內(nèi)生菌影響藥用植物產(chǎn)生藥理活性化合物的研究進展

張昊 劉苗苗 劉曉娜 李宗諭 趙麗麗 楊清香

（河南師范大學生命科學學院 河南省農(nóng)業(yè)微生物生態(tài)與技術(shù)國際聯(lián)合實驗室，新鄉(xiāng) 453007）

藥用植物是指全部或部分可以直接用作藥物或提取藥物的植物［1］。尤其在以中醫(yī)、藏醫(yī)、印度佛教醫(yī)學為代表的傳統(tǒng)醫(yī)學領(lǐng)域，藥用植物作為天然藥物的主要來源，為全世界大約80%的發(fā)展中國家人口提供了初級醫(yī)療保健服務(wù)［2］。調(diào)查1981-2014年間研發(fā)的新藥產(chǎn)品發(fā)現(xiàn)，即便在現(xiàn)代醫(yī)學迅速發(fā)展的今天，仍有大約51%的臨床藥物來源于藥用植物中提取的天然產(chǎn)物［3］。一直以來，傳統(tǒng)觀點認為藥用植物藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量很大程度上受到植物遺傳背景、健康狀況、生長環(huán)境、土壤養(yǎng)分等因素的影響。然而近年來，隨著植物微生物組學研究的深入，人們逐漸認識到，內(nèi)生微生物可以通過特殊的微生物-植物相互作用，在影響藥材質(zhì)量和產(chǎn)量方面發(fā)揮重要作用。最令人感興趣的是，內(nèi)生菌提供了一個新興生物活性代謝產(chǎn)物的寶庫，尤其是生物堿、皂苷、醌類、類黃酮、萜類化合物等，至少60%的特征代謝物具有醫(yī)療和藥用潛力，可以成為抗菌、抗癌、抗病毒等多種人類疾病治療藥物的潛在候選物質(zhì)［4］。

據(jù)報道，在地球上近30萬種植物中，大約六分之一的植物具有產(chǎn)生藥用天然化合物的能力，然而，僅有少數(shù)植物的內(nèi)生生物學方面得到重視和研究［5］。中國是世界上利用和種植藥用植物歷史最為悠久的國家，天然的自然環(huán)境條件，使得我國的藥用植物資源不但蘊藏量豐富而且還具有多樣性等優(yōu)勢。在已知的1.4萬種最常用的中藥材中，約92%來源于藥用植物。例如，重樓具有消炎抑菌、止血、抗腫瘤的作用，是云南白藥、熱毒清等中成藥的主要原料［6］；決明子能夠清除肝熱，臨床上可用于治療高脂血癥和高血壓［7］。尤其是來自特定產(chǎn)區(qū)的道地藥材，由于其藥用成分含量高、臨床效果好、毒副作用小等特點而廣受歡迎。因此，為了更好地促進藥材生產(chǎn)，需要更多的了解內(nèi)生菌與藥用植物之間的特殊關(guān)系。本文綜述了內(nèi)生菌對藥用植物中藥用成分的影響，重點介紹了藥理活性化合物生物合成的機制問題，目的是強調(diào)藥用植物內(nèi)生微生物群落在天然藥物生產(chǎn)中的作用和潛力，其巨大的多樣性和生物活性，為提升藥用植物品質(zhì)以及研制新藥和新型類藥分子提供了良好研究領(lǐng)域，這些功能微生物和天然產(chǎn)物也代表了生物技術(shù)和醫(yī)療應(yīng)用的巨大資源。

1 藥用植物內(nèi)生菌多樣性

1866年，De Bary在顯微鏡下觀察植物組織時發(fā)現(xiàn)了微生物細胞的存在，并認為“任何生長在植物組織內(nèi)部的生物體都稱為內(nèi)生菌”。隨后，內(nèi)生菌的定義被眾多研究者逐一修訂，直到1991年，Petrini做出了最恰當?shù)拿枋觥獌?nèi)生菌是指在其生活史的一定階段定殖于植物組織而不會對宿主植物造成任何傷害的任何微生物［8］。

1.1 內(nèi)生菌群落多樣性

越來越多的研究證明內(nèi)生菌是多菌群微生物，可以無癥狀的在植物的莖、葉、根、種子等不同健康組織中生長，其分布和種群結(jié)構(gòu)受到宿主植物遺傳特性、健康狀況以及周圍生態(tài)環(huán)境的影響。已報道的植物內(nèi)生菌種類覆蓋原核和真核微生物類群，包括細菌、古菌、真菌以及藻類。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中存在的16S rDNA序列可知原核內(nèi)生菌包括23個已知門成員，其中21個來自細菌門，2個來自古菌門。常見于報道的藥用植物內(nèi)生細菌有16個門，大多屬于厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria［9］。常用的分離培養(yǎng)手段和基于16S rDNA序列分析的高通量測序技術(shù)是目前解析內(nèi)生菌多樣性的主流方法，根據(jù)鑒定結(jié)果顯示，前者從每株植物可獲得的內(nèi)生細菌數(shù)量為10-200種不等，后者則為20-600種［10］。棒桿菌屬Clavibactersp.、纖維單胞菌屬Cellulomonassp.、短桿菌屬Curtobacteriumsp.、微小桿菌屬Microbacteriumsp.、芽孢桿菌屬Bacillussp.和假單胞菌屬Pseudomonassp.都是常見的有定殖潛力的內(nèi)生細菌［11］。其中，放線菌屬細菌是革蘭氏陽性的絲狀細菌，多數(shù)都具有產(chǎn)生抗菌、抗癌化合物的代謝潛力。

