不同日齡鴨肌肉組織多胺代謝和肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的規(guī)律

周雪敏 康麗鵑 郭永妮 楊笑含 蔣易龍 王澤龍 孫倩 康波

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130）

多胺主要包括腐胺、亞精胺和精胺［1］，三者在鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）、亞精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）、精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）、亞精胺/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn) 移 酶（spermidine/spermine N 1 -acetyltransferase，SSAT）、乙酰多胺氧化酶（acetylpolyamine oxidase，APAO）、精胺氧化酶（spermine oxidase，SMO）等多胺合成代謝相關(guān)酶作用下，相互轉(zhuǎn)換以維持多胺池的穩(wěn)態(tài)［2］。多胺具有調(diào)控動(dòng)物生長發(fā)育、繁殖和衰老等多種生物學(xué)功能［3-4］。近年來研究表明，多胺在細(xì)胞增殖過程中必不可少［5］，可參與調(diào)控組織再生和發(fā)育過程。多胺能促進(jìn)小鼠骨骼肌的修復(fù)、纖維化和組織重塑［6］，調(diào)節(jié)肌源性分化［7］，對(duì)肌肉組織再生［8］和發(fā)育具有重要調(diào)控作用；多胺代謝異常會(huì)導(dǎo)致肌肉發(fā)育不良、肌肉肥大和萎縮［9］。骨骼肌的生長發(fā)育狀況是家禽產(chǎn)肉性能的重要影響因素［10］，家禽出生后的骨骼肌增重迅速，其生長主要由肌纖維肥大和衛(wèi)星細(xì)胞增殖融合引起［11］，表現(xiàn)為肌纖維的增粗和增長。肌源性調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）主要包括肌源性因子5（myogenic factor 5，Myf5）、生肌決定因子1（myostatin1，MyoD1）和肌細(xì)胞生成素（myogenin，MyoG）等［12］，它們調(diào)控了整個(gè)肌肉發(fā)育過程［13］。胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是調(diào)節(jié)骨骼肌合成代謝和分解代謝的關(guān)鍵生長因子［14］；肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）基因，是一種骨骼肌生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，其功能和表達(dá)量的變化也可能會(huì)造成肌肉重量的變化［15］。然而，這些調(diào)控肌肉發(fā)育的關(guān)鍵基因在鴨出生后的表達(dá)規(guī)律及其與多胺調(diào)控禽類肌細(xì)胞增殖分化、骨骼肌發(fā)育的研究尚不完全清楚。

因此，本研究檢測不同日齡鴨肌肉組織多胺含量、多胺代謝和肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量的變化，探究肌肉組織多胺代謝和肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的規(guī)律及其相關(guān)性，為闡明多胺調(diào)控鴨肌肉發(fā)育作用機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水禽育種場提供同批孵化的農(nóng)華麻鴨30只（雌雄各半），日糧營養(yǎng)水平和管理方式均一致。分別在出雛后的0、30、60、90和120日齡采集鴨胸肌和腿肌組織并迅速凍于液氮，而后存放至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩１緦?shí)驗(yàn)的動(dòng)物使用已通過四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的倫理審查和批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 使用Tirzol（TaKaRa，大連）法提取鴨胸肌和腿肌總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。按照RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 肌肉發(fā)育、多胺代謝相關(guān)基因的RT-qPCR檢測分析 應(yīng)用GenBank下載目的基因序列，使用Primer Premire 5.0軟件設(shè)計(jì)引物后利用Oligo 12對(duì)設(shè)計(jì)的引物評(píng)價(jià)，整理后送到擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成，引物信息如表1。以不同日齡的鴨胸肌和腿肌cDNA為模板，采用PCR反應(yīng)體系（10 μL）：0.5 μL的cDNA模板，上下游引物各0.2 μL，SYBR Green 5.0 μL，去RNase水4.1 μL。反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s；退 火，30 s；95℃，15 s；60℃，30 s。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.2.3 高效液相色譜檢測多胺含量 取0.1g鴨肌肉組織浸泡于0.5 mL的5%高氯酸，加入10 μL的1，6-己二胺研磨充分，取上清；上清液中加入2 mL 2.5% NaOH和4 μL的苯甲酰氯，漩渦振蕩均勻，置于40℃水浴鍋衍生30 min，將pH調(diào)至7.0；用15 mL超純水和15 mL 15%甲醇潤洗C18固相萃取柱，再用萃取柱過濾衍生液，接著用0.5 mL甲醇洗脫樣品；0.22 μm針頭過濾器過濾洗脫液后4℃避光保存。以流速0.5 mL/min，紫外檢測器檢測波長229 nm；柱溫25℃，流動(dòng)相組成水∶甲醇=38∶62（V∶V）作為高效液相色譜檢測條件。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 利用2-??Ct法，以GAPDH作為內(nèi)參基因，計(jì)算不同日齡組鴨肌肉組織中目的基因的相對(duì)表達(dá)量，運(yùn)用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA過程進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。使用Origin 軟件對(duì)不同日齡鴨肌肉組織多胺代謝和肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行Pearson Correlation相關(guān)性分析和繪圖。數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同日齡鴨肌肉組織多胺含量的變化規(guī)律

