短鏈脂肪酸在動(dòng)物樣本中的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉娜 焦京琳 饒正華

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），又稱揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA），是腸道內(nèi)未消化的復(fù)合碳水化合物被結(jié)腸厭氧微生物發(fā)酵的主要代謝終產(chǎn)物［1］。其由碳鏈為1-6的有機(jī)羧酸構(gòu)成，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸等，SCFAs可降低畜禽胃腸道內(nèi)容物的pH 值，抑制病原菌的生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)養(yǎng)分的吸收［2］。通常情況下，動(dòng)物的SCFAs來(lái)源有兩個(gè)方面，一是直接通過(guò)外源獲取，二是通過(guò)后腸微生物的發(fā)酵產(chǎn)生，后者也是動(dòng)物獲取SCFAs的主要方式［3］。SCFAs作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)瘤胃或腸道上皮細(xì)胞被吸收，為反芻動(dòng)物提供大部分代謝能量需求［4］。在瘤胃液內(nèi)的含量高達(dá)90-150 mmol/L，其中約80%的SCFAs在反芻動(dòng)物瘤胃和網(wǎng)胃內(nèi)被吸收，剩余的SCFAs主要在瓣胃和皺胃吸收［5］。對(duì)非反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)，SCFAs主要是膳食纖維通過(guò)微生物在結(jié)腸（豬）或盲腸（禽）發(fā)酵合成，是腸道上皮細(xì)胞的主要能量物質(zhì)，為其提供60%-70%的能量需求，是維持動(dòng)物腸道健康的重要物質(zhì)［6］。SCFAs可維持動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)腸道的消化吸收，激活腸道免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與凋亡，調(diào)節(jié)機(jī)體的脂質(zhì)代謝及糖代謝［7］。在動(dòng)物健康和飼料營(yíng)養(yǎng)研究中短鏈脂肪酸的濃度越來(lái)越受到關(guān)注，因此SCFAs的檢測(cè)方法凸顯尤為重要。

動(dòng)物樣本和人體樣本不盡相同。目前更多的檢測(cè)方法是應(yīng)用在人體糞便中，而關(guān)注動(dòng)物樣本檢測(cè)方法優(yōu)化的研究略少。SCFAs 是一類半衰期短、代謝快的揮發(fā)性化合物。不同的生物樣本中SCFAs的前處理方法不同，糞便中前處理常見(jiàn)有蒸餾法、高速離心法及超濾法等；常用檢測(cè)方法包括氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等。本文綜述了近幾年來(lái)不同動(dòng)物樣本中SCFAs 檢測(cè)主流的前處理和儀器分析方法，對(duì)比各方法的利弊，以期為SCFAs在動(dòng)物樣本中檢測(cè)提供理論參考。

1 前處理

1.1 不同動(dòng)物樣本前處理方法

1.1.1 動(dòng)物糞便樣本 由于腸道中SCFAs的組成與宿主腸道菌群直接關(guān)聯(lián)，所以動(dòng)物腸道菌群的研究中常常檢測(cè)動(dòng)物的糞便樣本［8-9］。SCFAs 具有自身極性大、揮發(fā)性強(qiáng)、水溶性大的特點(diǎn)使樣本快速處理尤為重要，常規(guī)的蒸餾、衍生化、萃取等方法耗時(shí)、耗有機(jī)試劑、污染大，因此在分離效果好的基礎(chǔ)上需要簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確且快速直接的前處理方法［10］。動(dòng)物糞便樣本的前處理方式較人體樣本相對(duì)簡(jiǎn)單。在養(yǎng)殖場(chǎng)采集新鮮糞便后用低溫轉(zhuǎn)運(yùn)箱運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)可備份樣品在-80℃下冷凍保存。一般動(dòng)物糞便樣本前處理包括提取和低溫高速離心，隨后取上清液過(guò)膜進(jìn)樣。提取時(shí)可以采用蒸餾水或鹽酸溶液，其中鹽酸可以用5%濃度［11］或0.1%濃度［12］等；蒸餾水可以與樣本量等體積［13-15］，可以8倍體積［16-17］等，然后超聲20 min。蔣愷憧等［1］比較了酸（鹽酸溶液，pH 2）提取法和水（滅菌去離子水）提取法對(duì)于犢牛和小鼠的新鮮糞便中SCFAs的測(cè)定，結(jié)果表明2種方法均可檢測(cè)到6 種SCFAs，且水提法的SCFAs 檢測(cè)濃度高于酸提法，但無(wú)顯著性差異。樣本提取后一般采用4℃高速（離心力10 000 ×g以上）離心至少10 min后取上清液待測(cè)。