藥用植物中的真核內(nèi)生菌主要由絲狀真菌組成。研究發(fā)現(xiàn)，不論采用何種分析方法，都顯示內(nèi)生真菌群落有非常寬泛的多樣性特征，是植物內(nèi)生菌中最豐富的優(yōu)勢類群?；趥鹘y(tǒng)培養(yǎng)的研究結(jié)果顯示，每株植物中有大約5-350種內(nèi)生真菌，而基于18S或ITS rDNA序列分析的高通量測序結(jié)果表明，每株植物可能有40-1 200種內(nèi)生真菌［10］。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分類，已報道的內(nèi)生真菌包括禾草內(nèi)生真菌和非禾草內(nèi)生真菌。前者主要侵染高寒地區(qū)草本植物，后者多存在于非維管植物、蕨類、裸子植物和被子植物的組織中，常見類群主要是形成菌絲的子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota和球囊菌門Glomeromycota［9］。這其中的某些屬，例如直立枝頂孢屬Acremoniumsp.、鏈格孢屬Alternariasp.、枝孢屬Cladosporiumsp.、盾殼霉屬Coniothyriumsp.、附球菌屬Epicoccumsp.、鐮刀霉屬Fusariumsp.、莖點霉屬Phomasp.和格孢腔菌屬Pleosporasp.在藥用植物內(nèi)生系統(tǒng)中分布十分廣泛，尤其是具有產(chǎn)生天然產(chǎn)物的生物合成能力。例如，知名中藥鴉膽子（Brucea javanica）是苦木科鴉膽子屬植物，因具有消炎、抗癌、抗瘧疾等功效而廣泛應(yīng)用于臨床治療。研究顯示，該植物中定殖有包括木霉Trichodermasp.、鐮刀霉Fusariumsp.、青霉Penicilliumsp.、曲霉Aspergillussp.等在內(nèi)的不少于83種內(nèi)生真菌，其中木霉產(chǎn)生的糖苷類化合物具有明顯的抗突變和抗氧化活性［12］。與上述非禾草內(nèi)生真菌相比，禾草內(nèi)生真菌多樣性較低，分類學上屬于麥角菌科香柱菌屬Epichlo?sp.和瘤座菌屬Balansiasp.，其顯著特點是通過植物種子垂直傳播，主要能產(chǎn)生抗蟲和抗脊椎動物的生物堿類活性化合物［10］。

1.2 內(nèi)生菌功能多樣性

內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中最重要的組成之一，對宿主植物的生長發(fā)育有重要影響。內(nèi)生菌定殖后，在從宿主植物那里獲得穩(wěn)定生活環(huán)境的同時，還對植物發(fā)揮益生作用，主要表現(xiàn)在以下3個方面。（1）影響宿主植物的健康和生長。研究發(fā)現(xiàn)，一些內(nèi)生菌可以通過產(chǎn)生例如吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-乙腈等植物生長激素，或者獲取對植物有用的如氮、磷等營養(yǎng)元素的方式來促進宿主植物生長。例如，內(nèi)生真菌石斛小菇Mycena dendrobii通過分泌IAA而顯著促進天麻種子的萌發(fā)和生長［13］；內(nèi)生黏質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescensAL2-16可以通過固氮作用加強牛膝對氮素營養(yǎng)的利用［14］；人參內(nèi)生的藤黃微球菌Micrococcus luteus、巨大芽孢桿菌B. megaterium、賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus fusiformis都可以通過產(chǎn)生高濃度IAA、鐵鰲合載體以及溶解磷酸鹽的方式實現(xiàn)植物促生作用［15］。此外，內(nèi)生菌對植物生長的其它好處還包括影響根系形態(tài)改變、增強磷酸鹽溶解活性、提高植物對滲透脅迫的耐性以及氣孔調(diào)節(jié)等多種形式［15-16］。（2）增強宿主植物對生物和非生物脅迫的抗性。植物對外界環(huán)境的適應(yīng)主要依靠其次生代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，內(nèi)生菌可以產(chǎn)生不同的生物活性化合物，如生物堿、二萜、異黃酮、抗氧化劑等，幫助宿主植物抵御環(huán)境污染、提高抗病害能力。農(nóng)作物病蟲害是造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失最重要的原因之一，多項研究已證實內(nèi)生菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)與宿主植物抗病能力之間有密切相關(guān)性。例如，中藥當歸的內(nèi)生枯草芽孢桿菌B. subtilis可以產(chǎn)生苯五胺類的生物堿，對抗病原真菌尖孢鐮刀霉F. oxysporum和索蘭尼鐮刀霉F. Solani對植株的侵染［17］；銀杏內(nèi)生的解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens可以通過產(chǎn)生抗生素并誘導系統(tǒng)抗性的方式間接抑制植物枯萎病的發(fā)生［18］。此外，在例如干旱、高鹽的非生物脅迫環(huán)境下，藥用植物甘草內(nèi)生的短小芽孢桿菌B. pumilus能夠通過提高抗氧化物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，以及調(diào)節(jié)碳氮代謝酶活性的形式提高植株抗性，從而減輕干旱缺水環(huán)境對植物細胞造成的損傷［19］。（3）促進藥用植物中生物活性化合物的積累。越來越多的研究表明，一些內(nèi)生菌可以促進宿主植物產(chǎn)生不同種類的次生代謝產(chǎn)物。例如紫杉醇、青蒿素、喜樹堿、大黃素等都是知名的天然藥物。雖然著名抗癌化合物紫杉醇最早是在短葉紅豆杉中內(nèi)生的安德氏紫杉霉Taxomyces andreanae中發(fā)現(xiàn)的，但實際上，目前已知定殖在其它植物中的內(nèi)生泊爾盤端角菌Seimatoantlerium nepalense、金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae、瘤座菌Tuberculariasp.等也能合成紫杉醇［20］。

