轉(zhuǎn)分化腎小管上皮細(xì)胞對(duì)DJ-1蛋白分泌及甲狀旁腺細(xì)胞增殖的影響*

位紅蘭，董駿武

(武漢市第四醫(yī)院腎病內(nèi)科，湖北 武漢 430030)

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為甲狀旁腺細(xì)胞增殖、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)分泌增加[1]。因其與鈣磷代謝紊亂、血管鈣化、心腦血管事件[2]、死亡等密切相關(guān)，近年已經(jīng)受到高度重視，并成為研究熱點(diǎn)，但其具體的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍有待深入研究。

慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)早期FGF23與甲狀旁腺細(xì)胞上的FGFR1結(jié)合，抑制甲狀旁腺細(xì)胞增生及PTH分泌[3-6]。但FGF23對(duì)已經(jīng)增生的甲狀旁腺不起作用，且透析患者中血清FGF23與PTH正相關(guān)[7-8]。這一矛盾現(xiàn)象提示在CKD進(jìn)展中可能存在某種競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制作用于FGFR1，影響甲狀旁腺增生及PTH分泌。

DJ-1是一種新近發(fā)現(xiàn)的多功能蛋白[9]，具有參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抗氧化反應(yīng)、分子伴侶及抑制凋亡等多種生物學(xué)功能[10-11]。目前研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1具有“細(xì)胞內(nèi)”和“細(xì)胞外”兩種存在形式[12]。成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外DJ-1蛋白可以作為配體與FGFR1結(jié)合[13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中DJ-1蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯升高[14]，但細(xì)胞外DJ-1蛋白分泌是否增加尚未進(jìn)一步研究，且細(xì)胞外DJ-1蛋白是否能作用于甲狀旁腺細(xì)胞的FGFR1尚無(wú)報(bào)道。

本研究旨在探究轉(zhuǎn)分化腎小管上皮細(xì)胞是否分泌細(xì)胞外DJ-1蛋白，并作為配體與FGFR1結(jié)合，刺激甲狀旁腺細(xì)胞增生、PTH分泌。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)、人甲狀旁腺細(xì)胞(武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(北京Solarbio公司)；兔抗人α-SMA蛋白抗體、鼠抗人DJ-1蛋白抗體、鼠抗人p-FGFR1抗體、兔抗人p-ERK1/2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；FGFR1抑制劑SU5402(北京百奧萊博科技有限公司)；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒CCK8(Abcam中國(guó))；免疫共沉淀試劑盒(美國(guó)貝克曼);人PTH試劑盒(西門(mén)子公司)。純化野生型分泌蛋白DJ-1及突變體由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科劉順?lè)冀淌谫?zèng)送。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

(1)HK-2細(xì)胞：含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)箱(95%濕度，5%CO2)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分正常培養(yǎng)組、10μg/L TGF-β1培養(yǎng)組(HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化組)。

(2)甲狀旁腺細(xì)胞：含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)箱(95%濕度，5%CO2)培養(yǎng)，甲狀旁腺細(xì)胞分為常規(guī)培養(yǎng)組(A組)、加入HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化上清培養(yǎng)組(B組)、加入轉(zhuǎn)分化HK-2細(xì)胞上清+SU5402培養(yǎng)組(C組)；加入純化野生型分泌蛋白DJ-1 5ng/mL(D組)、10ng/mL(E組)、15ng/mL(F組)；同時(shí)加入相同濃度的SU5402組(G、H、I組)、DJ-1突變體組(J、K、L組)。

1.2.2 ELISA檢測(cè)分泌型DJ-1蛋白

兩組HK-2細(xì)胞分別接種至6孔板，每組30樣，培養(yǎng)0、1、3d，分別收集培養(yǎng)液上清，ELISA試劑盒檢測(cè)分泌型DJ-1蛋白。

1.2.3 免疫共沉淀檢測(cè)分泌型DJ-1蛋白與FGFR1相互作用

A、B組甲狀旁腺細(xì)胞培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞。加入裂解液提取并稀釋蛋白,制成1g/L的溶液,取500μL加入抗體1μL,4℃緩慢搖晃、孵育過(guò)夜。次日加入50μL瓊脂糖珠,4℃緩慢搖晃、孵育4h,使抗體與瓊脂糖珠偶聯(lián);4℃、3 000r/min離心3min,棄上清。用250μL裂解緩沖液清洗瓊脂糖珠3次;加入4μL的5×上樣緩沖液和16μL的1×磷酸鹽緩沖液,煮沸5min待用。Western blot檢測(cè)DJ-1、P-FGFR1、FGFR1。

