大豆孢囊線蟲侵染對乙烯合成及信號傳導基因表達調控的研究

郭賓會 宋麗

（1. 揚州大學農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009；2. 揚州大學生命科學基礎實驗教學中心，揚州 225009）

大 豆 孢 囊 線 蟲（Heterodera glycines，soybean cyst nematode，SCN）是一種土傳的定居型內寄生線蟲，在我國東北和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，受害大豆一般減產(chǎn)30%-50%，嚴重時可導致絕產(chǎn)［1］。乙烯（ethylene）是植物的一種重要內源激素，廣泛參與調控植物的生長發(fā)育及防御反應［2-3］。研究表明線蟲危害能夠強烈誘導植物釋放乙烯［4］。根結線蟲（root-knot nematode，RKN）感染番茄期間乙烯合成增加，并且向根環(huán)境中添加乙烯會增加根上成熟的線蟲數(shù)量［5］；SCN侵染的根中乙烯合成水平略低，但是根尖中ACC的含量則較高［6］；使用乙烯合成抑制劑處理后的擬南芥或大豆的根均可顯著吸引更多的線蟲［7-8］；產(chǎn)生過量乙烯的擬南芥遺傳突變體對甜菜胞囊線蟲高度敏感［9-10］。此外，乙烯的響應途徑也參與調控線蟲定殖，如ERF-E2基因（ethylene response factor gene）下調的番茄轉基因根的分泌物對南方根結線蟲的吸引力顯著增強［3］；在乙烯不敏感的擬南芥突變體根中甜菜胞囊線蟲定殖比野生型顯著減少［9-10］；對乙烯敏感性降低的大豆品系也顯著減少了SCN在根中的定殖。因此，乙烯的合成及信號傳導途徑在線蟲吸引過程中均發(fā)揮關鍵作用［11-12］。

近年來，諸多研究人員對SCN侵染后大豆根的基因表達變化進行了深入研究。在大豆Williams82中接種SCN 3號生理小種8-16 d后，根中乙烯響應普遍降低［13］。Tucker等［6］研究表明ACC合成酶（1-aminoacyclopropane 1-carboxylate synthase，ACS）基因的表達隨著侵染時間的延長表達量增加。Wan等［14］通過對比2個大豆抗性品種（PI 437654 and PI 567516C）接種大豆孢囊線蟲3 d和8 d后與未接種對比發(fā)現(xiàn)乙烯代謝相關的基因被顯著調控。此外，擬南芥接種甜菜胞囊線蟲J2幼蟲后24-48 h，EIN2基因先誘導后抑制［12］。乙烯響應成分結合蛋白基因（ethylene-responsive element-binding protein）在SCN侵染大豆抗性品種過程中亦受到顯著誘導［15-16］。

ACS基因催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）生成氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）進而合成乙烯，是乙烯合成途徑的重要限速酶［17］。ACS的活性調節(jié)主要包括轉錄調控、蛋白降解及磷酸化激活，其中轉錄調控是ACS普遍存在的調節(jié)方式之一。研究表明，生物脅迫及非生物脅迫均能夠廣泛誘導ACS基因表達［17］。乙烯受體EIN2（ethylene-in-sensitive，EIN）和轉錄因子EIN3是位于乙烯信號傳導途徑的下游重要組分，正調控乙烯應答基因的表達［18］。

盡管乙烯合成及信號傳導途徑參與線蟲侵染及定殖在近年來取得了較多進展，但至今為止，對于乙烯合成基因ACS及信號途徑EIN基因如何參與誘導大豆孢囊線蟲抗性的分子機理仍所知甚少，尤其是在大豆不同抗性品種中上述基因響應孢囊線蟲侵染時表達水平有何不同尚無報道。本研究對8個大豆抗病材料和2個感病材料在SCN 3號生理小種侵染10 d后的乙烯相關基因（ACS和EIN基因家族）的表達水平與未接種材料進行了比對，為進一步了解大豆抗性品種的抗性分子機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究用到的大豆抗病品種為Forrest、Peking、PI 437654、PI 89772、PI 90763、PI88788、PI548316、PI567516C和PI 438489B，感病品種為Magellan和Essex。以上品種由美國密蘇里大學大豆研究室保存。材料種植在美國密蘇里大學（哥倫比亞校區(qū)）植物系溫室中。