普遍的觀點認為，在長期的共生和協(xié)同進化過程中，內(nèi)生菌與宿主植物之間通過一種特殊的微生物-植物相互作用而建立了互惠互利的關(guān)系。內(nèi)生菌具有同宿主極為相似或相同的生物學特性，可以完成各種信號的傳遞以及物質(zhì)、信息的交流，從而誘導植物生長、增強抗病能力、積累活性成分，其中某些產(chǎn)物還可以作為有益的藥物供人類使用。因此，與未感染植株相比，內(nèi)生菌的存在使宿主植物更具有生存競爭能力，而內(nèi)生菌與藥用植物之間的相互關(guān)系也會對天然藥物的生產(chǎn)造成一定影響。

2 內(nèi)生菌影響藥用植物產(chǎn)生藥理活性化合物的機制

隨著對植物和內(nèi)生菌互作研究的深入，幾乎所有被調(diào)查的植物中都證實了內(nèi)生菌可以深入?yún)⑴c宿主植物的生理或代謝過程。因此，植物被認為是包含內(nèi)部微生物的“共生功能體”。雖然內(nèi)生菌與宿主互作介導次生代謝產(chǎn)物積累的分子機制還有待進一步研究，但是通過對多種藥用植物產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌和植物的聯(lián)合代謝對這些天然化合物的產(chǎn)生有重要影響。這種聯(lián)合代謝有些是在植物和微生物酶類聯(lián)合催化作用下的產(chǎn)物，有些是微生物基因表達的產(chǎn)物在植物體內(nèi)受植物生理環(huán)境影響而導致合成量增加或生成新的化合物，有些則是宿主植物受內(nèi)生菌刺激后啟動合成了新的次生代謝物［21］。

2.1 內(nèi)生菌直接合成植物中的藥理活性化合物

目前，已報道了紫杉醇（抗腫瘤）、喜樹堿（抗腫瘤）、辛可寧（抗瘧疾）、鬼臼毒素（抗皰疹病毒）等90多種植物來源的藥理活性化合物可由內(nèi)生菌代謝產(chǎn)生。雖然關(guān)于內(nèi)生菌與宿主植物之間共同進化機制的許多方面仍不十分清楚。但有觀點認為，內(nèi)生菌可以合成與宿主相似或相同的“模擬次生代謝產(chǎn)物”，實際上介導這些“共享”代謝物合成的功能基因可能原本就是內(nèi)生菌來源的，只是已通過長期的共同進化過程轉(zhuǎn)移到了植物體中［22］。也就是說，內(nèi)生菌可以直接合成藥理活性化合物，成為宿主植物的藥效活性成分，或者其合成的次生代謝產(chǎn)物作為前體物再通過宿主植物的合成酶系催化生成活性成分，通過植物吸收調(diào)控，進而影響宿主的次生代謝積累［23］。

