RP-HPLC測(cè)定復(fù)方雙嘧達(dá)莫乳膏中3種主要成分含量

董寧霞 李新新 滿(mǎn)玉清 高俊玲

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部 山東 濱州 256603

帶狀皰疹是由長(zhǎng)期潛伏在脊髓后根神經(jīng)節(jié)或顱神經(jīng)節(jié)內(nèi)的水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)經(jīng)再激活引起的感染性皮膚病，臨床表現(xiàn)為單側(cè)水泡疹并伴有神經(jīng)性疼痛，常發(fā)病于年齡較大、免疫抑制或缺陷的人群，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。

復(fù)方雙嘧達(dá)莫乳膏是一種復(fù)方外用乳膏制劑，可用于治療帶狀皰疹，療效顯著且不良反應(yīng)較小，其主要成分為雙嘧達(dá)莫、消旋山莨菪堿和鹽酸達(dá)克羅寧。該軟膏通過(guò)對(duì)三種主要成分的聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)揮軟膏的抗皰疹病毒、鎮(zhèn)痛消炎等藥理作用。為保證復(fù)方雙嘧達(dá)莫軟膏質(zhì)量的穩(wěn)定可控，本研究建立了雙嘧達(dá)莫、消旋山莨菪堿和鹽酸達(dá)克羅寧的含量測(cè)定方法，為該軟膏的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為含雙嘧達(dá)莫、消旋山莨菪堿或鹽酸達(dá)克羅寧等成分的藥品含量測(cè)定提供參考。

1 儀器與材料

島津LC-2010C HT(紫外檢測(cè)器)；InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，6 μm)；FA2204B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；AUW220D 型分析天平(日本島津)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

復(fù)方雙嘧達(dá)莫乳膏(自制，含雙嘧達(dá)莫5%、鹽酸達(dá)克羅寧0.5%、消旋山莨菪堿1%)；雙嘧達(dá)莫對(duì)照品、鹽酸達(dá)克羅寧對(duì)照品、消旋山莨菪堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為100244-201003、100423-201102、100249-201303)；甲醇為色譜純，磷酸、磷酸二氫鉀等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 復(fù)方雙嘧達(dá)莫乳膏含量測(cè)定的色譜條件見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方雙嘧達(dá)莫乳膏含量測(cè)定的色譜條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱(chēng)取雙嘧達(dá)莫對(duì)照品74.22 mg和鹽酸達(dá)克羅寧對(duì)照品7.26 mg，置于同一50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得雙嘧達(dá)莫和鹽酸達(dá)克羅寧混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱(chēng)取消旋山莨菪堿12.50 mg，放置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得消旋山莨菪堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取本品約0.4 g，加甲醇25 mL，超聲處理15 min(功率為200 W，頻率為44 kHz)，冰浴冷卻1 h，取出，迅速濾過(guò)，加甲醇定容到25 mL容量瓶中，作為供試品溶液，備用[3-4]。

2.2.3 空白樣品溶液 按照復(fù)方雙嘧達(dá)莫乳膏的處方工藝制備不含雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧、消旋山莨菪堿原料藥的空白樣品，稱(chēng)取約0.4 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備空白樣品溶液，備用。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液，稀釋雙嘧達(dá)莫濃度至742.2 μg/mL、鹽酸達(dá)克羅寧濃度至72.6 μg/mL、消旋山莨菪堿濃度至120.5 μg/mL，對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性考察[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，理論板數(shù)按雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧、左旋山莨菪堿、右旋山莨菪堿計(jì)，分別為10 904、12 286、8 104、8 231；雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧、左旋山莨菪堿、右旋山莨菪堿的拖尾因子分別是1.09、1.10、1.06、1.06，色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3%、1.6%、1.7%、1.6%，分離度均大于1.5，色譜系統(tǒng)適用性良好。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 準(zhǔn)確度 精密稱(chēng)取空白基質(zhì)約0.4 g，分別加入適量雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧、消旋山莨菪堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，攪拌均勻，制成含雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧、消旋山莨菪堿均為處方量100%的樣品，平行配制6份。按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定峰面積并計(jì)算回收率(表2～4)。

表2 雙嘧達(dá)莫含量測(cè)定的回收率(n=6)

表3 鹽酸達(dá)克羅寧含量測(cè)定的回收率(n=6)

表4 消旋山莨菪堿含量測(cè)定的回收率(n=6)

2.4.2 精密度 同一份雙嘧達(dá)莫乳膏，平行取樣6次，每次0.4 g，精密稱(chēng)定。按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧、消旋山莨菪堿含量測(cè)定的RSD(n=6)分別為1.8%、1.5%、1.8%，該測(cè)定方法的精密度良好。

2.4.3 線性與范圍 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的雙嘧達(dá)莫和鹽酸達(dá)克羅寧的混合對(duì)照品貯備液適量，添加流動(dòng)相稀釋?zhuān)苽湟幌盗芯€性關(guān)系工作液，使雙嘧達(dá)莫和鹽酸達(dá)克羅寧的濃度分別為247.4、494.8、989.6、1 237.0、1 484.4和24.2、48.4、96.8、121.0、145.2 μg/mL。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定峰面積。以峰面積y對(duì)進(jìn)樣濃度x進(jìn)行回歸處理，回歸方程、線性、范圍見(jiàn)表5。精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的消旋山莨菪堿對(duì)照品貯備液適量，添加流動(dòng)相稀釋?zhuān)苽湟幌盗芯€性關(guān)系工作液，使消旋山莨菪堿的濃度為50.0、62.5、125.0、187.5、250.0 μg/mL。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，峰面積按消旋山莨菪堿順、反式異構(gòu)體峰面積的和計(jì)算。以峰面積y對(duì)進(jìn)樣濃度x進(jìn)行回歸處理，回歸方程、線性、范圍見(jiàn)表5。