1.2 方法

1.2.1 蟲卵采集及大豆胞囊線蟲卵懸液制備 將種植在溫室盤中（17 cm ×28 cm×17 cm）含有3號生理小種的病土中生長1個月左右的感病品種Lee68從土中取出，通過高壓水槍沖洗根收集孢囊，依次在不同孔隙度（孔徑250、105、75和25 μm）的篩子上研磨，最終將胞囊破碎后釋放出來的卵沖洗入燒杯內。終濃度為13%的蔗糖溶液密度梯度離心后收集蟲卵，取10 μL進行梯度稀釋，然后在顯微鏡下計數(shù)蟲卵密度，備用接種。

1.2.2 大豆幼苗培養(yǎng)及接種 上述11個大豆品種材料首先在萌發(fā)紙袋中室溫萌發(fā)3-5 d，然后選取生長一致的幼苗移至溫室盆中的無菌沙壤土中培養(yǎng)3 d。盆容量為8 L，將盆懸掛在控溫的水中，以保持土壤溫度約27℃。每盆插入25個管子（直徑約3 cm，長25 cm），每管移栽一株大豆幼苗。在每個大豆主根附近打1個深度約15 cm的孔，將蟲卵懸浮液依次注入，每株接種蟲卵的個數(shù)約為2 000個。未接種材料注入等體積水作為對照。每個材料接種10棵，接種10 d后，連根挖出，用無菌水將5棵大豆的根快速清洗并擦干水分后置液氮中速凍，然后超低溫冰箱保存。未接種材料同時取材作為對照。實驗重復3次。

1.2.3 染色觀察 大豆根用5.25%次氯酸鈉浸泡4 min后，用流動的自來水沖洗干凈，然后置于0.37%酸性品紅溶液中染色，微波爐中煮沸約30 s，取出置于流動的自來水下沖洗。將根置于甘油中保存和觀察。使用解剖顯微鏡觀察染色后的SCN幼蟲，以確保接種效率［19］。

1.2.4 RNA提取 冷凍樣品在液氮中用研缽和杵研磨成粉末。按照Qiagen 植物RNA提取試劑盒（Cat#74904）說明書提取約200 mg的組織樣本中總RNA。所提取的總RNA進一步用Qiagen無核糖核酸酶DNA酶試劑盒（Cat#79254）消化DNA。使用Nanodrop?1000分 光 光 度 計 定 量RNA（Thermo Scientific）。

1.2.5 熒光定量PCR 以提取的每個樣本的2 μg總RNA為 模 板，按 照Clontech反 轉 錄 試 劑盒（Cat#639549）說明書合成cDNA。PCR反應使用Thermo公 司 的Maxima SYBR Green/ROX qPCR（Cat#K0223）。擴增程序如下：50℃ 2 min，95℃ 10 min，然后95℃ 15 s，60℃ 10 min，40個循環(huán)。以Actin（Glyma.18G290800）基因為內參基因。每個樣本有3個生物學重復和2個技術重復。用2-（ΔΔct）法計算出各個基因在不同材料中的相對表達量。所有引物均采用Primer3在線程序設計（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）［20］。引物序列見表1。大豆EIN和ACS基因命名采用Arraes等［21］文章中的命名規(guī)則。

表1 乙烯相關基因及其RT-qPCR引物序列Table 1 Ethylene related genes and their RT-qPCR primer sequences

2 結果

2.1 大豆EIN和ACS家族的組織特異性表達分析

大豆基因組共編碼21個GmACS基因及11個GmEIN基因。為了確定大豆EIN和ACS基因家族在不同組織的表達譜，我們對Phytozome數(shù)據(jù)庫中的基因組織表達模式進行了分析。結果如圖1所示，GmACS和GmEIN基因在大豆營養(yǎng)和生殖生長的不同組織中均有不同豐度的表達。在根和根毛中相對高表達的基因有GmACS#001、GmACS#005、G m A C S#0 0 6、G m A C S#0 0 7、G m A C S#0 1 0、GmACS#012、GmACS#015和GmACS#020， 其 中GmACS#015在葉組織中表達也較高。而GmEIN基因家族均無在根及根毛中有特異性高表達。

圖1 GmACS和GmEIN基因家族的組織表達模式Fig. 1 Tissue expression patterns of GmACS and GmEIN gene families

