利拉魯肽通過(guò)調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miR-31a-5p/E2F2改善2型糖尿病大鼠β細(xì)胞損傷和骨代謝

楊 彬，扈友莊，黃志文

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，湛江 524000；*通訊作者,E-mail:Huangzw1978@126.com)

糖尿病是一種全球范圍內(nèi)高發(fā)的代謝障礙疾病[1]，其中2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)占糖尿病病例的95%[1-3]。研究顯示，治療T2DM的一種胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽(liraglutide, LIR)，可改善糖尿病大鼠β細(xì)胞損傷和骨代謝失衡[4,5]。然而其內(nèi)在機(jī)制并不清楚。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyml stem cell, BMSC)來(lái)源的外泌體(Exosome, Exo)(BMSC-Exo)在治療和改善糖尿病和代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-8]。研究表明BMSC-Exo中miR-31a-5p/E2F2信號(hào)軸是骨代謝失衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號(hào)[9-12]。另外，LIR可改變切除卵巢的T2DM大鼠BMSC-Exo攜帶的miRNA[13]。然而，BMSC-Exo中miR-31a-5p/E2F2信號(hào)軸是否在LIR治療T2DM的過(guò)程中發(fā)揮作用并不清楚。因此，本研究探討LIR對(duì)T2DM大鼠體內(nèi)BMSC外泌體中miR-31a-5p/E2F2的影響，以及miR-31a-5p/E2F2參與治療或改善T2DM的β細(xì)胞損傷和骨代謝失衡的效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；超高速離心機(jī)(德國(guó)Herolab公司)；透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。LIR(諾和諾德(中國(guó))制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20110026)；鏈脲佐菌素STZ(美國(guó)Sigma)，DispaseⅡ酶(上海翊圣生物科技有限公司)；聚偏二氟乙烯膜(美國(guó)Millipore Corporation)；ALP活性測(cè)定試劑盒，兔抗CD9、CD63、RANK、E2F2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的第一抗體(英國(guó)Abcam公司)；SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物和Dounce勻漿器(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)。miRNA擬似物(miR-mimic)(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司)，qPCR引物(北京天根生物化學(xué)有限公司)。蛋白抽提試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)賽默飛公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、TUNEL試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.2 動(dòng)物和分組

50只6周齡SD雄性大鼠來(lái)源于廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證書編號(hào)：(粵)2002A013號(hào))。動(dòng)物飼養(yǎng)于23～25 ℃的光照/黑暗周期為12 h的環(huán)境中，每2只動(dòng)物飼養(yǎng)于1個(gè)籠子，活動(dòng)不受限制，且可以自由采食和飲水(生產(chǎn)許可證：SCXK(粵)2009-0039，飼養(yǎng)設(shè)施許可證號(hào)：SSXK(粵)2019-2029)。本研究中的所有動(dòng)物操作程序均經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：2020092號(hào))。

將50只大鼠數(shù)字隨機(jī)表法分為5組：LIR+miR-mimic+T2DM組、LIR+T2DM組、T2DM組、control組、LIR組，每組10只。LIR+miR-mimic+T2DM組給予高脂高糖飲食(20%蔗糖，15%黃油，10%的蛋黃粉，2%的膽固醇和73%的基礎(chǔ)食品)，高脂高糖飲食開始的同時(shí)，靜脈注射0.2 mg/kg的LIR，2次/d，并且同時(shí)靜脈注射2 μmol/L的miR-mimic，1次/7 d，LIR和miR-mimic注射均持續(xù)2個(gè)月，高糖飲食2個(gè)月后，向大鼠腹膜內(nèi)注射35 mg/kg的STZ 2次(間隔3 d)。LIR+T2DM組不注射miR-mimic，而T2DM組不注射miR-mimic和LIR，其余操作方法同LIR+miR-mimic+T2DM組。control組接受標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲食(脂肪3%，蛋白質(zhì)20%，碳水化合物55%)，不進(jìn)行任何藥物和誘導(dǎo)的干預(yù)。LIR組接受標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲食，其余操作同LIR+T2DM組。LIR+miR-mimic+T2DM組、LIR+T2DM組、T2DM組高脂高糖飲食開始后3 d檢測(cè)大鼠尾靜脈血糖，隨機(jī)血糖<16.7 mmol/L的大鼠剔除實(shí)驗(yàn)。以下所提到的實(shí)驗(yàn)方法均是按此分組進(jìn)行。