1.1.2 動(dòng)物腸道樣本 乙酸、丙酸和丁酸在豬的結(jié)腸短鏈脂肪酸中占據(jù)85%甚至更高的比例［18-19］。動(dòng)物腸道內(nèi)SCFAs的濃度主要取決于動(dòng)物腸道內(nèi)微生物群組成、飼糧中纖維的含量、飼料在腸道內(nèi)的消化時(shí)間以及宿主與微生物的代謝通量。研究表明飼糧纖維水平可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物從而顯著影響宿主的腸道健康，而這一過(guò)程可能源于纖維在后腸發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs模式和濃度的差異［20］。不同纖維來(lái)源非淀粉多糖也會(huì)改變動(dòng)物腸道中短鏈脂肪酸的種類和數(shù)量。Pieper等［21］在仔豬日糧中添加了麥麩和甜菜堿，發(fā)現(xiàn)豬結(jié)腸中乙酸的比例從58%增至62.7%，丙酸比例從25.7%降至23%。因此，研究學(xué)者常常通過(guò)動(dòng)物腸道中短鏈脂肪酸的濃度變化來(lái)開(kāi)展飼料營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康方面的研究。

動(dòng)物腸道樣本在前處理過(guò)程中常用水提取。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)豬回腸食糜可以采用等體積雙蒸水提?。?2］，肉雞盲腸食糜可以用兩倍體積生理鹽水提?。?3］，肉兔盲腸內(nèi)容物采用蒸餾水稀釋10倍提?。?4］，白鵝盲腸（半固體狀）采用兩倍體積蒸餾水稀釋提?。?5］。提取后進(jìn)行低溫高速離心，再加入25%偏磷酸（也可以是25%偏磷酸-巴豆酸）溶液混勻，隨后可以-20℃冰箱中過(guò)夜，也可以在冰水浴中放置半小時(shí)以上，最后低溫高速離心去除蛋白質(zhì)沉淀物，取上清液過(guò)膜進(jìn)樣。

1.1.3 動(dòng)物瘤胃樣本 反芻動(dòng)物為復(fù)胃動(dòng)物，其中瘤胃是最大的胃，掌握反芻動(dòng)物瘤胃中短鏈脂肪酸濃度對(duì)監(jiān)測(cè)動(dòng)物身體狀況、調(diào)整營(yíng)養(yǎng)水平、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力等具有重要意義［26］。瘤胃液的采集一般是用胃管式瘤胃采樣器，采集后裝于凍存管中并迅速置入液氮罐中冷凍，再帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。研究學(xué)者在處理牛和羊的瘤胃液樣本時(shí)前處理操作相對(duì)簡(jiǎn)單。離心可以清除瘤胃液中的顆粒物，牛瘤胃液可以先低速（6 000×g）離心10 min后再取上清液繼續(xù)高速（14 000×g）離心10 min［27］，也可以直接高速（20 000×g）離心25 min取上清液［28］或16 100×g下離心30 min取上清液［29］。羊的瘤胃液同樣可以先低速（轉(zhuǎn)速5 400 r/min）離心10 min取上清液［30］。離心后的上清液均需要加25%偏磷酸混勻后再次低溫高速離心后取上清液待測(cè)［31-33］。目前瘤胃液中短鏈脂肪酸也有團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《T/NAIA 005-2020》可以參考，同樣用25%偏磷酸除去可溶性蛋白質(zhì)后10 000 r/min離心10 min后上清液過(guò)膜直接進(jìn)樣。

