育亨賓對腎移植中腎間質(zhì)纖維化的抑制作用及其機(jī)制

張瑞琴，吳東娟，韓士超，李 轉(zhuǎn)，陳利娟，賀海玲

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科，西安 710032；*通訊作者,E-mail:759421091@qq.com)

腎移植(renal transplantation，RT)是治療終末期腎病最有效的治療方法[1]。在腎移植中，腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是導(dǎo)致移植腎功能喪失的重要因素[2]。在IRI中，腎組織中產(chǎn)生的炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和活性氧可進(jìn)一步促進(jìn)黏附分子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)激活的中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞聚集在損傷部位，進(jìn)一步加重?fù)p傷。此外，IRI可誘導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)激活，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重腎臟IRI[3]。EMT的特征是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并伴隨上皮標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的下調(diào)，以及間質(zhì)標(biāo)志物如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的上調(diào)[4]。EMT受各種生物介質(zhì)調(diào)節(jié)，如TNF-α、TGF-β、Ang Ⅱ等，從而促進(jìn)纖維化進(jìn)程[5,6]。育亨賓(Yohimbine，Yoh)是一種α2受體拮抗劑，已被報(bào)道通過抑制NF-κB通路改善顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥[7]。另外，育亨賓對大鼠缺血再灌注、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷具有抑制作用[8-10]。然而，尚不清楚育亨賓對移植腎纖維化的影響。因此，本研究通過使用0.1 mg/kg和0.5 mg/kg育亨賓治療腎移植大鼠16周，探討了育亨賓對大鼠腎移植后纖維化的抑制作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 育亨賓購自美國Sigma-Aldrich公司；大鼠TNF-α ELISA試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司；大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒購自博輝生物科技(廣州)有限公司；環(huán)孢菌素A購自華北制藥股份有限公司；青霉素購自瑞陽制藥有限公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、RIPA緩沖液、BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ECL試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性F344大鼠和Lewis大鼠(200～250 g)購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號：SCXK(陜)2020-001]。所有大鼠均飼養(yǎng)在恒溫(24 ℃)、恒濕(55%)、12 h光/暗周期環(huán)境中，對大鼠提供自來水和標(biāo)準(zhǔn)飼料，不限制飲食。

1.2 方法

1.2.1 腎移植 參考文獻(xiàn)[11]方法，在F344大鼠(供體)和Lewis大鼠(受體)之間進(jìn)行原位左腎移植。移植術(shù)后10 d切除受體右腎。從受體腎移植術(shù)當(dāng)天開始，每天1次腹腔注射環(huán)孢菌素A(5 mg/kg)，持續(xù)14 d；腹腔注射青霉素20萬U/d，持續(xù)3 d。

1.2.2 動(dòng)物分組和治療 將48只Lewis大鼠隨機(jī)分為4組：對照組、腎移植組、0.1 mg/kg育亨賓治療組(低劑量組)和0.5 mg/kg育亨賓治療組(高劑量組)，每組12只。對照組大鼠行右腎切除。其他組大鼠為腎移植大鼠。從腎移植后的第1天起，每周2次向低劑量組和高劑量組大鼠腹腔分別注射0.1 mg/kg和0.5 mg/kg的育亨賓(2 ml)，對照組和腎移植組大鼠腹腔注射2 ml的0.9%生理鹽水。共治療16周。

1.2.3 組織學(xué)染色檢測腎組織形態(tài)和纖維化 治療結(jié)束后，分離左腎，石蠟包埋制作4 μm厚的切片，然后按照說明書通過蘇木精-伊紅(HE)染色來觀察腎組織形態(tài)，通過Masson三色染色觀察腎纖維化情況。纖維化面積計(jì)算方法如下：隨機(jī)選取5個(gè)視野，在放大200倍下記錄纖維化面積，并以纖維化面積占整個(gè)面積的百分比表示。

1.2.4 腎功能評估 使用直徑1.0 mm的玻璃毛細(xì)管從大鼠眼眶后靜脈叢采血，離心分離血清。按照試劑盒的說明通過肌氨酸氧化酶法檢測Scr，通過二乙酰肟比色法檢測BUN。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清炎癥因子水平 根據(jù)ELISA試劑盒說明，使用大鼠TNF-α和TGF-β1 ELISA試劑盒檢測大鼠血清TNF-α和TGF-β1的水平。