1.3 骨髓的分離

誘導(dǎo)和給藥結(jié)束后，將5組大鼠吸入2%異氟烷3 h進(jìn)行安樂(lè)死。經(jīng)過(guò)酒精徹底消毒全身后在雙側(cè)股骨下端皮膚開小口，充分暴露股骨及脛骨；用鑷子提起并剪下雙側(cè)股骨，在無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水中沖洗雙側(cè)股骨，去除附著的脂肪組織、結(jié)締組織和骨膜，進(jìn)行骨髓提取。解剖附骨后，用裝有2 ml無(wú)菌PBS溶液的注射器沖洗每個(gè)股骨的骨髓，反復(fù)打成均勻的懸浮液，然后將懸浮液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNase的離心EP管中，并保存在-80 ℃。

1.4 BMSC-外泌體的制備與鑒定

1.4.1 BMSC-外泌體的制備 取4 ml 1.3中5組的懸浮液于15 ml離心管中，于4 ℃下以2 000g離心5 min后，轉(zhuǎn)移上清至新的15 ml離心管。重復(fù)該步驟，依次以3 500g離心15 min、10 000g離心30 min、120 000g離心140 min。最后一次離心完成后，棄去上清，用4 ml無(wú)菌PBS將沉淀重新懸浮，用0.22 μmol/L無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，轉(zhuǎn)入5 ml離心管中，在4 ℃下以120 000g離心70 min。離心后棄去上清，離心管底部殘留的微量沉淀即為BMSC-外泌體。加入100 μl的無(wú)菌PBS懸浮液，放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 外泌體的鑒定 取10 μl外泌體懸液，滴入載樣銅網(wǎng)中，保留1.5 min，滴加2%醋酸雙氧乙鈾溶液染色1 min后，用濾紙吸干，再在室溫下晾1 min。將載樣銅網(wǎng)置于樣品室，使用透射電子顯微鏡觀察和拍照，并測(cè)量外泌體直徑。

1.4.3 外泌體表面標(biāo)記蛋白分析 分別取各組等體積的BMSC-外泌體，使用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)BMSC-外泌體的表面標(biāo)記蛋白CD9和CD63，取BMSC蛋白和BMSC-外泌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔加入的總蛋白量相同；將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，加入2%牛血清白蛋白于室溫下封閉2 h，然后加入兔抗鼠CD9、CD63一抗，于4 ℃孵育過(guò)夜，抗體使用比例分別為1 ∶800、1 ∶500；使用TBST溶液漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG二抗，抗體使用比例為1 ∶1 000，于室溫下孵育1 h，再次用TBST溶液漂洗，根據(jù)化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明進(jìn)行顯色。拍照后采用Image-J圖像處理軟件處理圖片。

1.5 分離胰腺β細(xì)胞

誘導(dǎo)和給藥結(jié)束后，將5組大鼠麻醉并在無(wú)菌條件下安樂(lè)死。用無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水沖洗胰腺，取3只新鮮胰島組織用于標(biāo)志物檢測(cè)。剩余組織用剪刀剪碎后加入以DispaseⅡ酶進(jìn)行消化，使用新鮮配制的無(wú)菌D-Hanks液清洗，用PBS液調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/100 μl，作為胰腺β細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備。

1.6 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β細(xì)胞的凋亡

用TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)β細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞統(tǒng)計(jì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核的數(shù)量和總細(xì)胞核數(shù)。每組3個(gè)載玻片中隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×200)來(lái)評(píng)估細(xì)胞凋亡率。

