血型正反定型不符和凝集減弱的原因分析及處理

劉玉敏 張 韋 邵曉琳

濱州市中心血站 山東 濱州 256602

ABO血型的表型是由正反定型兩者決定的，正定型檢測紅細胞抗原，反定型檢測血清或血漿中抗體。正反方向ABO血型抗原和抗體的同時檢測才能完成ABO血型的定型[1]。對于正反定型不一致的標本應當查找分析原因，加以解決。導致正反定型不一致的原因有技術(shù)問題和獻血者紅細胞或血漿本身問題。雖然獻血者均是健康個體，但部分獻血者因輸血史、妊娠史及其他原因?qū)е卵獫{中產(chǎn)生不規(guī)則抗體，自身紅細胞抗原或血漿抗體減弱，天然抗體的存在以及冷凝集等而致血型定型困難。對于正反定型不符的血液標本必須進一步鑒定，確定血型，分析其能否用于臨床或留做其它用途。本研究對144例ABO正反定型不符和/或凝集減弱血液標本原因及相關(guān)血液的處理進行回顧性分析，報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2016年1月至2020年9月在212 261名無償獻血者中共檢出正反定型檢測結(jié)果不一致和/或凝集程度減弱者144例。

1.2 儀器與試劑 抗-A、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗-S、抗-P1、A2細胞、人ABO 反定型用紅細胞(A1、B、O)和抗體篩查紅細胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及譜細胞等(試劑均由上海血液生物醫(yī)藥有限公司提供)。 離心機(KA-2200 日本久保田)、離心機(LDZ4-0.8 北京醫(yī)用離心機)、電熱恒溫水箱(37℃ 金壇瑞華)、電熱恒溫水箱 (56℃ 天津泰斯特)、試劑專用冰箱(2～8℃ 日本三洋)。

1.3 檢測方法

1.3.1 鹽水試管法ABO正反定型檢測 首先用生理鹽水對待檢測標本紅細胞進行3次洗滌，然后用鹽水介質(zhì)試管法作進一步確認，并做O細胞及自身細胞。正定型血型檢測根據(jù)實際情況加做抗AB和抗H。正常情況下正定型血型檢測標本其紅細胞與抗-A或抗-B凝集強度均不小于4+，反定型血漿與A型細胞或B型細胞凝集不小于2+，與O細胞及自身細胞均為不凝集。鹽水試管法ABO正反定型檢測方法見文獻[2]。若檢測結(jié)果無法對應時，將其放入4℃冰箱30 min后離心觀察結(jié)果，放置至室溫再次離心觀察結(jié)果。

1.3.2 吸收放散試驗、冷凝集素試驗、抗體篩查或抗體鑒定試驗(鹽水介質(zhì)抗體鑒定方法) 通過對照抗體鑒定譜細胞格局表對可疑抗體再用相應檢測試劑檢測該標本紅細胞上是否有相應抗原。具體檢測方法見文獻[2]。

1.3.2.1 吸收放散試驗 對于正定型單克隆抗A、抗B直接凝集試驗檢測不到抗原，甚至通過降低反應溫度或增加抗體強度仍檢測不到的弱抗原，而反定型檢出相應抗體的標本需做吸收放散試驗。檢測方法：取1 mL壓積紅細胞用生理鹽水洗滌至少3遍，最后1遍吸棄所有上清；加入1 mL抗血清(懷疑A亞型者加抗A試劑，懷疑B亞型者加抗B試劑)；混勻紅細胞和抗體試劑放入4℃冰箱1 h，期間每隔10 min混勻一次，同時將備用生理鹽水放入4℃冰箱；1 h后離心混合物，徹底移除上清試劑后將紅細胞轉(zhuǎn)移至10 mL干凈試管，用4℃鹽水洗滌8遍，將末次洗滌液分裝到新試管中(與放散液做平行試驗用)；紅細胞中加入等容積生理鹽水，置56℃水浴箱中10 min，孵育期間定時輕輕振搖試管，以便使吸附在紅細胞上的抗體充分放散；立刻用(900～1 000)×g離心2 min，立即分離上清放散液于一干凈試管；和末次洗滌液做平行試驗。分別與3個O細胞和3個A1細胞或B細胞反應(根據(jù)吸收試驗所加抗體試劑選擇合適的A1細胞或B細胞)。試管上均用記號筆做好標記，兩組試管中分別加入放散液和末次洗滌液2滴，相應紅細胞試劑1滴，立即離心觀察結(jié)果；若沒觀察到凝集，放4℃冰箱30 min后取出立即離心觀察凝集。結(jié)果有效性判定：末次洗滌液與所有6個細胞均不發(fā)生反應；放散液與所有3個O細胞不發(fā)生反應；放散液與相應抗原紅細胞發(fā)生反應。在試驗有效的前提下，放散液與相應紅細胞試劑有反應則證明放散液中有抗A或抗B,說明待檢測標本紅細胞上有A或B抗原表達。用A1、B或O平行進行吸收放散試驗，作為該試驗的陽性或陰性對照。