例如，東北紅豆杉中分離的內(nèi)生黑曲霉A. niger在體外培養(yǎng)時可以產(chǎn)生抗癌物質(zhì)紫杉醇，RT-PCR檢測及基因測序發(fā)現(xiàn)，該菌株中存在的紫杉醇合成相關(guān)酶GGPPS與來自宿主植物的該酶基因同源性達到98%［24］。分離自石杉屬植物千層塔中的內(nèi)生真菌膠孢炭疽菌Colletotrichum gloesporioides可以產(chǎn)生藥效活性成分石杉堿甲（Hup A），經(jīng)基因組測序和轉(zhuǎn)錄組分析可知，該菌株的聚酮合酶相關(guān)基因CgPKS-03512對Hup A的積累有重要作用［25］。鏈格孢菌Alternariasp. MGI是一種從梅洛葡萄中分離出來的內(nèi)生真菌，它可以以葡萄糖為底物代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)白藜蘆醇，研究者采用轉(zhuǎn)錄組測序解析了從葡萄糖到白藜蘆醇的生物合成過程包括糖酵解、苯丙氨酸合成、苯丙素合成和二苯乙烯類合成途徑，從基因水平上明確了該菌株合成白藜蘆醇的能力［26］。值得注意的是，同樣的化合物在內(nèi)生菌和宿主植物中的生物合成途徑可能是完全不同的。據(jù)報道，赤霉酸的生物合成中，內(nèi)生真菌藤倉赤霉Gibberella fujikuroiIMI 58289是通過甲戊酸途徑由乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化生成赤霉酸，但在宿主植物中赤霉酸主要由甲基磷酸赤蘚糖醇途徑產(chǎn)生［27］。類似的，在內(nèi)生菌構(gòu)巢曲霉A. nidulans中發(fā)現(xiàn)的紫杉醇合成途徑也與已報道的植物紅豆杉中的紫杉醇合成途徑同源性較低，說明該菌株的紫杉醇合成能力可能是獨立于植物進化而來的。實際上，某些內(nèi)生菌活性代謝物的生成還必須依賴宿主植物。例如，分離自喜樹樹皮內(nèi)的一株能產(chǎn)生喜樹堿的腐皮鐮刀霉F.solani，在體外培養(yǎng)條件下其喜樹堿的產(chǎn)生能力逐漸減低。研究發(fā)現(xiàn)，該菌能夠自行合成喜樹堿的前體物，隨后要在宿主植物提供的異胡豆苷合成酶作用下才能進一步合成藥用成分喜樹堿［28］。更為典型的例子是研究較多的禾草植物香柱菌屬Epichlo?sp.內(nèi)生真菌，雖然其含有完整的麥角纈氨、黑麥草堿類和震顫素類化合物的合成基因，但是只有定殖在植物體內(nèi)的環(huán)境后才能啟動真菌中這些化合物相關(guān)基因的表達［21］。

據(jù)報道，美國每年生產(chǎn)的15-30種新藥中，約75%的候選藥物來源是由微生物而不是植物主導合成的［3］。因此，藥用植物中的內(nèi)生菌是植物來源的藥理活性化合物生成的重要影響因素，在天然藥物生產(chǎn)中的重要性有時可能大于藥用植物本身，這一發(fā)現(xiàn)可以為篩選有效的合成藥物提供新的思路。

2.2 內(nèi)生菌選擇性催化植物代謝物產(chǎn)生藥理活性化合物

內(nèi)生菌介導藥用植物藥理活性化合物生成的另一主要途徑是通過生物轉(zhuǎn)化作用對宿主化合物產(chǎn)生影響，這一過程主要是通過內(nèi)生菌產(chǎn)生的胞內(nèi)或者胞外酶的作用，將植物代謝物轉(zhuǎn)化為新的活性物質(zhì)或者提高植物次生代謝物的含量。例如，尖孢鐮刀菌F. oxysporumATCC MYA 4623可以催化肼生成具有抗炎活性的新型化合物3-甲基-1，2，4-三唑并酞嗪［29］；來自黃芪的兩株內(nèi)生鏈格孢菌A.eureka20131E1BL1和新薩托菌Neosartorya hiratsukae20131E2AR1-1可以修飾環(huán)黃芪醇和黃芪醇，生成具有端粒酶抑制作用的新化合物，有望用于阿爾茲海默病和抗衰老治療中［30］。

總結(jié)近年來相關(guān)研究成果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化植物代謝物的研究熱點主要集中在高效菌株篩選、轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化、產(chǎn)物活性分析領(lǐng)域，目前已明確的轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型主要包括：（1）催化O-糖苷鍵和O-醚鍵的合成。例如，虎杖內(nèi)生青霉Penicilliumsp. JQ228238可轉(zhuǎn)化白藜蘆醇生成紫檀芪，后者顯示出更強的藥物穩(wěn)定性和消炎、抗氧化活性［31］；黃芪內(nèi)生新薩托菌N. hiratsukae能將皂苷元轉(zhuǎn)化成新化合物皂苷元-O-吡喃葡萄糖苷，這是一種具有消炎、抗腫瘤活性的潛在新藥來源［32］；常見中藥板藍根的內(nèi)生黑曲霉A. niger可以去糖基化將相應(yīng)的糖苷前體轉(zhuǎn)化為黃酮糖苷配基，從而得到消炎殺菌活性更強的黃酮糖苷化合物［33］。（2）催化N-糖苷鍵和酰胺鍵的合成。例如，玉米內(nèi)生的輪枝鐮刀霉F. verticillioides可以催化氨基甲酸酯的N-糖苷鍵形成，從而合成有抗癌和抗氧化活性的藥物N-2-羥苯基丙二酸［34］。（3）氧化生成羥基、羰基和環(huán)氧基團。有報道證實，番瀉葉和積雪草中的4株內(nèi)生真菌草酸青霉P. oxalicum、尖孢鐮刀霉F. oxysporum、圍小從殼菌G. cingulata和深黃傘形霉Umbelopsis isabellinaFJ872076.1可以發(fā)生糖基化、二萜酮化和羥基化生成治療心律失常、心絞痛和高血壓的藥物普萘洛爾［35-37］；三七內(nèi)生的多節(jié)孢菌Nodulisporiumsp. JN254790能將人參皂苷Re的C-C雙鍵轉(zhuǎn)化為二羥基，生成具有抗血小板凝集活性的新藥化合物R13［38］。（4）催化氧化還原反應(yīng)。據(jù)報道，刺柏的內(nèi)生真菌煙曲霉A. fumigatesDSM 21023能夠高選擇性的氧化脫氧鬼臼毒素，生成抗病毒藥物鬼臼毒素［39］；菊科植物內(nèi)生的刺盤孢菌Colletotrichum gloeosporioides、皮落青霉P. crustosum和鐮刀菌Fusariumspp.都能氧化二酮哌嗪生成多種抗腫瘤的二酮哌嗪衍生物［40］。