1.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

在短鏈脂肪酸含量測(cè)定時(shí)常使用內(nèi)標(biāo)化合物。用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定時(shí)需在樣品中加入一種物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)，而內(nèi)標(biāo)物應(yīng)符合以下條件：（1）應(yīng)是樣品中不存在的純物質(zhì)；（2）內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的色譜峰位置，應(yīng)位于被測(cè)組分色譜峰附近或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間，且與這些組分能完全分離；（3）其物理性質(zhì)及理化性質(zhì)應(yīng)與被測(cè)組分相近；（4）加入的量應(yīng)與被測(cè)組分含量接近［34-35］。因此根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的選擇原則并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室已有物質(zhì)，短鏈脂肪酸測(cè)定時(shí)可選用異己酸［27］、4-甲基戊酸［28］、巴豆酸及丙二酸［30］、2-乙基丁酸（2EB）［31-33］、2-甲基丁酸［36］等為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

1.3 同位素示蹤法

動(dòng)物大腸中發(fā)酵產(chǎn)生的部分短鏈脂肪酸在腸道被吸收，供機(jī)體利用，而未被吸收利用的則隨著大腸內(nèi)容物以糞便的形式排出體外［37］，因此有學(xué)者關(guān)注短鏈脂肪酸在動(dòng)物體內(nèi)的去向研究，常利用同位素示蹤法測(cè)定短鏈脂肪酸。同位素示蹤劑對(duì)動(dòng)物灌注常采用13C標(biāo)記。Markantonatos等［38］將13C-乙酸鈉鹽、13C-丙酸鈉鹽和13C-丁酸鈉鹽注入荷斯坦母牛瘤胃中進(jìn)行短鏈脂肪酸測(cè)定，瘤胃液前處理時(shí)同樣加入偏磷酸后低溫高速離心。張博等［37］利用［13C］-VFA（乙酸、丙酸、丁酸）穩(wěn)定性同位素灌注法，跟蹤豬大腸內(nèi)產(chǎn)生的VFA 的去向，前處理時(shí)將大腸腸道組織用液氮研磨，隨后用超純水溶解并稀釋，超聲提取，隨后高速離心取上清液待測(cè)。

1.4 衍生化法

衍生化是將一些難于分析檢測(cè)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定且易于分析的物質(zhì)。羧基的極性比較強(qiáng)，在氣相色譜柱中易產(chǎn)生吸附從而使結(jié)果的重現(xiàn)性差，尤其在濃度低（<1 mmol/L）時(shí)發(fā)生［39］。而在液相系統(tǒng)中短鏈脂肪酸又缺乏合適的發(fā)色基團(tuán)。因此短鏈脂肪酸檢測(cè)中常需要進(jìn)行柱前衍生化，主要是通過(guò)增加結(jié)構(gòu)中的發(fā)色基團(tuán)提高紫外檢測(cè)器等的響應(yīng)，或者是通過(guò)降低其揮發(fā)性避免分析過(guò)程中短鏈脂肪酸的逸失，使測(cè)定結(jié)果更加精準(zhǔn)［40］。羥基、羧基、胺、硫醇、磷酸鹽等官能團(tuán)在氣相色譜分析高溫環(huán)境下可能不穩(wěn)定，因此需要通過(guò)某些硅基化試劑進(jìn)行衍生化［41］。衍生化可以提高化合物穩(wěn)定性、靈敏度及分離度。常用的衍生試劑有吡啶［42］、氯甲酸丙酯［43］、硝基苯肼等［44］。對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的酸化也是短鏈脂肪酸測(cè)定中常用的方法，主要包括鹽酸、偏磷酸、甲酸、高氯酸等［45-48］，可以減少峰拖尾現(xiàn)象，也有利于脫蛋白，起到除雜質(zhì)和提高分離度的作用。同時(shí)短鏈脂肪酸為酸性化合物，在溶液中有離子型和游離型兩種狀態(tài)，加入偏磷酸可使短鏈脂肪酸處于游離態(tài)，有利于測(cè)定［49］。

2 儀器分析方法

2.1 氣相色譜

1952年首次報(bào)道了利用氣相色譜檢測(cè)短鏈脂肪酸［50］。目前利用氣相色譜分析短鏈脂肪酸也是最常見(jiàn)的技術(shù)手段之一，儀器可靠性高，操作簡(jiǎn)單。在色譜柱的選擇上，通常采用毛細(xì)管柱，利用相似相溶原則選擇合適固定相的色譜柱。常用的色譜柱有DB-FFAP［10，36］、Inter Cap Wax［1］、SH-Stabilwax［51］等。檢測(cè)器通常選用火焰離子化檢測(cè)器（FID）。FID是用氫氣在空氣中燃燒所產(chǎn)生的火焰使被測(cè)物質(zhì)離子化。氣相色譜檢測(cè)短鏈脂肪酸時(shí)需要設(shè)置升溫程序，一般采用分流進(jìn)樣。