2.2 SCN接種后侵染效果

為監(jiān)測孢囊線蟲接種效果，我們對3號生理小種感病的大豆品種Magellan分別在接種2、4、6和8 d后的侵染情況進行了觀察。如圖2所示，孢囊線蟲經(jīng)歷了從J2-J4期的發(fā)育（2-A-D），表明SCN侵染成功，而且侵染效率較高。圖2-E表明在單株不同的根中SCN侵染8 d后染色觀察，結果表明SCN在大豆根系中不同根中的侵染效率也是較高的，為后續(xù)RNA表達水平分析提供保障。

圖2 SCN（race 3）侵染大豆Magellan品種后根組織染色Fig.2 Root staining after SCN（race 3）infecting soybean Magellan variety

2.3 不同大豆品種中GmEIN基因在SCN侵染后的表達模式

我們根據(jù)GmEIN基因家族的相對表達水平及特異性組織表達模式，對其中6個基因進行了SCN侵染前后的表達模式分析。如圖3所示，6個GmEINs基因在SCN侵染10 d后，表達變化水平較小，其中GmEIN#010和GmEIN#007在所有大豆品種中其表達水平均未受到顯著調控。此外，在非抗病性品種Magellan和Essex中，以及抗性品種Forrest、Peking、PI 88788、PI 548316、PI 567516C中，6個GmEINs的表達均未受到顯著調控。GmEIN#001、GmEIN#005、GmEIN#006和GmEIN#008的 表 達 在PI 438489B均受到SCN顯著上調上調幅度較小，約1.5-2.2倍 左 右。另 外，GmEIN#001、GmEIN#005和GmEIN#008的表達在PI 437654、PI 89772和PI 90763中亦均受到SCN顯著誘導。以上研究結果表明4個大豆抗性品種（PI 438489B、PI 437654、PI 89772和PI 90763）中乙烯的信號傳導在SCN侵染后得到一定程度加強，但是其他5個抗病品種中的表達與2個感病品種相似。

圖3 GmEIN基因在SCN侵染10 d后與未侵染對照的相對表達水平Fig.3 Relative expressions of GmEIN genes in SCN infected root 10 d after inoculation compared with uninfected control

2.4 不同大豆品種中GmACS基因在SCN侵染后的表達模式

選取9個GmACS基因進行SCN侵染前后的表達模式分析。如圖4和5所示，乙烯合成相關基因ACS家族9個基因在SCN侵染10 d后，在抗病品種中表達水平受到了顯著調控（升高或抑制）。首先，PI 548316中有7個ACS基因（圖4-C、圖5-A-F）的表達被顯著上調，其表達水平可升高6-260倍，如升高幅度最大的是GmACS#009，較未接種對照升高了260倍左右。其次，在PI 437654和 PI 88788中，多個GmACS基因的表達受到顯著抑制。但是感病品種中，9個GmACS基因表達水平在侵染和未侵染植株中均無顯著性差異。有些品種中僅其中幾個基因受到顯著調控，例如在Forrest品種 中，GmACS#009、GmACS#018和GmACS#014的表達受到了SCN侵染的顯著上調（圖5-A-C）。在Peking品種中，GmACS#020的表達受到了SCN侵染的顯著上調（圖5-F），但是SCN侵染卻顯著下調了GmACS#007、GmACS#011和GmACS#015的表達（圖4-A-C）。上述結果表明乙烯的合成基因GmACS的表達在不同的抗性材料中受到了顯著的差異調控。

圖4 GmACS#007、GmACS#011和GmACS#015在SCN侵染10 d后與未侵染對照的相對表達水平Fig.4 Relative expressions of GmACS#007，GmACS#011and GmACS#015 in SCN infected root 10 d after inoculation compared with uninfected control

圖5 6個GmACS基因在SCN侵染10 d后與未侵染對照的相對表達水平Fig.5 Relative expressions of 6 GmACS genes in SCN infected root 10 d after inoculation compared with uninfected control