1.3.2.2 冷凝集素試驗 當正定血型為A型、B型或AB型而反定血型與同型紅細胞試劑有凝集或弱凝集時均做冷凝集素試驗，同時檢測冷凝集素滴度。取4支試管，用記號筆做好標記(滴加A試劑紅細胞的標為Ac；滴加B試劑細胞的標為Bc；滴加O試劑紅細胞的標為Oc；滴加經(jīng)過生理鹽水三洗后的自身細胞標為自c)。每管中加待檢測血漿2滴，再在做好標記的試管中加入相應紅細胞1滴,第一步立即離心觀察凝集情況；第二步放入4℃冰箱30 min,取出立即離心觀察結(jié)果；第三步室溫放置約30 min,觀察凝集現(xiàn)象是否消失；第四步室溫下凝集未消失的再放入37℃水浴箱觀察凝集現(xiàn)象。對于冷凝集強度較高的標本進行倍比稀釋，操作如下：取10支試管，分別標記為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，于每管中加入100 μL生理鹽水；于第1管中加入100 μL待檢測標本血漿,徹底混勻；然后從第1管中取100 μL混勻樣本加入第2管，再徹底混勻；依次操作至第10管，第10管徹底混勻后棄去100 μL,每管中加入相應的紅細胞置4℃冰箱30 min后立即離心觀察凝集現(xiàn)象.以肉眼可見的有明顯凝集的最后一管的滴度定為該標本的冷凝集滴度。

2 結(jié)果

144例送檢標本中，ABO正反定型不符者112例，占比為77.78 %。正反定型相符但凝集程度減弱者32例，占比為 22.22%(表1、2)。

表1 112例正反定型不符原因

表2 32例正反定型相符凝集程度減弱原因

為保證輸血安全有效，檢出不規(guī)則抗體的血液其紅細胞制備成洗滌紅細胞(效期同去白懸浮紅細胞)發(fā)往臨床共計133.5單位(200 mL全血制備的洗滌紅細胞為1單位；300 mL全血制備的洗滌紅細胞為1.5單位；400 mL全血制備的洗滌紅細胞為2單位)。正常發(fā)往臨床：去白懸浮紅細胞為107.5單位；新鮮冰凍血漿為4 400 mL；病毒滅活血漿為6 050 mL；冰凍血漿為200 mL。質(zhì)量控制檢測用：去白懸浮紅細胞為10.5單位；新鮮冰凍血漿為5 600 mL；病毒滅活血漿為7 600 mL；冰凍血漿為800 mL；冷沉淀為3單位。報廢處理：去白懸浮紅細胞為5.5單位；新鮮冰凍血漿為400 mL；病毒滅活血漿為160 mL。

3 討論

212 261例無償獻血檢測標本中,檢驗科不能正確定型者144例，但血型室通過鑒定共有112例ABO正反定型不符，約占0.05%，明顯高于李革飛[3]報道的0.02%，低于劉二雄[4]報道的獻血者ABO正反不符陽性率0.131%；其余32例可能因?qū)嶒炇覘l件差異，不足以判定為正反定型不符。

112例ABO正反定型不符標本中用鹽水介質(zhì)抗體鑒定法共有101例檢出不規(guī)則抗體，占無償獻血檢測標本的0.048%，略高于蔡茵報道的無償獻血者中不規(guī)則抗體鹽水介質(zhì)反應性確證陽性數(shù)0.031%[5]，明顯低于相關(guān)報道在正常人體內(nèi)不規(guī)則抗體檢出率0.2%～2.5%[6]，這與本次研究只采用鹽水介質(zhì)中凝集紅細胞，以 IgM 類抗體居多，而大多數(shù)IgG類抗體不能檢出有關(guān)。不規(guī)則抗體是導致正反定型不符的主要原因(101/112，占比90.18%)。其中抗-M41例(36.61%)，明顯高于劉二雄[4]報道的26.1%，這可能與研究區(qū)域有關(guān)。人血清抗-M抗體相對來說是比較常見的自然發(fā)生的抗體。4例自身冷抗體，室溫有活性，37℃無活性，效價小于16；22例室溫無活性未確定特異性冷凝集素抗體，其原因分析為檢測方法及不同實驗室溫度條件有關(guān)。8例抗A或抗B抗體減弱標本中以抗-B減弱居多占75%，抗A減弱占25%。