據(jù)此，利用內(nèi)生菌特殊的生物催化活性，可以將植物來源的活性化合物以環(huán)境友好的方式轉(zhuǎn)化生成高質(zhì)量、高純度的天然藥物，不僅能降低天然產(chǎn)物的生物毒性、促進人體吸收利用，還能克服化學合成藥物的技術(shù)瓶頸，同時也有助于更好的解析藥物結(jié)構(gòu)-藥效活性之間的構(gòu)效關(guān)系。

2.3 內(nèi)生菌誘導植物體產(chǎn)生藥理活性化合物

研究發(fā)現(xiàn)，外部應(yīng)激刺激能觸發(fā)植物細胞復雜的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，最終導致次級代謝產(chǎn)物的合成和積累。最常見的應(yīng)激刺激包括各種誘導子或信號分子。內(nèi)生菌是藥用植物生長環(huán)境中的重要組成部分，可以通過誘導子效應(yīng)或橫向基因轉(zhuǎn)移等改變宿主植物的基因表達和代謝途徑，導致植物相關(guān)功能基因活性的變化，進而誘導某些具有藥理功能的次生代謝產(chǎn)物積累［23］。例如，有研究者發(fā)現(xiàn)適度的尖孢鐮刀霉F. oxysporum菌液誘導子能夠增加中藥鐵皮石斛原球莖中的Do-HDR基因表達量，從而促進其生物堿的合成［41］。著名中藥丹參種子的內(nèi)生真菌莖點霉P. herbarumD603可以刺激植物體內(nèi)與藥用成分丹參醌和丹參酚酸合成相關(guān)的功能基因CPS、DXS、HMGR等表達上調(diào)，從而促進植株中丹參酮的合成［42］。