如圖1和圖2所示，0日齡鴨胸肌組織多胺含量最高（P<0.05），30日齡時(shí)顯著下降（P<0.05），60 日齡鴨胸肌組織腐胺和亞精胺含量繼續(xù)下降，之后無顯著變化，而鴨胸肌精胺含量則自此開始無顯著變化（P>0.05）。如圖2所示，0日齡鴨腿肌組織多胺含量最高（P<0.05），30日齡時(shí)下降，之后隨日齡增加，無顯著變化（P>0.05）。

圖1 不同日齡鴨胸肌組織多胺含量的變化規(guī)律Fig. 1 Changes of polyamine contents of different aged duck pectoralis

圖2 不同日齡鴨腿肌組織多胺含量的變化規(guī)律Fig. 2 Changes of polyamine contents in different aged duck leg muscles

2.2 不同日齡鴨肌肉組織多胺代謝相關(guān)基因表達(dá)量的變化規(guī)律

如圖3、圖4所示，胸肌ODC和SPMS基因表達(dá)量在0日齡時(shí)最高（P<0.05），而后下降，到60日齡時(shí)表達(dá)量最低（P<0.05），隨后ODC和SPMS基因表達(dá)量上升，90日齡的表達(dá)量顯著高于60日齡（P<0.05），而與120日齡時(shí)的表達(dá)量無顯著差異（P>0.05）；SPDS和APAO基因表達(dá)量隨著日齡增加先下降后上升，SPDS基因表達(dá)量在0日齡時(shí)最高，30日齡和60日齡時(shí)下降，但30日齡和60日齡的表達(dá)量無顯著差異（P>0.05），隨后SPDS表達(dá)量逐漸上升，120日齡的表達(dá)量顯著高于90日齡，而顯著低于0日齡時(shí)的表達(dá)量（P<0.05），APAO基因0日齡的表達(dá)量僅次于120日齡時(shí)達(dá)到的最大表達(dá)量（P<0.05），30、60和90 日齡表達(dá)量的變化趨勢與SPDS的表達(dá)規(guī)律一致；SSAT和SMO基因表達(dá)量在0日齡時(shí)最高而后下降，SSAT下降到60日齡后保持不變（P>0.05），SMO下降至30日齡后保持不變（P>0.05）。如圖4所示，腿肌中多胺合成基因都具有先升高后降低再升高的規(guī)律，但存在一定時(shí)間差異，ODC第一次升高在30日齡（P<0.05），而后下降，最后在120日齡時(shí)達(dá)到最高（P<0.05），SPDS和SPMS第一次升高在60日齡（P<0.05），最后在120日齡時(shí)達(dá)到最高（P<0.05）；多胺代謝相關(guān)基因SSAT和SMO表達(dá)量都呈先下降后不變最后再升高的規(guī)律，SSAT基因表達(dá)量0日齡時(shí)最高（P<0.05），30日齡時(shí)顯著降低，但與60日齡和90日齡時(shí)表達(dá)量無顯著差異（P>0.05），隨后上升至與0日齡時(shí)無顯著差異（P>0.05），APAO基因表達(dá)量0日齡時(shí)最高（P<0.05），30日齡時(shí)下降，從60 日齡開始隨日齡增加，逐漸上升并在120日齡時(shí)上升至與0日齡時(shí)無顯著差異（P>0.05）。