1.2.6 免疫組化檢測α-SMA、E-cadherin和Smurf1蛋白表達(dá)情況 腎組織石蠟切片用二甲苯脫蠟，復(fù)水。在檸檬酸緩沖液(10 mmol/L，pH 6.0)中加熱至98 ℃，并維持10 min。切片在室溫下用3%H2O2甲醇浸泡20 min。在10%脫脂牛奶封閉1 h后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH 7.4)洗滌3次，隨后在4 ℃下將切片與一抗孵育過夜。一抗為兔抗α-SMA(1 ∶300稀釋)、E-cadherin(1 ∶500稀釋)、Smurf1(1 ∶500稀釋)單克隆抗體。然后，切片與生物素化山羊抗小鼠/兔IgG二抗(1 ∶500稀釋)在37 ℃孵育1 h，之后行3，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染。用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡拍攝切片，放大倍數(shù)為200倍，用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析。染色強(qiáng)度計(jì)算為積分光密度。

1.2.7 Western blotting檢測腎組織中蛋白表達(dá)水平 使用RIPA緩沖液裂解腎組織，然后使用BCA試劑盒檢測蛋白含量。蛋白質(zhì)提取液(50 μg/泳道)通過8%～12% SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在室溫下用5%的脫脂牛奶封閉1 h，然后在4 ℃與一抗孵育過夜。一抗如下：α-SMA(1 ∶3 000稀釋)、E-cadherin(1 ∶5 000稀釋)、Smurf1(1 ∶5 000稀釋)、Akt(1 ∶2 000稀釋)、p-Akt(1 ∶2 000稀釋)、mTOR(1 ∶5 000稀釋)、p-mTOR(1 ∶5 000稀釋)、P70S6K(1 ∶3 000稀釋)、p-P70S6K(1 ∶3 000稀釋)和GAPDH(1 ∶5 000稀釋)。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。用TBS-T洗滌3次后，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗鼠免疫球蛋白二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育1 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 育亨賓對腎移植大鼠腎組織形態(tài)和纖維化的影響

本研究中，12只對照組大鼠行右腎切除。36只大鼠進(jìn)行腎移植。腎移植16周后，共有13只大鼠死亡，總存活率為72.92%。對照組、腎移植組、低劑量組和高劑量組大鼠依次存活10，7，9，9只，存活率依次為83.33%，58.33%，75.00%和75.00%。HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常；腎移植組大鼠腎小管擴(kuò)張、上皮萎縮、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、間質(zhì)間隙明顯擴(kuò)張，膠原沉積明顯；低劑量組和高劑量組大鼠腎組織形態(tài)較腎移植組好轉(zhuǎn)，高劑量組大鼠腎組織形態(tài)基本恢復(fù)正常(見圖1)。Masson三色染色中，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，藍(lán)色染色區(qū)域代表纖維化區(qū)域(見圖1)。定量分析顯示，與對照組比較，腎移植組大鼠腎組織纖維化面積明顯增加(P<0.05)；與腎移植組比較，低劑量組和高劑量組大鼠的腎組織纖維化面積明顯減小(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠的腎組織纖維化面積明顯減小(P<0.05，見圖1)。

2.2 育亨賓對腎移植大鼠血清炎癥因子的影響

與對照組比較，腎移植組大鼠血清中TNF-α和TGF-β1水平升高(P<0.05)；與腎移植組比較，低劑量組和高劑量組大鼠血清中TNF-α和TGF-β1水平降低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠血清中TNF-α和TGF-β1水平降低(P<0.05，見表1)。

2.3 育亨賓對腎移植大鼠腎功能的影響

與對照組比較，腎移植組大鼠Scr和BUN水平升高(P<0.05)；與腎移植組比較，低劑量組和高劑量組大鼠Scr和BUN水平降低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠Scr和BUN水平降低(P<0.05，見表2)。

表1 ELISA法檢測大鼠治療16周后的血清TNF-α和TGF-β1水平 (pg/ml)

