化、成脂作用和TLR4/NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

青霉素、鏈霉素和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)購于成都里來生物科技有限公司；FBS、α-MEM培養(yǎng)基、RIPA裂解液、化學發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司；LPS和蘆丁購于美國Sigma公司；培養(yǎng)皿購于NEST公司；胰蛋白酶、膠原酶購于美國Gibco公司；茜素紅S購于上海雅吉生物科技有限公司；堿性磷酸酶(ALP)分析商用試劑盒、多聚甲醛購于碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購于北京天根生化科技公司；Trizol試劑、ALP染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；NO試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；ELISA商用試劑盒購于上海紀寧實業(yè)有限公司；誘導型一氧化氮合酶(iNOS)試劑盒購于上海遠慕生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q RT Super Mix南京諾唯贊生物技術(shù)股份有限公司購于；一抗(p-NF-κB p65、MyD88、TLR4和GAPDH)和二抗IgG購于英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PDLSCs的分離、培養(yǎng)及實驗分組 本研究均獲得每位受試者的知情同意，本項研究得到了西北婦女兒童醫(yī)院倫理委員會的批準(批準號：No.2019-1-23-1016)。牙齒取自15～25歲的志愿者，他們需要正畸治療以提取其前磨牙。在正畸拔除后，將牙齒轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，并用含抗生素(100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗牙齒3～4次，以去除凝結(jié)的血液。用手術(shù)刀片從牙根表面中間1/3處輕輕刮取牙周膜組織，然后用剪刀徹底切割成小塊并將其轉(zhuǎn)移到離心管中。向離心管中加入0.1%膠原酶，并置于37 ℃中消化60 min，然后加入1%胰蛋白酶繼續(xù)消化30 min。加入等體積含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基溶液終止消化，于2 000 r/min離心10 min，去除上清，將沉淀使用含20% FBS的α-MEM培養(yǎng)基重懸，接種到10 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2和37 ℃。每隔2～3 d更換1次培養(yǎng)基，直到細胞達到80%～90%的融合度。

為了選擇LPS的最佳使用濃度，根據(jù)實驗設(shè)計方案，將PDLSCs細胞于含不同濃度LPS(0，0.1，1,5 μg/ml)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，并檢驗最佳LPS處理濃度；為了選擇蘆丁的最佳使用濃度，將PDLSCs細胞于含不同濃度蘆丁(0，0.01，0.1，1，5，10，50,100 μmol/L)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，并選擇最佳蘆丁濃度，然后執(zhí)行1.2.2至1.2.4部分的檢測實驗。根據(jù)以上結(jié)果獲得最佳濃度，并將實驗分組為：對照組、蘆丁組、LPS組和LPS+蘆丁組。對照組PDLSCs細胞采用純培養(yǎng)基培養(yǎng)，蘆丁組PDLSCs細胞培養(yǎng)基中加入10 μmol/L的蘆丁處理，LPS組PDLSCs細胞培養(yǎng)基中加入0.1 μg/ml的LPS處理，LPS+蘆丁組PDLSCs細胞培養(yǎng)基中加入10 μmol/L的蘆丁和0.1 μg/ml的LPS共同處理。然后對以上分組進行1.2.5至1.2.7部分的檢測實驗。

1.2.2 PDLSCs的形態(tài)學鑒定 將PDLSCs培養(yǎng)于10 cm的培養(yǎng)皿中，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。通過倒置熒光顯微鏡觀察PDLSCs的形態(tài)，通過油紅染色在倒置熒光顯微鏡下觀察脂質(zhì)液滴的形成。

1.2.3 PDLSCs的ALP活性測定和ALP染色 為了探究LPS對PDLSCs成骨分化的影響，將PDLSCs接種在6孔板或24孔板(5×104/孔)中，并在成骨培養(yǎng)基中分別補充LPS(0，0.1，1，5 μg/ml)。使用堿性磷酸酶(ALP)分析試劑盒檢測ALP活性。將細胞在成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，收集并洗滌細胞，使用細胞RIPA裂解液裂解細胞并通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定總蛋白濃度，加入50 μl分析緩沖液，然后在4 ℃下12 000 r/min離心3 min，然后加入50 μl的PNPP(5 mmol/L)反應液，于黑暗中60 ℃下反應60 min。最后，加入20 μl停止液，并在405 nm處測量吸光度。然后通過細胞總蛋白濃度計算ALP的活性。對于ALP染色，根據(jù)使用說明書，將細胞在成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，使用ALP染色試劑盒進行染色，并于倒置熒光顯微鏡中觀察。