圖3 不同日齡鴨胸肌中多胺代謝相關(guān)基因表達(dá)量變化Fig. 3 Expression changes of of polyamine metabolism related gene in different aged duck pectoralis

圖4 不同日齡鴨腿肌中多胺代謝相關(guān)基因表達(dá)量變化Fig. 4 Expression changes of polyamine metabolism related gene in different aged duck leg muscles

2.3 不同日齡鴨肌肉組織發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量的變化規(guī)律

以RT-qPCR方法對(duì)鴨胸肌和腿肌肌肉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測分析，結(jié)果如圖5、圖6所示。胸肌中MyoD1和Myf5基因均在0日齡時(shí)表達(dá)最高（P<0.05），而后下降，到60日齡和90日齡時(shí)表達(dá)較低，而后相比于60日齡表達(dá)略有上升；MyoG和IGF-1基因在0日齡時(shí)表達(dá)較高，30日齡時(shí)達(dá)到最高（P<0.05），60日齡時(shí)表達(dá)降低，而后不發(fā)生顯著變化；而MSTN基因表達(dá)量在30日齡時(shí)顯著下降達(dá)到最低，60日齡時(shí)逐漸上升，到90日齡時(shí)最高而后又下降。腿肌中，MyoD1基因表達(dá)在90日齡和120日齡時(shí)升高；Myf5基因在30日齡和60日齡時(shí)下降，90日齡和120日齡時(shí)略有升高；MyoG基因表達(dá)量在30日齡時(shí)升高而后趨于不變；MSTN基因在90日齡時(shí)升高，120日齡時(shí)達(dá)到最高。

圖5 不同日齡鴨胸肌中MyoD1、Myf5、MyoG、IGF-1和MSTN基因表達(dá)量變化Fig. 5 Changes of MyoD1，Myf5，MyoG，IGF-1 and MSTN gene expressions in different aged duck pectorales

圖6 不同日齡鴨腿肌中MyoD1、Myf5、MyoG和MSTN基因表達(dá)量變化Fig. 6 Expression changes of MyoD1，Myf5，MyoG and MSTN gene in different aged duck leg muscles

2.4 不同日齡鴨肌肉發(fā)育相關(guān)基因與多胺代謝基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

對(duì)不同日齡鴨肌肉發(fā)育相關(guān)基因和多胺代謝基因表達(dá)量進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析，由表2和表3可知，列入r2值大于等于50%的兩兩配對(duì)。相關(guān)性分析表明，鴨胸肌中MyoD1基因與SPMS、SPDS、SSAT、SMO基因的相關(guān)系數(shù)分別0.733 24、0.846 36、0.810 69和0.827 96，且 差 異 極 顯 著（P<0.01）；Myf5基因與SPMS、SPDS、SSAT、SMO基因的相關(guān)系數(shù)分別為0.946 4、0.827 96、0.945 63和0.916 11，且差異極顯著（P<0.01）。鴨腿肌中ODC基因與MyoD1、MSNT基因的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.746 32和0.919 39，且差異極顯著（P<0.01）。

表2 胸肌中肌肉發(fā)育相關(guān)基因與多胺代謝基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficient between expressions of polyamine metabolism and muscle development genes in breast muscle

表3 腿肌中肌肉發(fā)育相關(guān)基因與多胺代謝基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between expressions of polyamine metabolism and muscle development genes in leg muscle