2.4 育亨賓對腎移植大鼠腎組織EMT的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組比較，腎移植組大鼠腎組織中α-SMA的相對積分光密度升高，E-cadherin的相對積分光密度降低(P<0.05)；與腎移植組比較，低劑量組和高劑量組大鼠腎組織中α-SMA的相對積分光密度均降低，E-cadherin的相對積分光密度均升高(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠腎組織中α-SMA的相對積分光密度降低，E-cadherin的相對積分光密度升高(P<0.05，見圖2)。

表2 各組大鼠治療16周后的Scr和BUN水平

與對照組比較，*P<0.05；與腎移植組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，&P<0.05圖2 治療16周后大鼠腎組織α-SMA和E-cadherin的免疫組化染色 (×200)Figure 2 Immunohistochemical staining of α-SMA and E-cadherin in renal tissue of rats in each group after 16 week treatment (×200)

Western blotting結(jié)果顯示，與對照組比較，腎移植組大鼠腎組織中α-SMA的蛋白相對表達(dá)量升高，E-cadherin降低(P<0.05)；與腎移植組比較，低劑量組和高劑量組大鼠腎組織中α-SMA的蛋白相對表達(dá)量均降低，E-cadherin的蛋白相對表達(dá)量均升高(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠腎組織中α-SMA的蛋白相對表達(dá)量降低，E-cadherin的蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05，見圖3)。

2.5 育亨賓對腎移植大鼠腎組織Smurf1表達(dá)的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組比較，腎移植組大鼠腎組織中Smurf1的相對積分光密度升高(P<0.05)；與腎移植組比較，低劑量組和高劑量組大鼠腎組織中Smurf1的相對積分光密度均降低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠腎組織中Smurf1的相對積分光密度降低(P<0.05，見圖4)。Western blotting結(jié)果顯示，與對照組比較，腎移植組大鼠腎組織中Smurf1的蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)；與腎移植組比較，低劑量組和高劑量組大鼠腎組織中Smurf1的蛋白相對表達(dá)量均降低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠腎組織中Smurf1的蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05，見圖4)。

2.6 育亨賓對腎移植大鼠腎組織Akt-mTOR-P70S6K信號通路的影響

Western blotting結(jié)果表明，與對照組比較，腎移植組大鼠腎組織中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-P70S6K/P70S6K的蛋白相對表達(dá)量均升高(P<0.05)；與腎移植組比較，低劑量組和高劑量組大鼠腎組織中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-P70S6K/P70S6K的蛋白相對表達(dá)量均降低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠腎組織中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-P70S6K/P70S6K的蛋白相對表達(dá)量均降低(P<0.05，見圖5)。

與對照組比較，*P<0.05；與腎移植組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，&P<0.05圖3 Western blotting檢測大鼠治療16周后的腎組織α-SMA和E-cadherin的蛋白表達(dá)Figure 3 Protein expression of α-SMA and E-cadherin in renal tissue in rats after 16 week treatment detected by Western blotting

與對照組比較，*P<0.05；與腎移植組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，&P<0.05圖4 免疫組化染色和Western blotting檢測大鼠治療16周后的腎組織Smurf1的表達(dá) (×200)Figure 4 Expression of Smurf1 in kidney tissue of rats after 16 week treatment detected by immunohistochemical staining and Western blotting (×200)