1.7 破骨細(xì)胞標(biāo)記物RANK的免疫組化檢測(cè)

將1.3中分離的骨髓組織制作石蠟塊。切片后取石蠟切片，加入抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。加入兔抗鼠的RANK一抗(抗體使用比例分別為1 ∶800)孵育20 min，用PBS洗滌3次，加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(抗體使用比例為1 ∶2 000)孵育2 h。根據(jù)DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行顯色。顯色后用蒸餾水沖洗，再使用蘇木精復(fù)染，于顯微鏡下觀察，拍照后采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件標(biāo)記并統(tǒng)計(jì)的陽(yáng)性表達(dá)RANK的細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性標(biāo)記為黃色、棕黃色、棕色。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-31a-5p和Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

用Trizol試劑提取分離5組β細(xì)胞和BMSC-Exo的總RNA。檢測(cè)260 nm的吸光度來(lái)定量RNA的濃度。提取的總RNA(0.84 μg)用PrimeScript RT試劑盒在PCR儀上反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)條件：16 ℃ 0.5 h，41 ℃ 0.5 h，85 ℃ 5 min，4 ℃循環(huán)。cDNA保存于4 ℃。qPCR反應(yīng)體系為20 μl，其中引物10 μl、SYBR Green酶反應(yīng)體系10 μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性，60 ℃退火2 min，45個(gè)循環(huán)，75 ℃下延伸1 min。胰島組織中的Bax和Bcl-2基因使用內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，外泌體中的miR-31a-5p使用內(nèi)參基因?yàn)閁6。計(jì)算Ct值，用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并且重復(fù)3次。引物見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.9 蛋白免疫印跡檢測(cè)E2F2和BMP-2蛋白表達(dá)

將5組大鼠的骨髓懸浮液進(jìn)行充分勻漿。樣品經(jīng)過(guò)與上樣緩沖液混合，在沸水浴中煮5 min，-20 ℃保存。用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與兔抗E2F2(1 ∶500)、BMP-2(1 ∶600)、GAPDH(1 ∶5 000)蛋白第一抗體在4 ℃孵育過(guò)夜，在25 ℃下與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1 ∶20 000)孵育2 h。使用SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物對(duì)膜上的蛋白進(jìn)行顯色，通過(guò)Geliance 200顯色系統(tǒng)進(jìn)行拍照。使用Image J軟件分析條帶灰度值。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 ALP活性檢測(cè)

根據(jù)ALP活性測(cè)定試劑盒提供的說(shuō)明檢查了1.3中分離的骨髓懸浮液中ALP的活性。將50 μl冷PBS與上清液混合并勻漿。隨后在4 ℃微量離心機(jī)中13 000g離心15 min，上清液用20 μl終止液終止樣品中的ALP活性，加入50 μl pNPP溶液(5 mmol/L)和10 μl ALP酶溶液，避光25 ℃孵育60 min。加入20 μl終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處吸光度。

1.11 雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)

通過(guò)PCR擴(kuò)增含有miR-31a-5p結(jié)合位點(diǎn)的E2F2 3′ UTR cDNA片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到熒光素酶基因終止密碼子下游的PGL3載體中。E2F2的突變體(MUT)使用TaKaRa MutanBEST試劑盒(日本TaKaRa)構(gòu)建。對(duì)于在BMSC細(xì)胞中進(jìn)行的熒光素酶測(cè)定，使用Lipofectamine 2000將24孔板中的細(xì)胞與200 ng/孔熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體、400 ng/孔miR-mimic或其陰性對(duì)照(negative control, NC)共轉(zhuǎn)染。5 ng/孔的海腎熒光素酶質(zhì)粒作為內(nèi)部對(duì)照。在轉(zhuǎn)染后24 h收獲細(xì)胞，根據(jù)制造商的說(shuō)明用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(上海碧云天)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMSC-Exo的鑒定結(jié)果