表5 復(fù)方雙嘧達(dá)莫乳膏含量測(cè)定的線性回歸方程

2.4.4 專(zhuān)屬性 分別取“2.2”項(xiàng)下的空白樣品溶液、供試品溶液、對(duì)照品儲(chǔ)備液各適量，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖1、2)。空白基質(zhì)及雜質(zhì)不干擾雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧、消旋山莨菪堿的含量測(cè)定。

A.空白樣品溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液。

A.空白樣品溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液。1.鹽酸達(dá)克羅寧；2.雙嘧達(dá)莫。

2.4.5 耐用性 本研究分別考察流動(dòng)相比例變化±5%、柱溫變化±5℃、被測(cè)溶液放置0～72 h、流速相對(duì)值變化±20%時(shí)，儀器色譜行為的變化。試驗(yàn)結(jié)果顯示：主峰與雜質(zhì)峰可達(dá)到基線分離，主峰的拖尾因子小于1.5，各條件下的峰面積測(cè)量值(n=5)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于2.0%。這表明，該色譜系統(tǒng)具有良好的耐用性。

2.5 含量測(cè)定 精密稱(chēng)取3個(gè)批次的復(fù)方雙嘧達(dá)莫乳膏，每份約0.4 g，分別按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算含量(表6)。

表6 復(fù)方雙嘧達(dá)莫乳膏含量(n=3)

3 討論

本研究的提取條件考察實(shí)驗(yàn)顯示，選擇超聲提取時(shí)間為15 min時(shí)，可保證乳膏樣品提取完全。但由于樣品經(jīng)超聲提取時(shí)已近乳化狀態(tài)，較難濾過(guò)，故將提取液冰浴1 h，可使提取液分層明顯，易于過(guò)濾，以便進(jìn)行下一步操作。

本研究用紫外分光光度計(jì)掃描各對(duì)照品溶液的全波長(zhǎng)吸收光譜，發(fā)現(xiàn)雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧在275～285 nm之間有最大吸收，而消旋山莨菪堿的最大吸收波長(zhǎng)在220 nm左右。對(duì)275～285 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行重點(diǎn)考察，結(jié)果表明，在280 nm波長(zhǎng)下，雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧的峰高相對(duì)較高，且噪聲小，故選擇280 nm作為雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧的檢測(cè)波長(zhǎng)，220 nm為消旋山莨菪堿的檢測(cè)波長(zhǎng)。

InterSustain C18色譜柱進(jìn)行了端基封尾，惰性較高，可改善離子型化合物的峰型，而且，由于是改性硅膠基體，pH使用范圍(1～10)較廣，可用100%水作為流動(dòng)相，有助于分離極性和親水性化合物，且更適于選擇含無(wú)機(jī)鹽緩沖溶液的流動(dòng)相系統(tǒng)。本研究選擇該色譜柱，能較好地滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求。

消旋山莨菪堿需在UV短波長(zhǎng)下進(jìn)行高靈敏度分析，為避免干擾，應(yīng)選擇不含有機(jī)酸類(lèi)的緩沖溶液。參考《中國(guó)藥典(2020年版 二部)》和相關(guān)文獻(xiàn)[6-10]，選擇甲醇和0.02 M磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)pH值至3.0)為流動(dòng)相，雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧、消旋山莨菪堿均能得到較好分離。

在本研究中，試驗(yàn)過(guò)雙波長(zhǎng)梯度洗脫法，設(shè)置不同時(shí)間段流動(dòng)相的比例，可同時(shí)將3種成分進(jìn)行分離，但是梯度洗脫耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，整個(gè)分離過(guò)程超過(guò)50 min，且四個(gè)主要色譜峰的峰形較寬、對(duì)稱(chēng)性差，最終采用本文中的方法，簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，實(shí)際操作性更強(qiáng)。

消旋山莨菪堿是左旋體和右旋體的混合物。建立的含量測(cè)定方法使左旋山莨菪堿和右旋山莨菪堿達(dá)到了完全分離，分離度大于1.5。兩個(gè)同分異構(gòu)體分別在13、19 min出峰。含量計(jì)算參照《中國(guó)藥典(2020年版 二部)》消旋山莨菪堿片含量測(cè)定項(xiàng)下方法，按外標(biāo)法以消旋山莨菪堿左旋體和右旋體峰面積的和進(jìn)行計(jì)算，準(zhǔn)確度和精密度均良好。

綜上所述，采用HPLC法測(cè)定雙嘧達(dá)莫乳膏中雙嘧達(dá)莫、鹽酸達(dá)克羅寧和消旋山莨菪堿的含量，分離度好，準(zhǔn)確度高，對(duì)其質(zhì)量控制和藥效評(píng)價(jià)具有重要意義。