1.2.4 茜素紅S染色檢測PDLSCs的礦化結(jié)節(jié)形成 為了探究LPS對PDLSCs成骨分化的影響，采用茜素紅S染色檢測PDLSCs的礦化結(jié)節(jié)形成。將PDLSCs培養(yǎng)于24孔板中，使用或不使用LPS和蘆丁處理后，4%多聚甲醛固定。然后，在室溫下用2%茜素紅S溶液(pH=4.2)對PDLSCs染色30 min。然后使用PBS清洗3次后，使用倒置熒光顯微鏡觀察，并使用Image J軟件定量染色強度。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平以及iNOS活性測定 為了探究LPS或蘆丁對PDLSCs中炎性細胞因子和氧化應激標記物活性的影響，將PDLSCs培養(yǎng)于12孔板中，分別使用LPS和蘆丁處理，待細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。使用ELISA試劑盒定量分析細胞炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平。于37 ℃使用2’-7’-二氯磷脂酰二乙酸酯(DCFH-DA,20 μmol/L)避光染色30 min后通過酶標儀檢測細胞上清液中ROS的含量。使用NO試劑盒根據(jù)使用說明書測定PDLSCs產(chǎn)生的NO。對于誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活性測定，使用細胞RIPA裂解液裂解細胞，離心收集細胞上清液；將上清液與iNOS試劑盒的反應緩沖液于37 ℃混合孵育30 min，使用酶標儀測量吸光度。

1.2.6 RT-qPCR測定ALP、OCN、RUNX2、BMP2、PPARγ和LPL的mRNA表達水平 根據(jù)使用說明書，采用Trizol試劑提取PDLSCs的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q RT Super Mix對RNA(1 μg)進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用LightCycler 480II PCR儀在以下PCR擴增條件下進行RT-qPCR反應：95 ℃預變性2 min，40個循環(huán)：95 ℃ 20 s，60℃ 20 s和72 ℃ 20 s，然后在72 ℃下再延伸5 min。mRNA水平通過GAPDH水平標準化，并使用2-ΔΔCt方法計算。PCR擴增所用引物見表1。

表1 qPCR實驗引物信息

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡分析PDLSCs中TLR4及NF-κB通路蛋白的表達水平 待PDLSCs在6孔板中融合度達到80%～90%，收集細胞，將PDLSCs用冷PBS洗滌，并在RIPA裂解緩沖液和1 mmol/L PMSF中裂解提取總蛋白，通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。使用相同量的蛋白質(zhì)濃度(30 μg)進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后，使用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜，并與一抗p-NF-κB p65(1 ∶500)、MyD88(1 ∶1 000)、TLR4(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。使用TBST緩沖液洗滌3次后，將PVDF膜與二抗IgG(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h。通過化學發(fā)光試劑盒和Bio-Rad凝膠成像儀檢測蛋白條帶，并通過ImageJ軟件分析蛋白表達水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

SPSS 21.0軟件和GraphPad Prism 5.0用于所有實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差表示，獨立樣本t檢驗用于兩組之間的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，多組之間的數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。當P<0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 牙周膜干細胞的形態(tài)學鑒定

本研究所分離培養(yǎng)的細胞形態(tài)與成纖維細胞的形態(tài)相似，以紡錘形并可以形成螺旋排列(見圖1A)。油紅染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)基出現(xiàn)礦化且有紅色堆積的結(jié)塊(見圖1B)，利用倒置熒光顯微鏡進行觀察發(fā)現(xiàn)這些紅色結(jié)塊為脂質(zhì)滴(見圖1C)，這說明成功分離到牙周膜干細胞(PDLSCs)。

2.2 不同濃度的LPS對PDLSCs成骨分化的影響

ALP和茜素紅S染色結(jié)果顯示，與0 μg/ml LPS相比，第14天在0.1，1，5 μg/ml的LPS濃度處理下，ALP的活性和鈣沉積物的形成水平均顯著降低(P<0.01，見圖2)；在0.1，1，5 μg/ml的LPS濃度處理下，ALP的活性和鈣沉積物的形成水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與0 μg/ml LPS相比，第14天在0.1 μg/ml LPS濃度處理下，成骨分化關(guān)鍵因子ALP、OCN、RUNX2和BMP2的mRNA水平顯著降低(P<0.01，見圖3)；在0.1，1，5 μg/ml的LPS濃度處理下，各因子mRNA水平無顯著性差異(P>0.05)。故本研究選擇0.1 μg/ml的LPS作為后續(xù)實驗的濃度。