3 討論

3.1 鴨胸肌和腿肌組織多胺含量的變化

近年來研究表明，多胺可參與調(diào)控組織再生和發(fā)育過程。多胺能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞生長必不可少［16］，在生長迅速的組織中其含量明顯高于其他組織［5］。多胺可促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞分化，增強(qiáng)小鼠坐骨神經(jīng)切斷后的代償性肌肉肥大［7］。多胺及其前體處理可提高牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖率和增殖相關(guān)基因的表達(dá)［17］，以及牛衛(wèi)星細(xì)胞分化相關(guān)基因豐度［18］。多胺可以改善因年齡、氧化應(yīng)激造成的肌肉萎縮和肌肉營養(yǎng)不良［19］。作為多胺的一種，亞精胺能誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞自噬從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［20］。研究發(fā)現(xiàn)，鴨胸肌和腿肌生長發(fā)育存在一定的性別和品種的差異，高郵鴨和金定鴨的胸肌重拐點(diǎn)日齡為52日齡，腿肌重拐點(diǎn)日齡為16 日齡［21］；北京鴨兩個(gè)品系的胸肌重拐點(diǎn)日齡在36-41日齡，腿肌重拐點(diǎn)日齡在20-23 日齡［22］；烏嘴白羽優(yōu)質(zhì)肉鴨胸肌重和腿肌重的拐點(diǎn)日齡，公鴨為50.4日齡、27.3日齡，母鴨為46.2日齡、25.2 日齡［23］，這些結(jié)果提示雛鴨胸肌、腿肌的快速生長期分別在60日齡和30 日齡以前。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0日齡和30日齡鴨胸肌組織中以及0日齡鴨腿肌組織中多胺含量較高，提示在鴨胸肌和腿肌快速生長時(shí)期，多胺可能促進(jìn)肌肉細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而參與調(diào)控肌肉組織的生長發(fā)育。然而，出生后的鴨肌肉發(fā)育主要是肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、再生和肥大，30 日齡相比于0日齡的胸肌增重是增加的，多胺含量是下降的，由于我們?nèi)狈?duì)鴨胸肌和腿肌重的拐點(diǎn)日齡及其前后日齡的多胺含量檢測，所以胸肌和腿肌增重與多胺含量變化是否存在相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

3.2 鴨胸肌和腿肌多胺代謝相關(guān)基因表達(dá)量的變化

多胺合成代謝基因ODC、SPDS、SPMS及多胺分解代謝相關(guān)基因SSAT、APAO、SMO調(diào)控腐胺、精胺和亞精胺三者相互轉(zhuǎn)化［24］，進(jìn)而調(diào)控多胺代謝在機(jī)體內(nèi)保持動(dòng)態(tài)穩(wěn)定，這與細(xì)胞正常增殖和組織生長息息相關(guān)［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，鴨胸肌中的多胺代謝相關(guān)基因，除APAO外均在0日齡時(shí)表達(dá)最高，說明0日齡時(shí)多胺合成及分解代謝較為旺盛。ODC和SPMS基因表達(dá)模式相似，均在0日齡時(shí)最高，而后下降，到60日齡時(shí)表達(dá)最低，而后表達(dá)上升無顯著變化；SPDS和APAO表達(dá)模式類似，表現(xiàn)為30日齡時(shí)下降，60日齡時(shí)保持不變，90日齡和120日齡逐漸上升；SSAT和SMO基因表達(dá)在0日齡時(shí)最高而后下降，SSAT下降到60日齡后保持不變，SMO下降至30日齡后保持不變，而鴨胸肌中多胺含量先下降后不變的規(guī)律，提示胸肌中多胺代謝相關(guān)基因呈一定規(guī)律性變化調(diào)節(jié)著多胺池的穩(wěn)態(tài)。鴨腿肌中，ODC基因表達(dá)趨勢表現(xiàn)為30日齡時(shí)升高，60日齡時(shí)下降，90日齡時(shí)不變，120日齡時(shí)又上升至最高；SPDS和SPMS基因表達(dá)規(guī)律一致，表現(xiàn)為60日齡時(shí)升高，90日齡時(shí)下降，120日齡時(shí)上升至最高；SSAT和SMO基因表達(dá)規(guī)律相似，表現(xiàn)為先下降后不變，再上升到120日齡時(shí)達(dá)到最高，而APAO基因表達(dá)量先不變再上升至120日齡時(shí)達(dá)到最高，提示腿肌多胺代謝相關(guān)基因呈一定規(guī)律表達(dá)并調(diào)控多胺池的穩(wěn)定。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)胸肌和腿肌多胺代謝相關(guān)基因表達(dá)有著不同的規(guī)律，這可能由于胸腿和腿肌起源、發(fā)育速度以及快肌和慢肌分布不同［26］造成的組織差異性。