1.2.4 Western blot檢測(cè)P-ERK1/2表達(dá)

A、B、C 3組甲狀旁腺細(xì)胞培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞。加入預(yù)冷的蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂奶粉中封閉2h后加一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日在室溫下加入二抗孵育2h，采用ECL發(fā)光液曝光。

1.2.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

甲狀旁腺細(xì)胞接種于96孔板，每組32孔，48h后CCK8溶液按1∶10加入每孔染色，2h后酶標(biāo)儀450nm條件下檢測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率=(A樣本-A空白)/A空白×100%。

1.2.6 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)甲狀旁腺激素

甲狀旁腺細(xì)胞接種于96孔板，每組32孔，48h后提取3組培養(yǎng)液上清，人PTH試劑盒電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)上清液中甲狀旁腺激素含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)(四分位間距)表示，非參數(shù)檢驗(yàn)比較兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，GraphPad Prism 9.0繪圖。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)分化腎小管上皮細(xì)胞分泌DJ-1蛋白

10μg/L TGF-β1培養(yǎng)HK-2細(xì)胞72h，Western印跡檢測(cè)α-SMA表達(dá)較正常培養(yǎng)組明顯升高(圖1)，提示腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。分別提取HK-2細(xì)胞正常培養(yǎng)組及10μg/L TGF-β1培養(yǎng)組0、1、3d培養(yǎng)液上清，ELISA法檢測(cè)分泌型DJ-1蛋白濃度，TGF-β1培養(yǎng)組較正常培養(yǎng)組分泌型DJ-1蛋白濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 ELISA法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞分泌DJ-1蛋白濃度(ng/mL，n=30)

圖1 Western印跡檢測(cè)HK-2細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)

2.2 分泌型DJ-1與P-FGFR1相互作用激活下游P-ERK1/2通路

免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B組甲狀旁腺細(xì)胞中DJ-1與P-FGFR1相互作用(圖2)，同時(shí)下游P-ERK1/2蛋白表達(dá)升高，但加入FGFR1抑制劑SU5402后(C組)P-ERK1/2蛋白的表達(dá)被部分抑制，見(jiàn)圖3。

圖2 免疫共沉淀檢測(cè)兩組甲狀旁腺細(xì)胞DJ-1與FGFR1相互作用

圖3 Western印跡檢測(cè)三組甲狀旁腺細(xì)胞P-ERK1/2蛋白濃度

2.3 轉(zhuǎn)分化腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清促進(jìn)甲狀旁腺細(xì)胞增殖及PTH分泌

CCK8法檢測(cè)B組甲狀旁腺細(xì)胞增殖率為118.40%(112.47%～119.55%)，較A組98.44%(97.12%～99.45%)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.876,P<0.001)，但C組細(xì)胞增殖率98.73%(97.23%～99.45%)較A組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-0.309,P=0.757)，見(jiàn)圖4。電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)3組細(xì)胞上清液中PTH濃度，B組125.38pg/mL(117.56～147.35pg/mL),較A組67.66pg/mL(55.37～79.77pg/mL),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.875，P<0.001);但C組67pg/mL(54.38～78.99pg/mL)，較A組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.544，P=0.587)。見(jiàn)圖5。

圖4 CCK8法檢測(cè)三組甲狀旁腺細(xì)胞增殖率(與A組比較，*P<0.001，n=32例)

圖5 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)3組甲狀旁腺細(xì)胞上清中PTH濃度(與A組比較，*P<0.001，n=32例)

2.4 不同組CCK8法檢測(cè)各組甲狀旁腺細(xì)胞增殖率與電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)各組甲狀旁腺激素濃度比較