A.直接觀察細胞形態(tài)；B.成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 d后顯微鏡下細胞形態(tài)；C.脂肪細胞誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)28 d倒置熒光顯微鏡下細胞形態(tài)圖1 牙周膜干細胞的形態(tài)學鑒定Figure 1 Morphological identification of periodontal ligament stem cells

與0 μg/ml LPS相比，**P<0.01圖2 不同濃度的LPS對PDLSCs成骨分化的影響 (n=5)Figure 2 Effect of different concentrations of LPS on the osteogenic differentiation of PDLSCs (n=5)

與0 μg/ml LPS相比，**P<0.01圖3 不同濃度LPS對PDLSCs成骨分化關(guān)鍵因子mRNA表達水平的影響 (n=5)Figure 3 Effects of different concentrations of LPS on the mRNA levels of key factors in osteogenic differentiation of PDLSCs (n=5)

2.3 不同蘆丁濃度減緩LPS對ALP活性的影響

ALP活性檢測結(jié)果顯示，與0 μmol/L蘆丁處理相比，當蘆丁濃度在0～10 μmol/L范圍內(nèi)，ALP的活性逐漸升高，在蘆丁濃度為10 μmol/L時ALP的活性最高；與10 μmol/L蘆丁處理相比，50 μmol/L和100 μmol/L蘆丁處理下ALP活性均顯著降低(P<0.05，見圖4)。故本研究選擇10 μmol/L蘆丁作為后續(xù)實驗濃度。

2.4 蘆丁對LPS刺激PDLSCs中炎性細胞因子和氧化應激的影響

炎性細胞因子檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組TNF-α、IL-6和IL-1β的表達水平顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+蘆丁組TNF-α、IL-6和IL-1β的表達水平顯著降低(P<0.01，見圖5)。氧化應激水平檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組ROS、NO和iNOS的表達水平顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+蘆丁組ROS、NO和iNOS的表達水平顯著降低(P<0.01，見圖5)。

與0 μmol/L蘆丁處理相比，*P<0.05；與10 μmol/L蘆丁處理相比，#P<0.05圖4 不同蘆丁濃度處理對PDLSCs成骨分化的損傷影響 (n=5)Figure 4 Effects of different concentrations of rutin on the osteogenic differentiation of PDLSCs (n=5)

與對照組相比，**P<0.01；與LPS組相比，##P<0.01圖5 蘆丁對LPS刺激的PDLSCs中炎性細胞因子和氧化應激的影響 (n=5)圖5 The effect of rutin on inflammatory cytokines and oxidative stress in PDLSCs stimulated by LPS (n=5)

2.5 蘆丁減輕LPS誘導PDLSCs的成脂作用

成脂基因關(guān)鍵因子檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組PDLSCs細胞中PPARγ和LPL的表達水平顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+蘆丁組PDLSCs細胞中PPARγ和LPL的表達水平顯著降低(P<0.01，見圖6)。

2.6 蘆丁抑制LPS誘導的PDLSCs中TLR4/NF-κB途徑中關(guān)鍵因子的表達

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，蘆丁組PDLSCs中p-NF-κB p65、MyD88和TLR4的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，LPS組PDLSCs中p-NF-κB p65、MyD88和TLR4的表達水平顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+蘆丁組PDLSCs中p-NF-κB p65、MyD88和TLR4的表達水平顯著降低(P<0.01，見圖7)。

與對照組相比，**P<0.01；與LPS組相比，##P<0.01圖6 蘆丁對LPS誘導PDLSCs成脂作用的影響 (n=5)Figure 6 The effect of rutin on LPS-induced adipogenesis of PDLSCs (n=5)

對照組相比，**P<0.01；與LPS組相比，##P<0.01圖7 蘆丁對LPS誘導PDLSCs TLR4/NF-κB表達的影響 (n=5)Figure 7 The effect of rutin on the expression of TLR4/NF-κB in PDLSCs induced by LPS (n=5)