BMSC-Exo的粒徑分布是91～113 nm。CD9和CD63在BMSC-Exo表面均有表達(dá)；BMSC-Exo的結(jié)構(gòu)是圓盤形囊泡狀膜結(jié)構(gòu)(見圖1)。

2.2 T2DM大鼠的β細(xì)胞凋亡變化

與control組比，T2DM組大鼠體內(nèi)β細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；大鼠胰島組織中Bax mRNA表達(dá)量增加，而Bcl-2 mRNA表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而與control組比，LIR組的上述指標(biāo)的變化均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與T2DM組比，LIR+T2DM組大鼠β細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)，且胰島組織中Bax mRNA表達(dá)量減少，而Bcl-2 mRNA增加(P<0.01)。與LIR+T2DM組比，與LIR+miR-mimic+T2DM組大鼠β細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，Bax mRNA表達(dá)量增加，而Bcl-2 mRNA減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖2和表2)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的鑒定Figure 1 Verification of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes

2.3 T2DM大鼠的骨代謝變化

與control組比較，LIR組的破骨細(xì)胞數(shù)目(RANK標(biāo)記)、成骨細(xì)胞標(biāo)記物ALP活性、BMP-2的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。T2DM組造模后大鼠骨髓中破骨細(xì)胞數(shù)目(RANK標(biāo)記)增加，而成骨細(xì)胞標(biāo)記物ALP活性和BMP-2的表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與T2DM組比，LIR+T2DM組骨髓中破骨細(xì)胞數(shù)(RANK標(biāo)記)減少，而成骨細(xì)胞標(biāo)記物ALP活性和BMP-2的表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與LIR+T2DM組比，與LIR+miR-mimic+T2DM組大鼠骨髓中破骨細(xì)胞數(shù)(RANK標(biāo)記)增加，而成骨細(xì)胞標(biāo)記物ALP活性和BMP-2的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖3、圖4和表3)。

綠色熒光為TUNEL染色的凋亡細(xì)胞，藍(lán)色熒光為DAPI染色的細(xì)胞核圖2 大鼠胰腺β細(xì)胞TUNEL染色 (×200)Figure 2 TUNEL staining of β cells in pancreas of rats (×200)

表2 T2DM大鼠細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)mRNA的表達(dá)變化

RANK染色以標(biāo)記破骨細(xì)胞，其中黃色、黃棕色、黃褐色均為破骨細(xì)胞陽(yáng)性，藍(lán)色為破骨細(xì)胞陰性圖3 破骨細(xì)胞標(biāo)志物RANK的免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果 (×200)Figure 3 Immunohistochemical staining results of osteoclast marker RANK (×200)

圖4 利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠成骨細(xì)胞標(biāo)志物BMP-2表達(dá)的影響Figure 4 Effect of LIR on the expression of osteoblast marker BMP-2 in type 2 diabetic rats

2.4 T2DM大鼠miR-31a-5p的表達(dá)

與control組比，T2DM組造模后外泌體中miR-31a-5p上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與T2DM組比，LIR+T2DM組外泌體中miR-31a-5p下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與LIR+T2DM組比，與LIR+miR-mimic+T2DM組外泌體中miR-31a-5p上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。另外，LIR組與control組比，miR-31a-5p的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.479，見圖5)。

表3 T2DM大鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)、ALP活性以及BMP-2的表達(dá)變化

與control比較，*P<0.05；與T2DM比較，#P<0.05；與LIR+T2DM比較，&P<0.05圖5 miR-31a-5p在外泌體中的相對(duì)表達(dá)水平Figure 5 The relative expression levels of miR-31a-5p in exosomes

2.5 E2F2是miR-31a-5p的靶基因

生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-31a-5p的靶基因是否為E2F2。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與control組比，T2DM組造模后外泌體中E2F2下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與T2DM組比，LIR+T2DM組外泌體中E2F2上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與LIR+T2DM組比，LIR+miR-mimic+T2DM組外泌體中E2F2下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。另外，LIR組與control組間比較，E2F2的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖6)。