3 討論

大豆孢囊線蟲J2幼蟲通過口針侵入大豆根部，到達維管束后注入大量的分泌物溶解相鄰細胞的細胞壁，細胞壁溶解后原生質體融合即形成合胞體（syncytia）。因此，合胞體是線蟲建立的多核取食位點來供其生長發(fā)育，合胞體在形態(tài)和生理上的變化是大豆基因表達變化調控的直接結果［12，22］。Ithal等［23］通過顯微切割的方式對SCN侵染后大豆根中形成的合胞體的表達譜進行分析發(fā)現(xiàn)乙烯相關基因（如ACO，EIL1和ERF）受到調控。在SCN幼蟲侵染及合胞體發(fā)育過程中，ACC氧化酶基因和ERF-TF基因的表達被顯著調控［24］。本研究表明GmEIN基因主要在PI 437654、PI 89772、PI90763和PI438489B中表達被上調，在其余抗病及感病品種中均無顯著變化。GmACS基因的表達調控分為兩種類型：Peking、PI 437654、PI88988和PI 89772中被顯著下調，而PI548316、PI567516C和PI438489B中的表達被顯著上調，感病材料中無顯著變化。由于本研究取材時間為SCN蟲卵接種10 d后，此時合胞體已經(jīng)形成，因此我們認為GmEIN和GmACS基因在不同抗性品種中的表達變化不僅與合胞體的發(fā)育相關，也與品種之間抗病程度及機制不同相關。未來進一步對合胞體中基因表達變化的深入解析將是挖掘SCN抗性機制的基礎。

研究人員通過轉基因技術發(fā)現(xiàn)乙烯合成或響應基因的確參與植物抗病蟲性。Dahl等［4］發(fā)現(xiàn)下調煙草（N. attenuate）ACS基因的表達可減少蟲害誘導的乙烯釋放。過量表達ERF基因（RAP2.6）的轉基因擬南芥對甜菜孢囊線蟲的抗性增強［25］。過量表達rF113（AtRAP2.6的同源基因）的轉基因大豆對大豆疫霉病的抗性增強［26］。另一方面，擬南芥AtRAP2.6L基因突變體對丁香假單胞菌的防御反應增強［27］。因此，乙烯的響應及信號傳導在不同的植物品種及不同的抗病性中發(fā)揮復雜的調控功能。我國研究人員發(fā)現(xiàn)灰皮支黑豆（ZDD2315）是一個高抗SCN的大豆品種，在SCN 3號小種侵染后，與未接種對照相比，外源乙烯利施加降低灰皮支黑豆中SCN侵染率可達29.01%；而在敏感品種遼豆15中，乙烯利施加降低遼豆15中J2侵染率可達41.88%。因此，乙烯可能通過影響SCN幼體的感染率而發(fā)揮重要作用［16］。本研究中多個抗性品種的GmACS基因在SCN侵染后表達量受到大幅度調控，進一步說明乙烯的合成受到SCN侵染調控，而且這些GmACS基因可以作為提高大豆抗SCN育種的候選基因。但是有些抗性品種中未觀察到GmACS基因表達的顯著變化，說明在大豆SCN抗性品種及其抗性機制上可以分為兩類，和乙烯合成相關或不相關。

目前我國報道的SCN生理小種已達11個，其中，1、3、4 號為主要致病小種且分布最廣，3 號生理小種的致病力強且分布較廣［28］。我國大豆品種資源豐富，篩選和利用抗性品種是控制大豆孢囊線蟲危害的最經(jīng)濟有效的方法。然而，大豆防御大豆孢囊線蟲的分子機制非常復雜，不僅涉及大豆品種，還有線蟲的不同生理小種。目前，育種學家已經(jīng)篩選出多個對抗不同生理小種的種質資源，然而仍有較多抗性種質資源的抗蟲分子機制尚不清楚［29］。盡管多個抗性品種中GmACS基因的表達上調，但是PI548316品種中多個GmACS基因的誘導表達水平非常高，原因可能是該品種在受到SCN侵染10 d后的時間點，乙烯的合成被大幅上調。其他抗性品種中可能也有如此高的誘導表達水平，但是由于和侵染時間相關性較強，本次研究可能未檢測到基因誘導峰值。其次，可能和不同的大豆孢囊線蟲生理小種侵染相關。后續(xù)我們將對不同抗性品種在不同生理小種侵染不同時間段后檢測ACS基因的表達水平，以期深入解析乙烯合成與孢囊線蟲侵染之間的關系。

4 結論

本研究對大豆乙烯合成及信號響應基因在不同大豆材料（抗病或感病）中如何響應SCN侵染進行了表達水平的模式分析，研究結果表明乙烯合成基因GmACS在SCN侵染后的多個品種中的表達受到顯著調控。研究結果不僅有助于更好地了解大豆-孢囊線蟲互作，更為進一步解析不同種質資源中乙烯合成相關基因家族的響應及調控模式提供線索，從而為深入揭示不同大豆材料抗SCN機理提供理論依據(jù)。

致謝

本研究得到美國密蘇里大學植物系Henry T.Nguyen教授的大力支持，實驗結果均在該實驗室取得。