3 討論

牙周炎主要是由局部因素引起牙周支持組織的慢性炎癥[16]。隨著炎癥的進一步發(fā)生，牙周膜被破壞，牙槽骨逐漸被吸收，最終牙周組織和骨組織被破壞[4]。文獻表明，PDLSCs在牙周組織中具有再生能力[17]。作為未分化的間充質(zhì)干細胞，PDLSCs具有多種分化潛能[18]。牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中細胞炎性因子TNF-α會發(fā)生顯著升高，而TNF-α是牙周炎的關(guān)鍵促炎因子[19]。TNF-α過量溢出會導致骨骼缺陷，并對骨骼發(fā)育產(chǎn)生不利影響[20]。蘆丁作為一種抗炎藥，可以通過局部作用于腸黏膜來改善炎性環(huán)境[21]。有研究結(jié)果顯示，蘆丁對模型大鼠的骨質(zhì)疏松癥具有一定的預防和治療作用[22]；蘆丁能夠顯著提高成骨細胞中堿性磷酸酶的活性，以及骨鈣素的分泌水平，進而促進成骨細胞的增殖和分化成熟[23]。同時，在炎癥微環(huán)境下，10 μmol/L的蘆丁能夠改善炎癥情況，上調(diào)ALP等成骨基因的表達水平，進而提高牙周膜干細胞的成骨分化能力[24]。本研究通過建立LPS誘導的PDLSCs作為牙周炎的體外模型，研究蘆丁對牙周炎治療作用的潛在機制，以為臨床應用提供理論支持。

牙周炎是一種免疫介導的炎性疾病，其發(fā)生和發(fā)展涉及革蘭氏陰性細菌的作用[25]。文獻表明，LPS會導致PDLSCs中TNF-α和IL-1β的濃度增加，并顯著抑制細胞增殖和遷移[26]。此外，LPS是細胞內(nèi)活性氧的有效誘導劑，并導致鼠巨噬細胞中NO和iNOS含量顯著增加[27]。本研究結(jié)果表明，LPS誘導PDLSCs中炎性細胞因子和氧化應激水平顯著升高，而蘆丁能有效抑制LPS引起的這些因子的過表達水平。這說明LPS誘導PDLSCs產(chǎn)生大量ROS，進而促進細胞內(nèi)氧化應激水平的升高，而蘆丁對牙周炎的治療作用有可能是通過抑制ROS水平降低機體氧化應激水平實現(xiàn)的。

ALP是成骨細胞分化的標志，在結(jié)締組織鈣化和礦物質(zhì)沉積中起關(guān)鍵作用[28]。研究表明，LPS可抑制成骨細胞中ALP的活性，以及抑制細胞代謝和活力[29]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，LPS顯著抑制了ALP的活性及鈣沉積物的形成，而蘆丁有效逆轉(zhuǎn)了LPS誘導的ALP活性降低。此外，通過蘆丁處理LPS誘導的PDLSCs可提高OCN、RUNX2和BMP2(成骨分化關(guān)鍵因子)的mRNA水平。趙斌等[24]的研究結(jié)果顯示，蘆丁能夠誘導COL1/RUNX2/ALP等成骨基因表達水平發(fā)生過不同程度的上調(diào)，該結(jié)果也表明蘆丁可增強成骨分化和成脂能力，而本研究中成骨分化關(guān)鍵因子的基因表達水平變化也與該結(jié)果一致。

Toll樣受體可識別微生物病原性分子，例如LPS、鞭毛蛋白和核酸[30]。PDLSCs可以表達多種TLR樣受體[31]；另外，TLR4被LPS識別，可刺激促炎細胞因子的產(chǎn)生和成骨分化[32]。文獻結(jié)果表明，TLR4募集促炎介質(zhì)受體相關(guān)激酶，通過與MyD88相互作用參與宿主對感染的炎癥反應，然后激活下游信號通路如MAPK和NF-κB的傳導途徑，NF-κB信號傳導在調(diào)節(jié)與炎癥相關(guān)的分子和細胞因子編碼的基因中起著至關(guān)重要的作用[33]。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導了TLR4/NF-κB信號通路(p-NF-κB p65,MyD88和TLR4)的激活，而蘆丁有效降低了LPS誘導的NF-κB-65的磷酸化和TLR4的表達水平。有研究顯示，LPS刺激誘導的TLR4/MyD88復合物的激活會觸發(fā)細胞因子級聯(lián)的釋放，包括IL-8和IL-1α等[15]；同時LPS刺激成骨細胞中Bax和Caspase-3的mRNA表達和蛋白水平上調(diào)，Bcl-2表達降低[34]。另外，LPS通過誘導TLR4信號通路激活，還可以降低細胞活力并促進細胞凋亡[35]。與上述結(jié)果一致，本研究中LPS對TLR4/NF-κB信號通路存在激活作用，但蘆丁可以有效抑制LPS的激活作用，從而抑制炎癥和促進細胞活力。

綜上所述，蘆丁通過PDLSCs中的TLR4/NF-κB途徑減輕LPS誘導的炎癥及減輕LPS誘導的成脂作用。因此，蘆丁對牙周炎具有潛在的治療作用，可能是牙周炎臨床治療的候選藥物。