為確定miR-31a-5p是否直接與E2F2的3'UTR結(jié)合并引起翻譯抑制，我們?cè)?93T細(xì)胞中采用了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，miR-31a-5p直接與E2F2的3'UTR結(jié)合(見圖7A)。而且，與E2F2突變組相比，E2F2野生組的報(bào)告基因在mimic處理后熒光素酶活性顯著降低(P=0.003)，但與E2F2突變組相比，E2F2野生組的報(bào)告基因在NC處理后熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.732，見圖7B)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠的BMSC來(lái)源外泌體中miR-31a-5p表達(dá)明顯上調(diào)，而E2F2的蛋白水平明顯下調(diào)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)LIR治療T2DM組中miR-31a-5p的水平被抑制，而E2F2被上調(diào)。但是，單獨(dú)使用LIR注射健康大鼠，并未觀察到miR-31a-5p和E2F2的表達(dá)改變。我們?cè)谶M(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，在BMSC中E2F2是miR-31a-5p的靶基因。使用miR-31a-5p的擬似物miR-mimic上調(diào)miR-31a-5p，觀察到LIR對(duì)T2DM大鼠β細(xì)胞和骨代謝的改善作用被減弱，同時(shí)E2F2的表達(dá)明顯下調(diào)。本研究表明，LIR通過(guò)調(diào)節(jié)T2DM體內(nèi)BMSC來(lái)源外泌體的miR-31a-5p/E2F2從而改善T2DM大鼠β細(xì)胞損傷和骨代謝失衡。本研究為利拉魯肽治療T2DM的機(jī)制研究及BMSC-Exo在T2DM的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究為T2DM的預(yù)防和治療提供新的思路。

與control比較，*P<0.05；與T2DM比較，#P<0.05；與LIR+T2DM比較，&P<0.05圖6 利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠E2F2表達(dá)的影響Figure 6 Effect of LIR on the expression of E2F2 in type 2 diabetic rats

圖7 miR-31a-5p靶向E2F2基因Figure 7 miR-31a-5p targets E2F2 gene

從目前的已發(fā)表的證據(jù)可知，LIR治療對(duì)T2DM大鼠的β細(xì)胞損傷和骨代謝失衡均有明顯的改善作用[4,14]。Li等[13]在觀察了T2DM大鼠的骨髓外泌體的miRNA譜后發(fā)現(xiàn)，LIR治療可導(dǎo)致miRNA譜發(fā)生明顯改變。經(jīng)生物信息學(xué)分析，這種miRNA的改變可直接靶向胰島素分泌和胰島素信號(hào)通路[13]。表明LIR可能通過(guò)改變骨髓外泌體miRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的功能。另外，證據(jù)顯示，在衰老且骨代謝失衡的骨髓組織中BMSC來(lái)源外泌體中攜帶的miR-31a-5p表達(dá)增加，而且miR-31a-5p通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞衰老形成并損害BMSC的功能導(dǎo)致成骨細(xì)胞的減少并進(jìn)一步抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F2[12]。本研究在T2DM模型中觀察到了類似的結(jié)果，T2DM大鼠造模后14 d和21 d的BMSC外泌體中miR-31a-5p的表達(dá)均增加，而外泌體中的E2F2的蛋白水平明顯下調(diào)。結(jié)合上面miRNA表達(dá)譜的證據(jù)，我們假設(shè)LIR可以改變T2DM中的miR-31a-5p的表達(dá)和E2F2的蛋白水平。本研究的結(jié)果與假設(shè)的一致，T2DM大鼠在給予LIR后，我們觀察到BMSC外泌體中miR-31a-5p的表達(dá)均明顯下調(diào)以及E2F2明顯上調(diào)。以上研究表明，LIR可以抑制T2DM大鼠BMSC外泌體中的miR-31a-5p并上調(diào)E2F2。