3 討論

目前，臨床中用于改善腎移植后排斥反應(yīng)的藥物相對較少，急需要開發(fā)新的藥物。有文獻(xiàn)報(bào)道了育亨賓對腎損傷的抑制作用。例如，Shimokawa等[10]研究顯示，在LPS誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷模型中，育亨賓可阻斷NF-κB的核定位，抑制炎性細(xì)胞因子和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的磷酸化，從而預(yù)防LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷。Tsutsui等[9]報(bào)道，育亨賓抑制了順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠升高的腎血漿去甲腎上腺素、腎組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和cleaved Caspase-3的表達(dá)，從而改善了腎功能并抑制了細(xì)胞凋亡?；谏鲜鑫墨I(xiàn)報(bào)道，我們推測育亨賓可能是一種提高腎移植成功率的潛在藥物。因此，本研究探索了育亨賓對腎移植大鼠腎功能和纖維化的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)過16周的治療后，育亨賓以劑量依賴性方式改善了移植腎形態(tài)并減輕了腎纖維化，并且降低了腎移植大鼠Scr和BUN水平，這些結(jié)果說明育亨賓可有效減輕腎移植后的腎損傷。由于腎移植過程中不可避免地會(huì)發(fā)生腎IRI，這也是導(dǎo)致移植腎功能喪失的重要因素之一。腎IRI誘導(dǎo)腎組織中產(chǎn)生TNF-α、TGF-β等炎癥因子是其損傷腎功能的主要途徑[3]。為了進(jìn)一步研究育亨賓對移植腎的保護(hù)作用，本研究考察了育亨賓對血清炎癥因子的影響。結(jié)果顯示，在腎移植大鼠中，育亨賓治療明顯降低了血清TNF-α和TGF-β1水平。Shimokawa等[8]研究發(fā)現(xiàn)，育亨賓抑制了大鼠急性缺血再灌注后腎靜脈去甲腎上腺素水平、TNF-α和MCP-1 mRNA水平，表明育亨賓通過抑制α2C-腎上腺素受體和抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來預(yù)防缺血再灌注所致的腎損傷。因此，本研究推測，育亨賓減輕腎移植中IRI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能也是其腎保護(hù)作用的一種機(jī)制。

與對照組比較，*P<0.05；與腎移植組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，&P<0.05圖5 Western blotting檢測大鼠治療16周后腎組織Akt、mTOR、和P70S6K的磷酸化水平Figure 5 The phosphorylation levels of Akt, mTOR and P70S6K in kidney tissue of rats after 16 week treatment detected by Western blotting

Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smurf1)是一種E3泛素連接酶，已被證實(shí)參與多種生物學(xué)過程，包括胚胎發(fā)生、腫瘤生長、骨形成和肝臟脂肪變性[12-14]。據(jù)報(bào)道，Smurf1參與調(diào)節(jié)糖尿病腎纖維化和移植腎纖維化[2,15]，Smurf1-Smad7信號調(diào)節(jié)腎上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[16]，抑制Smurf1可減輕糖尿病小鼠的腎纖維化[15]。本研究表明，育亨賓抑制了腎移植大鼠腎組織中Smurf1的表達(dá)，這可能也是育亨賓抑制腎纖維化的機(jī)制之一。

EMT在CAD的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。對單側(cè)輸尿管梗阻和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠模型的研究表明，抑制EMT可通過阻斷TGF-β/Smad通路減輕腎臟纖維化[17,18]。因此，靶向EMT為預(yù)防腎纖維化和改善腎移植受者的預(yù)后提供了新的途徑。本研究探索了育亨賓對腎移植大鼠腎組織EMT的影響，結(jié)果表明育亨賓治療抑制了腎組織中α-SMA的表達(dá)，而促進(jìn)了E-cadherin的表達(dá)，從而抑制了EMT。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步考察了調(diào)控EMT的重要信號通路，即Akt-mTOR-P70S6K信號通路。其他文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1通過Akt信號通路促進(jìn)EMT和同種異體移植物間質(zhì)纖維化[19]。肝細(xì)胞生長因子可通過Akt-mTOR-P70S6K信號通路明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞EMT[20]。硼替佐米通過抑制NF-κB/TNF-α/Akt/mTOR/P70S6K/Smurf2通路來抑制移植腎間質(zhì)纖維化[21]。本研究也發(fā)現(xiàn)育亨賓抑制了Akt-mTOR-P70S6K信號通路。此外，還有文獻(xiàn)指出，TGF-β1、Smurf1與Akt-mTOR-P70S6K信號通路存在相互作用，共同調(diào)節(jié)腎纖維化[2]。這些結(jié)果充分說明育亨賓對腎移植大鼠腎纖維化的抑制作用與Akt-mTOR-P70S6K信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究首次揭示育亨賓可改善腎移植大鼠的腎形態(tài)和功能，并減輕腎纖維化，育亨賓對移植腎的保護(hù)作用可能通過Smurf1和Akt-mTOR-P70S6K信號通路來介導(dǎo)。在未來，育亨賓有望成為提高腎移植成功率的新型藥物。