植物細胞培養(yǎng)技術(shù)是目前研究植物次生代謝物合成的主流手段，而內(nèi)生菌誘導子的使用是提高植物細胞培養(yǎng)中有用次生代謝物產(chǎn)量最有效的方法之一。實驗發(fā)現(xiàn)，植物受到內(nèi)生菌誘導子脅迫時，激發(fā)植物體內(nèi)的細胞信號轉(zhuǎn)導通路先將信號傳遞給受脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，提高mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，進而誘導次生代謝物關(guān)鍵酶的表達。因此，完整的誘導合成途徑包括誘導子識別、信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄因子整合、基因表達和關(guān)鍵酶的激活4個水平。（1）識別誘導子。植物細胞受體識別誘導子是植物-內(nèi)生菌互作的第一步，可識別包括微生物產(chǎn)生的低聚糖、蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪酸成分。例如，殼聚糖是真菌細胞壁中主要的親水性聚合物，在內(nèi)生真菌與人參發(fā)根共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，加入殼聚糖、殼聚糖寡糖后，雖然植物根細胞生長受到抑制，但藥用成份人參皂苷的含量隨著內(nèi)生菌誘導子濃度的上升而顯著增加［43］。像這樣，位于植物細胞質(zhì)膜上的受體分子選擇性地、高度親和地結(jié)合真菌誘導子后，就將信息傳遞給了信號誘導子。（2）信號轉(zhuǎn)導。信號轉(zhuǎn)導是一個復雜的過程，各種信號都被整合到DNA轉(zhuǎn)錄因子中，隨后引發(fā)植物防御反應(yīng)和植物次生代謝途徑。常見的NO、SA（水楊酸）、ROS（活性氧）都是介導該過程的重要信號分子。在以往的研究中，通過對黃花蒿、白術(shù)、銀杏、葛根、黃芪、紅豆杉等多種藥用植物信號分子的研究發(fā)現(xiàn)，NO、H2O2、JA（茉莉酸酯）、Ca2+、cAMP、G蛋白、IP3（肌醇-1，4，5三磷酸）都與真菌誘導的藥用植物次生代謝途徑有關(guān)［44］，即通過這些不同的信號通路調(diào)控植物細胞核中相關(guān)基因表達，激活不同的植物次級代謝系統(tǒng)。例如，青蒿植物內(nèi)生的草酸青霉P. oxalicumB4能產(chǎn)生ROS調(diào)控青蒿素生物合成的關(guān)鍵基因紫穗槐二烯合酶和紫穗槐-4，11-二烯單加氧酶轉(zhuǎn)錄增加，進而合成有藥用功效的成分青蒿素［45］。藥用植物茅蒼術(shù)在內(nèi)生不動桿菌Acinetobactersp. ALEB16的誘導刺激下能產(chǎn)生脫落酸（ABA）和SA，作為信號分子可顯著提升倍半萜類生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，加速有藥理作用的蒼術(shù)揮發(fā)油類物質(zhì)的積累［46］，從而證實了內(nèi)生細菌誘導子通過ABA/SA信號途徑誘導蒼術(shù)揮發(fā)油合成的分子機制。（3）轉(zhuǎn)錄因子整合。轉(zhuǎn)錄因子是真核生物基因中與啟動子元件特異性結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白。轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控可以激活藥用植物中與次生代謝物合成有關(guān)的多種基因協(xié)同表達。例如，長春花中與萜類化合物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CrWEKY1屬于WRKY家族，負責調(diào)控萜類吲哚生物堿合成途徑中的幾個關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子［47］。遺憾的是，目前對藥用植物中真菌誘導植物次生代謝物積累時，轉(zhuǎn)錄因子和各種信號分子之間的關(guān)系研究相對較少。（4）基因表達。轉(zhuǎn)錄因子通過不同的方式調(diào)控植物基因表達，包括增加參與次級代謝物合成的關(guān)鍵酶的數(shù)量，誘導新的酶合成并激活新的代謝途徑，從而有利于植物次級代謝產(chǎn)物的合成。例如，大花紅景天中內(nèi)生的瓶頭霉菌Phialocephalasp.能激活關(guān)鍵酶PAL和CA4H基因的表達，從而促進藥用成分酪醇和紅景天苷含量積累［48］。從罌粟果實中分離的內(nèi)生大理石雕菌Marmoricolasp.和不動桿菌Acinetobactersp.與宿主植物共培養(yǎng)，可以誘導合成嗎啡的關(guān)鍵酶基因COR的表達，最終提高罌粟中的嗎啡產(chǎn)量［49］。

綜上所述，某些活性化合物的合成基因主要存在于植物細胞中，在生物或非生物誘導子的脅迫下開始誘導合成，且多數(shù)研究者認為，與其他因素相比，內(nèi)生微生物在誘導藥用植物藥效成分積累中的作用更加顯著。因此，內(nèi)生菌誘導子的發(fā)現(xiàn)可以為植物次生代謝產(chǎn)物的研究提供思路，促進對來自藥用植物的天然藥物的開發(fā)和利用。

3 內(nèi)生菌參與合成的藥理活性化合物

內(nèi)生菌是植物內(nèi)部的“化學合成器”。據(jù)報道，藥用植物內(nèi)生菌參與合成的眾多藥理活性化合物，如紫杉醇、鬼臼毒素、長春花堿、金絲桃素等可用于多種人類疾病的臨床治療。按照已知化合物藥理活性的差異，主要分為以下幾類。

3.1 抗微生物活性化合物

2020年5月，世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界動物衛(wèi)生組織召開會議，將“抗菌藥物”名稱改為“抗微生物藥物”，主要包括殺死或抑制其它微生物生長的任何天然或人工制劑［50］。已報道的植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗微生物活性化合物具有結(jié)構(gòu)多樣性特征，包括生物堿、肽、類固醇、萜類、酚類、奎寧和黃酮類。根據(jù)其生物活性，分為抗細菌、抗真菌和抗寄生蟲類化合物。例如，從蒙古蒿莖中分離的刺盤孢屬內(nèi)生菌Colletotrichum gloeosporioides，可以合成對枯草芽孢桿菌B. subtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、藤黃八疊球菌Sarcina lutea和假單胞菌Pseudomonassp.有抑菌活性的炭疽菌酸［51］；藥用植物雷公藤中分離的內(nèi)生真菌櫟樹擬隱孢殼Cryptosporiopsis quercina，可以產(chǎn)生一種新型環(huán)肽抗生素，對皮膚病原真菌毛蘚菌Trichophytonsp.和白色念珠菌Canddida albicans有明顯抑菌活性；澳洲藥用植物蛇藤中分離到的內(nèi)生鏈霉菌StreptomycesNRRL 30562能產(chǎn)生多肽型廣譜抗生素Munumbicins A、B、C和D，可用于控制結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis、炭疽桿菌B. anthraci和惡性瘧原蟲的感染［52］。

眾所周知，在目前的臨床治療中，抗生素耐藥性的發(fā)展已成為威脅人類健康的重要因素。除了合理規(guī)范的使用抗生素，尋找新的抗微生物藥物無疑是解決該問題的重要舉措。而某些藥用植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生新型、高效的多種抗微生物活性化合物，尤其是抗耐藥微生物的活性代謝產(chǎn)物，有望成為替代傳統(tǒng)抗生素的天然抗微生物藥物的重要來源。