對(duì)于反芻動(dòng)物瘤胃液成分雜質(zhì)較多，對(duì)儀器的進(jìn)樣口和色譜柱會(huì)造成一定程度污染，降低分析的準(zhǔn)確性，也縮短了色譜柱的使用壽命［52］。一些學(xué)者也利用頂空進(jìn)樣法對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中短鏈脂肪酸進(jìn)行測(cè)定［53-54］。王俊紅等［51］分析奶牛和湖羊的瘤胃液中短鏈脂肪酸時(shí)，利用頂空-氣相色譜法檢測(cè)，無(wú)需樣品前處理過(guò)程，稱取一定量樣品放入頂空瓶中，在85℃平衡預(yù)熱30 min后取平衡氣體直接進(jìn)行測(cè)定。頂空進(jìn)樣需要在氣相色譜上配備頂空進(jìn)樣裝置，節(jié)約了樣本前處理的時(shí)間，有效降低了樣品中雜質(zhì)對(duì)色譜柱的污染［55］。氣相色譜操作簡(jiǎn)單，前處理方法也無(wú)需衍生化，但儀器程序升溫需要單獨(dú)消耗時(shí)間，儀器運(yùn)行時(shí)間大約20 min，且靈敏度上不如質(zhì)譜聯(lián)用儀器高，適合動(dòng)物樣本中短鏈脂肪酸濃度高的樣品檢測(cè)。

2.2 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是在氣相色譜基礎(chǔ)上，樣品中各組分經(jīng)氣相色譜分離后，質(zhì)譜作為其檢測(cè)器，先將被測(cè)物質(zhì)離子化，根據(jù)離子的質(zhì)荷比進(jìn)行分離，測(cè)定各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的［56］。質(zhì)譜法較單純色譜法相比不光能定量，還能更準(zhǔn)確地對(duì)短鏈脂肪酸進(jìn)行定性，并有效減少干擾峰，且靈敏度也大大提升，同時(shí)氣質(zhì)儀器還有用相應(yīng)的質(zhì)譜譜庫(kù)。Douny等［57］利用GC-MS全掃模式，質(zhì)量范圍在40-150 Da下檢測(cè)豬體外模擬胃腸道模型中短鏈脂肪酸。Bianchi等［58］同樣用GC-MS全掃模式，質(zhì)量范圍在35-150 amu下檢測(cè)短鏈脂肪酸含量。氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀較氣相色譜在靈敏度上有所提升，而且有譜庫(kù)可以比對(duì)，沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品情況下也能對(duì)樣品中短鏈脂肪酸進(jìn)行定性，但前處理步驟也相對(duì)復(fù)雜，分析時(shí)間上同氣相一樣儀器基本也運(yùn)行20 min。

2.3 液相色譜

液相色譜原理是流動(dòng)相與檢測(cè)物被注入色譜柱，通過(guò)壓力在固定相中移動(dòng)，由于被測(cè)物中不同物質(zhì)與固定相的相互作用力不同，不同的物質(zhì)先后被洗脫，通過(guò)檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，最后通過(guò)分析比對(duì)這些信號(hào)來(lái)判斷待測(cè)物所含有的物質(zhì)。利用液相色譜檢測(cè)短鏈脂肪酸，常用紫外檢測(cè)器。但由于SCFAs的極性和揮發(fā)性，以及缺乏合適的發(fā)色團(tuán)，使得SCFAs的提取和在紫外檢測(cè)中有信號(hào)變得更加困難。一般需要用酸性流動(dòng)相且用硝基苯肼等衍生化。流動(dòng)相組成中水相可以用20 mmol/L NaH2PO4溶液（pH 2.2）［59］、高氯酸溶液（pH 2.1）［60］、磷酸溶液（pH 2.5）［61］等，有機(jī)相一般用乙腈溶液。檢測(cè)波長(zhǎng)可以選210 nm［59-60］或400 nm［61］。液相色譜檢測(cè)雖提升了靈敏度，但需要衍生化，增加了實(shí)驗(yàn)步驟，且強(qiáng)酸流動(dòng)需要注意維護(hù)色譜柱。