ABO亞型也是導致正反定型不符的其一原因。ABO亞型雖然少見，但它會嚴重影響輸血的安全性和有效性[7]。ABO亞型主要是經(jīng)血型血清學試驗以抗原性弱為主要特征的多種表型[1]，其共同特點是紅細胞上A或B抗原數(shù)量減少,正定型中紅細胞與抗A,抗B試劑的反應與正常A或B型紅細胞相比顯著減弱,有些甚至不凝集。某些ABO亞型血清中除了ABO天然抗體之外,還會產(chǎn)生抗A1(或抗B)[2]。對可疑標本進行鹽水試管法ABO正反定型檢測，依次在室溫、4℃ 30 min、恢復室溫后三種條件離心觀察判讀結(jié)果，同時加做抗A,B、抗H、O細胞及自身對照，根據(jù)需要做吸收放散試驗。根據(jù)ABO血型血清學試驗特點，按文獻[8]判定為亞型標準：共檢出26例ABO亞型：3例通過吸收放散試驗檢出相應抗原，但不伴有不規(guī)則抗A、B；23例為凝集減弱或混合視野:6例檢出不規(guī)則抗A、抗B,其中5例為抗-A1抗體5/6(83.33%)，實驗現(xiàn)象為室溫凝集較弱或不凝集，4℃加強，為冷反應抗體，1例抗-B抗體1/6(16.67%)，實驗現(xiàn)象為室溫凝集較弱。與許志遠等[7]報道的ABO亞型中分別檢出不規(guī)則抗-A占84.9%，抗-B占15.1%基本相符。據(jù)研究分析發(fā)現(xiàn)對于造成正反不符的亞型一般不會漏檢，但表現(xiàn)為正反定型相符，正定血型凝集程度減弱的容易造成亞型漏檢，這就對檢驗科血型檢測提出更高的要求。

不規(guī)則抗體陽性不僅導致血型鑒定困難，還會在交叉配血時致使次側(cè)配血不合。臨床在輸注非紅細胞制品如新鮮冰凍血漿、病毒滅活血漿、冷沉淀及冰凍血漿時均為同型輸注而不交叉配血。如將含有不規(guī)則抗體的血液輸注給患者時就有可能產(chǎn)生輸血反應。對這一類血液制品做如下處理：根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》質(zhì)量控制部分規(guī)定全血及成分血抽樣量為每月制備量的1%或至少4袋。為節(jié)約血液，ABO正反定型不符，血漿中檢出不規(guī)則抗體的非紅細胞制品用于質(zhì)量控制檢測血液質(zhì)量的其他指標，這與劉二雄報道的非紅細胞制品應廢棄[4]不同；紅細胞制品制備成洗滌紅細胞(效期同去白懸浮紅細胞)發(fā)往臨床，這一做法與劉二雄[4]報道的紅細胞三洗后可用于臨床相同。既避免了血液的浪費，又保證了血液的安全。ABO亞型血液通過吸收放散試驗檢出相應抗原的，對該血液進行報廢處理，并進行系統(tǒng)屏蔽停止獻血，有專門人員告知獻血者；對于僅表現(xiàn)為正定型凝集減弱或混合視野，血漿中未檢出不規(guī)則抗體的，該血液正常發(fā)往臨床；血漿中檢出不規(guī)則抗體的，該血液所有產(chǎn)品均做質(zhì)量控制檢測使用。室溫無活性的冷凝集素抗體血液正常發(fā)往臨床。為避免誤發(fā)往臨床，對以上所有不能直接發(fā)往臨床或用于質(zhì)量控制檢測用的血液產(chǎn)品均由專門人員將其詳細信息填寫《內(nèi)外溝通記錄》一式兩份交于下游科室。專門人員在記錄上簽字留檔，按要求將相關(guān)產(chǎn)品予以特殊標識進行洗滌或留做質(zhì)量控制檢測用，并進行物理性隔離。對于發(fā)往臨床的該類洗滌紅細胞，通過臨床跟蹤無一例發(fā)生輸血不良反應，臨床治療效果良好。

綜上所述，造成ABO正反定型不符的原因頗多，工作人員在實際操作中應該細心審慎，綜合分析研判，根據(jù)實際情況對相應血液做最佳處理，既確保臨床用血安全有效，又最大程度避免血液浪費。