不同濃度純化野生型分泌蛋白DJ-1(或加SU5402)及突變體加入甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)液后細(xì)胞增殖率分別為：D組118.67%(115.55%～119.56%)、E組120.67%(118.89%～130.82%)、F組130.50%(128.30%～139.59%)，較A組98.44%(97.12%～99.45%)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但G組97.68%(95.95%～99.41%)、H組98.90%(97.55%～99.54%)、I組98.51%(96.45%～99.52%)、J組99.44%(97.64%～99.54%)、K組99.26%(97.89%～100.50%)、L組98.52%(96.70%～99.35%)較A組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 CCK8法檢測(cè)各組甲狀旁腺細(xì)胞增殖率(與A組比較，*P<0.001，n=32例)

不同濃度純化野生型分泌蛋白DJ-1(或加SU5402)及突變體加入甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)液后PTH濃度分別為：D組129.88pg/mL(118.70～142.25pg/mL)、E組147.10pg/mL(140.65～158.08pg/mL)、F組165.61pg/mL(150.22～179.33pg/mL)，較A組67.66pg/mL(55.37～79.77pg/mL)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但G組61.49pg/mL(55.29～79.36pg/mL)、H組57.35pg/mL(50.90～73.98pg/mL)、I組66.66pg/mL(55.56～77.72pg/mL)、J組68.03pg/mL(59.46～77.72pg/mL)、K組74.23pg/mL(59.28～78.48pg/mL)、L組68.79pg/mL(58.98～78.23pg/mL)較A組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)各組甲狀旁腺激素濃度(與A組比較，*P<0.001，n=32例)

3 討 論

目前DJ-1在腎臟疾病中表達(dá)的研究多集中在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平上，尚無(wú)細(xì)胞外相關(guān)報(bào)道。在急性腎損傷模型中，Leeds等[15]發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素處理小鼠24h后DJ-1蛋白表達(dá)較4h升高更明顯，且主要表達(dá)在腎小管。Eltoweissy等[16]用促纖維化激動(dòng)劑ANG Ⅱ(0.5mmol/L)或PDGF(10nmol/L)處理腎小管上皮細(xì)胞，DJ-1蛋白與纖維化標(biāo)志物表達(dá)平行升高；在纖維化小鼠模型中同樣觀察到DJ-1蛋白表達(dá)隨模型周齡增加而逐漸升高。然而，Yin等[17]報(bào)道5ng/mL TGF-β1處理腎小管上皮細(xì)胞后前36h DJ-1表達(dá)逐漸升高，但隨后開(kāi)始下降；同時(shí)在UUO模型中發(fā)現(xiàn)DJ-1蛋白表達(dá)低于對(duì)照組。這種差異或許與藥物濃度及模型不同有關(guān)。我們用10μg/L TGF-β1處理腎小管上皮細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞外DJ-1蛋白分泌增加，但其是否能在CKD患者血清中檢測(cè)需進(jìn)一步臨床研究證實(shí)。

此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)加入細(xì)胞外DJ-1蛋白可以刺激甲狀旁腺細(xì)胞增生及PTH分泌，這種作用可以被FGFR1抑制劑SU5402阻斷，免疫共沉淀同時(shí)證實(shí)了細(xì)胞外DJ-1與FGFR1結(jié)合，并使其磷酸化。前期研究發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺上的FGFRs-Klotho復(fù)合物可以與FGF23結(jié)合，通過(guò)活化絲裂原活化蛋白激酶旁路發(fā)揮對(duì)甲狀旁腺激素合成的調(diào)控作用[5]。體外和體內(nèi)試驗(yàn)均證明FGF23/FGFR1可減少PTH信使RNA合成和抑制PTH分泌，上調(diào)甲狀旁腺細(xì)胞1-α羥化酶表達(dá)，增加局部1，25(OH)2D3合成，發(fā)揮對(duì)PTH的抑制作用[6]。目前認(rèn)為FGF23與FGFR1結(jié)合是繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，但本研究首次發(fā)現(xiàn)了DJ-1/FGFR1可能也參與其中。

另外，我們通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)下游信號(hào)通路P-ERK1/2被激活。但抑制FGFR1后，P-ERK1/2蛋白的表達(dá)僅輕度下降。一方面ERK通路可由生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及G蛋白耦聯(lián)受體的配體等多種途徑激活，單純抑制FGFR1不能完全阻斷ERK1/2的活化，推測(cè)細(xì)胞外DJ-1蛋白可能還與其它分子存在相互作用；另一方面DJ-1/FGFR1相互作用后下游可能也不僅僅激活了ERK1/2蛋白，其它下游途徑有待進(jìn)一步深入研究。