3.3 鴨胸肌和腿肌多胺代謝基因與肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性

出生后早期階段，衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和融合可使肌核數(shù)量增加，有助于肌肉生長，而出生后期及成年后肌肉的肥大則不伴隨肌核數(shù)量的改變和衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和融合［27］。MyoD1和Myf5在成肌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化及肌纖維形成過程有重要作用［28］，在成年后可通過其表達(dá)判斷肌肉增殖和肥大［29］。MyoD1過度表達(dá)會(huì)抑制成肌細(xì)胞增殖并加快成肌纖維細(xì)胞的成熟［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，鴨胸肌的MyoD1和Myf5基因表達(dá)量在0日齡時(shí)最高，30日齡時(shí)下降，60日齡時(shí)繼續(xù)下降，與腐胺、亞精胺含量變化規(guī)律和多胺相關(guān)代謝基因（ODC、SPMS、SPDS、SSAT）表達(dá)規(guī)律一致，可能在早期參與衛(wèi)星細(xì)胞增殖融合的肌肉生長過程；而后相比于60日齡和90日齡，120日齡時(shí)胸肌中MyoD1、SPDS和APAO基因顯著升高，推測MyoD1、SPDS和APAO基因在生長發(fā)育后期參與肌肉的成熟和肥大；另外，相關(guān)性分析表明MyoD1和Myf5基因與鴨胸肌多胺代謝基因（SPMS、SPDS、SSAT、SMO）存在顯著正相關(guān)，提示多胺代謝基因（SPMS、SPDS、SSAT、SMO）與MyoD1和Myf5基因共同參與鴨胸肌的發(fā)育。MyoG同樣是MRFs成員，作為骨骼肌發(fā)育的正調(diào)控因子，促進(jìn)肌細(xì)胞增殖形成肌纖維［17］，主要影響產(chǎn)肉性能［31］。IGF-1可促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞的增殖、肌細(xì)胞的分化以及融合成肌管［32］，也與肌肉質(zhì)量增加密切相關(guān)，是唯一能在肌肉再生和肥大中起關(guān)鍵作用的生長因子［33］。胸肌中，MyoG和IGF-1基因在30日齡時(shí)達(dá)到最高，提示30日齡時(shí)是胸肌發(fā)育的重要時(shí)期。MSTN作為肌肉生長發(fā)育的抑制劑，胸肌中MSTN在90日齡時(shí)達(dá)到最高，提示90日齡時(shí)胸肌發(fā)育受到了負(fù)向調(diào)控。然而，腿肌MyoD1的基因表達(dá)與MSTN的表達(dá)相似，在90日齡和120日齡時(shí)突然升高，且MSTN在120日齡時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)ODC、SPDS、SPMS和APAO基因表達(dá)量達(dá)到最高，推測在120日齡時(shí)腿肌中多胺代謝較為旺盛，可能與MyoD1和MSTN基因共同調(diào)控鴨腿肌的生長。此外，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，多胺合成限速酶基因ODC與MyoD1和MSTN基因表達(dá)具有相關(guān)性，提示ODC可能與MyoD1和MSTN基因共同參與鴨腿肌的發(fā)育。

4 結(jié)論

鴨胸肌和腿肌的多胺含量在0日齡和30日齡時(shí)較高，胸肌和腿肌中多胺代謝基因呈一定規(guī)律變化，且鴨胸肌中多胺代謝基因（SPMS、SPDS、SSAT、SMO）與肌肉發(fā)育相關(guān)基因（MyoD1和Myf5）的表達(dá)存在正相關(guān)，腿肌中多胺代謝基因ODC與MyoD1和MSTN基因表達(dá)正相關(guān)，提示這些多胺代謝基因與肌肉發(fā)育相關(guān)基因可能共同調(diào)控鴨胸肌和腿肌的生長。