3.2 抗病毒活性化合物

病毒感染也是誘發(fā)人類疾病和導致死亡的主要原因。近年來，由內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗病毒化合物已有報道。例如，藥用植物烏頭內(nèi)生黑孢霉Nigrosporasp.的代謝產(chǎn)物羥基蒽醌衍生物、6-O-脫甲基-4-脫羥基異色酮醇A和8，11-二脫氫美新酮B對流感毒株H1N1表現(xiàn)出很強的抗病毒活性［53］；從埃及藥用植物中分離的內(nèi)生格孢腔菌P. tarda可以產(chǎn)生兩種活性化合物交鏈孢菌醇和交鏈孢菌醇-9-甲基醚，分別對單純皰疹病毒（HSV-2）和水泡性口炎病毒（VSV）顯示40.7%和15.2%的抑制活性［54］。

藥物研發(fā)中，理想的抗病毒藥物應(yīng)對目標毒株有效，但對人體細胞副作用最小。迄今為止，已有100多種從沙漠植物中分離出來的內(nèi)生菌株被證實具有對抗I型人免疫缺陷病毒（HIV-I）的活性，且這些內(nèi)生菌的提取物對人體免疫細胞——T淋巴細胞的毒性小于30%。因此，內(nèi)生菌的此類活性代謝物可以作為研發(fā)新的抗病毒藥物或抗病毒先導化合物的重要來源。

3.3 抗癌活性化合物

作為人類高發(fā)性和高死亡性疾病，癌癥一直都是醫(yī)學研究的熱點，科研工作者們也在致力于研制和尋找新型抗癌藥物。自從發(fā)現(xiàn)短葉紅豆杉樹皮中分離的內(nèi)生真菌安德氏紫杉霉T. andreanae可以合成抗癌物質(zhì)紫杉醇以來，利用植物內(nèi)生菌篩選新型抗癌藥物受到了科學界的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生菌來源的抗癌活性化合物包括生物堿、聚酮、縮酚肽、色酮、醛、醌、酯、木脂素、環(huán)己酮、二萜等多種結(jié)構(gòu)。例如，從銀杏內(nèi)生真菌球毛殼菌Chaetomium globosum中提取了3種新型化合物氮雜環(huán)酮生物堿，均對人癌細胞株HePG2表現(xiàn)出較高的細胞毒活性［55］；某些紅樹植物內(nèi)生的曲霉屬Aspergillussp.真菌可以合成主要由植物合成的苯丙烷類化合物，在癌細胞中，該類化合物可以防止組蛋白脫乙酰酶（HDAC）的過度表達，從而抑制細胞周期并誘導癌細胞凋亡［56］。此外，內(nèi)生菌合成的某些活性化合物還可以作為抗癌藥物生產(chǎn)的前體物質(zhì)。例如，喜樹中天然產(chǎn)生的生物堿類化合物——喜樹堿并不溶于水，但可以人工轉(zhuǎn)化為水溶性衍生物伊立替康和拓撲替康，分別用作治療結(jié)直腸癌和卵巢癌的臨床藥物［57］；鬼臼毒素是一種木脂素型化合物，最早在19世紀80年代就從盾葉鬼臼中提取，目前發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)生尖孢鐮刀菌F. oxysporum、煙曲霉A. fumigatus、木霉Trichodermasp.、青霉Penicilliumsp.等也可以產(chǎn)生鬼臼毒素，其衍生物依托泊苷和替尼泊苷是目前已在市場上銷售的用于抗癌治療的化療藥物［58］。

3.4 抗氧化活性化合物

細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能導致人體細胞受損，進而誘發(fā)多種慢性疾病。內(nèi)生菌來源的多種活性化合物都具有清除ROS和超氧自由基的抗氧化特性。最常見的抗氧化劑是多酚類化合物，除此之外，植物和微生物產(chǎn)生的多糖成分也是天然的抗氧化物質(zhì)。例如，貝母內(nèi)生鐮刀菌Fusariumsp.在體外培養(yǎng)中可以產(chǎn)生根皮苷、蘆丁和沒食子酸等化合物，都具有極好的抗氧化能力［59］；榆葉梧桐內(nèi)生的尖孢鐮刀菌F. oxysporum可以產(chǎn)生3種多糖，即胞外多糖（EPS）、菌絲水提多糖（WPS）和NaOH提取的菌絲多糖（SPS），也都顯示出較強的抗氧化能力［60］。實際上，大量研究證實，具有抗氧化活性的化合物通常也可能具有抗腫瘤、抗誘變和抗炎活性。因此，植物內(nèi)生菌作為抗氧化化合物的重要天然來源，在針對癌癥和其他氧化損傷相關(guān)疾病的化學保護中可發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.5 免疫調(diào)節(jié)活性化合物