2.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

為了提高短鏈脂肪酸的靈敏度，科學(xué)家也開(kāi)發(fā)了利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法。短鏈脂肪酸類化合物在質(zhì)譜中響應(yīng)很低，且高親水性及極性特點(diǎn)導(dǎo)致其在反相色譜柱上保留很弱，因此常采用衍生化法進(jìn)行測(cè)定。離子源通常采用大氣壓電噴霧離子源（ESI源），掃描模式是ESI+［62］。流動(dòng)相中水相可以采用0.1%甲酸水［63］，10 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）［64］等；有機(jī)相選擇乙腈［65］，0.1%甲酸甲醇等溶液進(jìn)行梯度洗脫。研究表明衍生劑添加的官能團(tuán)可以通過(guò)在電噴霧離子源中更有效地電離，或在碰撞池中更容易地碰撞誘導(dǎo)解離，產(chǎn)生獨(dú)特和高度豐富的特征片段離子來(lái)潛在地提高靈敏度［64］。衍生化試劑可以選擇4-AMBA［63］，0.1 mol/L甲醇中丁基羥基茴香醚（BHA）溶液和甲醇中0.25 mol/L 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）［64］，d0/d6-鄰苯二甲酸二庚酯（d0/d6-DHPP）試劑等［65］。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜縮短了檢測(cè)時(shí)間，大大提高了靈敏度，同時(shí)能檢測(cè)多種脂肪酸，但同樣需要衍生化，需要購(gòu)買合適的衍生化試劑以完成檢測(cè)。

2.5 離子色譜

離子色譜是分析陰離子和陽(yáng)離子的一種液相色譜，它是利用物質(zhì)在離子交換柱上遷移的差異而達(dá)到分離，用于親水性陰陽(yáng)離子的測(cè)定。離子色譜的分離原理主要是離子交換，基于離子交換樹(shù)脂上可離解的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子之間進(jìn)行的可逆交換，不同離子因與交換劑的親和力不同而被分離，與液相色譜不用的是，離子色譜選擇性的改變主要是通過(guò)不同的固定相來(lái)實(shí)現(xiàn)的［56］。離子色譜可以識(shí)別以下陰離子：甲酸、醋酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、庚酸酯和辛酸酯［66］。樣品需要被氧化，產(chǎn)生的有機(jī)陰離子進(jìn)行收集?？梢圆捎貌煌瑵舛鹊牧蛩崛芤汉土蛩?丙酮溶液作為洗脫液［67］。Wu等［16］和Liu等［17］測(cè)定斷奶小豬消化物時(shí)均利用離子色譜檢測(cè)。離子色譜檢測(cè)時(shí)前處理過(guò)程中需要添加試劑以實(shí)現(xiàn)氧化，因此增加了前處理步驟。

3 總結(jié)與展望

短鏈脂肪酸是維持動(dòng)物腸道平衡的重要代謝產(chǎn)物，在動(dòng)物體內(nèi)能參與不同器官的代謝，因此其檢測(cè)方法尤為重要。動(dòng)物樣本涉及的基質(zhì)類型相對(duì)人體樣本多，其檢測(cè)前處理技術(shù)上普遍采用低溫高速離心后直接上樣。儀器方面主要應(yīng)用色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，各項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)各有利弊，根據(jù)樣品濃度高低的要求，以及實(shí)驗(yàn)室自身儀器裝備來(lái)選擇不同的檢測(cè)技術(shù)。由于短鏈脂肪酸類化合物具有極性大、揮發(fā)性強(qiáng)及水溶性大的特點(diǎn)增加了其檢測(cè)難度，因此為了提高檢測(cè)的靈敏度常采用衍生化的方法，根據(jù)使用儀器的不同需要采用不同的衍生化試劑。

未來(lái)短鏈脂肪酸在動(dòng)物樣本中檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)中，應(yīng)結(jié)合現(xiàn)在高分辨質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)，在不衍生化，盡量少前處理步驟的條件下進(jìn)行研發(fā)。目前高分辨質(zhì)譜技術(shù)崛起，具有高分辨率、高靈敏度和高準(zhǔn)確度的儀器為未來(lái)檢測(cè)帶來(lái)無(wú)限可能。