另外，本研究得到一個(gè)關(guān)鍵的證據(jù)，LIR通過(guò)調(diào)節(jié)BMSC外泌體中的miR-31a-5p/E2F2信號(hào)軸改善了T2DM大鼠β細(xì)胞損傷和骨代謝失衡。外泌體參與微環(huán)境內(nèi)遺傳信息的交換。特別是，miRNA在外泌體介導(dǎo)的信息運(yùn)輸中起著至關(guān)重要的作用[15]。這些發(fā)現(xiàn)有助于理解LIR的骨保護(hù)機(jī)制和β細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制[15]。研究發(fā)現(xiàn)，E2F2轉(zhuǎn)錄因子缺陷的小鼠可發(fā)展出非自身免疫性，胰島素依賴型糖尿病。而且，野生型骨髓的移植可以預(yù)防或挽救E2f2-/-小鼠的糖尿病[16]。在本研究中LIR明顯恢復(fù)了T2DM大鼠BMSC中外泌體E2F2的表達(dá)。而且我們的研究表明LIR很可能通過(guò)抑制miR-31a-5p從而促進(jìn)E2F2蛋白水平的增高，其原因是我們通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法證實(shí)E2F2在BMSC中是miR-31a-5p的靶基因。

在過(guò)去的10多年中，miRNA通過(guò)影響mRNA的翻譯和穩(wěn)定性迅速成為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑[17]。本研究證實(shí)了E2F2是miR-31a-5p在BMSC中的靶基因。而且miRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因誘導(dǎo)多種細(xì)胞過(guò)程的變化，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞衰老[18,19]。但是，它們?cè)诩?xì)胞外環(huán)境中的不穩(wěn)定性限制了它們的應(yīng)用。外泌體是一種具有磷脂雙分子層膜的囊泡，可保護(hù)miRNA免受降解，并在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移它們，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通訊。本研究表明，T2DM大鼠BMSC外泌體的miR-31a-5p被明顯上調(diào)。已有報(bào)道顯示外泌體中的miR-31a-5p與骨髓微環(huán)境中的骨生成和骨吸收有密切關(guān)系，其中抑制BMSC外泌體中的miR-31a-5p可以減少破骨細(xì)胞的生成，增加成骨細(xì)胞的生成，這種雙重調(diào)節(jié)表明，miR-31a-5p在骨骼形成和骨骼吸收中均起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[12]。本研究觀察到T2DM大鼠給予LIR后，BMSC外泌體中的miR-31a-5p的水平明顯下降，并伴隨破骨細(xì)胞數(shù)目減少以及β細(xì)胞的凋亡率下降，而使用miR-mimic恢復(fù)miR-31a-5p的表達(dá)后，骨髓中破骨細(xì)胞數(shù)目和β細(xì)胞的凋亡率均增加。這些結(jié)果表明LIR可通過(guò)抑制BMSC外泌體的miR-31a-5p水平改善β細(xì)胞損傷和骨代謝失衡。

本研究仍存在一定局限性，首先，樣本量不足，仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大動(dòng)物的樣本量和種類進(jìn)行驗(yàn)證，并且在多種β細(xì)胞中反復(fù)觀察，以確定本研究結(jié)果的普遍適用性。其次，缺乏LIR治療糖尿病并涉及外泌體機(jī)制研究的文獻(xiàn)報(bào)道，以此為契機(jī)，本研究為外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)機(jī)制參與調(diào)控糖尿病治療等研究提供了新的研究基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中，本課題組將加大樣本量，并利用不同的糖尿病動(dòng)物模型更進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)LIR治療糖尿病后BMSC的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)機(jī)制進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明LIR通過(guò)調(diào)控T2DM大鼠BMSC中外泌體miR-31a-5p/E2F2信號(hào)軸從而對(duì)T2DM大鼠的β細(xì)胞損傷和骨代謝失衡具有調(diào)控作用。本研究為L(zhǎng)IR臨床治療T2DM提供了潛在的治療機(jī)制，為L(zhǎng)IR的治療效果評(píng)估和機(jī)制探究提供了研究基礎(chǔ)。