免疫抑制藥物通常用于治療自身免疫性疾病，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、異體移植排斥等。為了克服現(xiàn)有臨床藥物副作用大等缺點，尋找內(nèi)生菌來源的免疫抑制劑可能是有效的替代方法。據(jù)報道，在白茯苓葉中內(nèi)生的球腔菌Mycosphaerella nawaeZJLQ129可以產(chǎn)生二苯并呋喃化合物，隨后，其酰胺衍生物可以通過抑制T細胞表面抗原，如分化簇（CD69、CD25）和細胞因子（白介素-2、干擾素-γ）活性來抑制T細胞增殖，從而發(fā)揮免疫抑制活性［61］。另一方面，免疫調(diào)節(jié)化合物可以通過激活身體免疫反應(yīng)來治療免疫系統(tǒng)疾病。例如，從藥用植物雷公藤的內(nèi)生真菌擬盤多毛孢Pestalotiopsisspp.中，分離得到3個具有免疫調(diào)節(jié)作用的活性化合物YS、GS和BS，其中，BS通過調(diào)節(jié)外周血單核細胞和可溶性IL-2受體表達來顯示免疫抑制活性，抑制各種細胞因子、腫瘤壞死因子和干擾素的產(chǎn)生［52］。

3.6 抗糖尿病活性化合物

糖尿病是一種由于血糖水平升高而引起的代謝疾病。目前臨床所用的抗糖藥物多會引起腹瀉等各種副作用。植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生具有抗糖活性的代謝物，有助于降低血糖水平。例如，印度蘿芙木莖葉組織中的內(nèi)生鏈霉菌Streptomycessp.可以產(chǎn)生淀粉酶抑制劑，作為抗糖藥物使用。另外，α-糖苷酶抑制劑可以通過充當糖類水解酶來減少消化器官對葡萄糖的吸收。比如，從櫟樹內(nèi)生菌Xylariaceaesp. QGS 01中提取的抗糖化合物8-羥基-6，7-二甲氧基-3-甲基異香豆素，根據(jù)抗糖尿病實驗結(jié)果顯示，該化合物具有抑制釀酒酵母α-葡萄糖苷酶的潛力［62］。

3.7 抗心血管疾病活性化合物

心血管疾?。–VD）是世界范圍內(nèi)日益增長的主要致死原因之一，傳統(tǒng)治療方法已經(jīng)很難取得突破，這促使人們從更多來源中去發(fā)現(xiàn)新的有效藥物。目前臨床使用的他汀類藥物通過降低血液中的膽固醇水平，減少中風和心血管疾病的發(fā)生，主要包括洛伐他汀和美伐他汀兩類。洛伐他汀是一種聚酮代謝物，主要抑制參與膽固醇合成的HMG-CoA還原酶水平，其主要由多種內(nèi)生真菌產(chǎn)生，包括黃曲霉A.flavus、黑曲霉A. niger、綠色木霉T. viride、紅曲霉Monascussp.、青霉Penicilliumsp.等。另一種降脂藥物普伐他汀是由內(nèi)生真菌土曲霉A. terreus產(chǎn)生，能抑制血管緊張素對NADPH氧化酶的刺激活性，從而防止超氧化物自由基的生成。

4 展望

植物內(nèi)生菌是一類重要的生物資源。尤其在當前傳統(tǒng)藥物耐藥性增加、不斷出現(xiàn)新疾病的時代，藥用植物內(nèi)生菌成為生產(chǎn)天然藥理活性化合物的重要來源，具有無限的生物特性和應(yīng)用可能性，其重要性不僅在于植物中微生物的新穎性，而是微生物和宿主植物相互作用后產(chǎn)生的新的代謝產(chǎn)物，或者有利于產(chǎn)量顯著增加的代謝物才是更有價值的。因此，一方面可以利用內(nèi)生菌的優(yōu)勢，通過控制植物生長條件來生產(chǎn)更好的藥材。例如，在中藥種植中，可以向植物中添加特定的內(nèi)生菌群來促進植株生長、增加藥效成分，從而獲得更高質(zhì)量的原料藥材料。另一方面，從內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物中直接篩選具有藥用價值的活性物質(zhì)或新型化合物以創(chuàng)制新藥，解決自然資源不足的現(xiàn)狀，開發(fā)緊缺藥物，能在很大程度上豐富人類的藥物寶庫。因此，未來藥用植物內(nèi)生菌的研究應(yīng)綜合應(yīng)用高通量篩選、組合化學、分子系統(tǒng)學、分子生物學等技術(shù)手段，并重點在以下領(lǐng)域開展工作：（1）構(gòu)建生物工程反應(yīng)系統(tǒng)，在特定培養(yǎng)條件下利用選定的藥用植物與內(nèi)生菌互作，通過生物技術(shù)手段直接生產(chǎn)所需藥物并提高產(chǎn)量；（2）明確藥用植物有益內(nèi)生菌活性標準，更好地指導內(nèi)生菌株的分離篩選工作；（3）建立藥用植物內(nèi)生菌種資源庫，充分利用有益菌種開展藥用植物種植和培育、藥用植物資源保護工作，進一步提高天然藥物的質(zhì)量和產(chǎn)量。