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    化痰祛濕活血方對非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型肝細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

    2022-09-07 04:40:44劉素彤張麗慧顧亞嬌劉鳴昊趙晨露趙文霞
    臨床肝膽病雜志 2022年8期
    關(guān)鍵詞:脂滴內(nèi)脂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

    劉素彤, 張麗慧, 顧亞嬌, 劉鳴昊, 郭 敏, 趙晨露, 趙文霞

    河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科, 鄭州 450000

    隨著肥胖的流行和代謝綜合征(MetS)患病率的迅速增長,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為健康體檢肝臟生化指標(biāo)異常的首要原因[1]。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是臨床干預(yù)的關(guān)鍵節(jié)點,若此階段未加干預(yù),有進(jìn)展成肝纖維化、肝硬化的風(fēng)險。目前,尚無治療NASH的特效藥物?;奠顫窕钛绞侨珖嗅t(yī)趙文霞教授的經(jīng)驗方,其治療NASH臨床療效確切[2],前期動物實驗[3-5]表明,化痰祛濕活血方可降低NASH大鼠肝酶、調(diào)節(jié)脂代謝、提高肝臟抗氧化能力,抑制炎癥反應(yīng),防止肝細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡。但尚缺乏以線粒體超微結(jié)構(gòu)為切入點,探討其作用機制的研究。因此本研究將以高脂飼料誘導(dǎo)NASH大鼠模型,以臨床常用藥易善復(fù)為陽性對照藥。透射電鏡下觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),探索化痰祛濕活血方在亞細(xì)胞水平上的作用靶點。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 SD 雄性大鼠48只,SPF級,體質(zhì)量(150±10) g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物合格證號:11400700116588;許可證號:SXYK(豫) 2015-0005。

    1.2 實驗藥物 化痰祛濕活血方顆粒劑: 澤瀉,批號: 15120135; 丹參,批號: 15060138; 海藻,批號: 15070027; 郁金,批號: 15060128; 決明子,批號: 15090036; 山楂,批號: 15060020;柴胡,批號: 15070208;水飛薊,批號: 15070223; 由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供。多烯磷脂酰膽堿膠囊(易善復(fù)): 賽諾菲( 北京) 制藥有限公司,批號: 5JD070。

    1.3 主要試劑與儀器 高脂飼料: 普通飼料(84%)、豬油(10%) 、蛋黃粉(5%) 、膽固醇(1%) 。飼料由河南省實驗動物中心加工而成。透射電鏡(FEI,美國),倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯,日本)

    1.4 分組、造模及給藥 48只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,第2周分組并開始造模及給藥。大鼠隨機分為空白組,模型組,易善復(fù)組,化痰祛濕活血方組(簡稱中藥組),每組12只。空白組給予普通飼料,另外3組給予高脂飼料。依據(jù)人與動物劑量折算法:化痰祛濕活血方等效劑量為1.26 g/100 g體質(zhì)量,多烯磷脂酰膽堿膠囊(易善復(fù))等效劑量為0.014 18 g/100 g體質(zhì)量。模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液,易善復(fù)組灌胃多烯磷脂酰膽堿混懸液,中藥組給予灌胃化痰祛濕活血方顆粒混懸液,1次/d,連續(xù)10周。

    1.5 透射電子顯微鏡觀察各組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及定量分析 實驗步驟:灌胃10周結(jié)束后,用電子秤稱取鼠重,大鼠予10%水合氯醛麻醉,迅速取出各組肝組織,修成1 mm×1 mm×1 mm的小塊,置于4℃,2.5%的戊二醛固定,4℃、1%鋨酸后固定。以乙醇及丙酮脫水,環(huán)氧樹脂包埋,制成1 μm厚的半薄片,用鉆石刀切制成70 nm厚的超薄切片,鈾鉛染色后透射電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體形態(tài)數(shù)量及其他細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)。定量分析:采用國際上通用的細(xì)胞立體計量學(xué)點分析法,對實驗各組選擇2只動物,每只動物取3塊肝組織,每塊組織觀察5個細(xì)胞進(jìn)行定量測定,測定肝細(xì)胞內(nèi)脂滴和線粒體的指標(biāo)為體密度。

    2 結(jié)果

    2.1 化痰祛濕活血方對肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

    2.1.1 空白組表現(xiàn) 電鏡下可見大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞核較大居中,核膜完整,核仁清晰,胞內(nèi)有大量豐富的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高倍鏡下可見結(jié)構(gòu)清晰完整的線粒體及大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖1)。

    2.1.2 模型組表現(xiàn) 低倍鏡下可見模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴積累,占細(xì)胞面積1/2~2/3,部分肝細(xì)胞核被脂滴擠壓變形或擠向細(xì)胞邊緣。線粒體較正常組體積增大,脂滴與線粒體互相擠壓;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少。高倍鏡下可見線粒體周圍圍繞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯少于正常組,結(jié)構(gòu)不清晰;線粒體結(jié)構(gòu)被破壞,雙層膜模糊或消失,與胞質(zhì)分界不清晰;線粒體嵴排列紊亂或數(shù)量減少(圖2)。

    注:a,空白組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常(×5000),箭頭為脂滴;b,放大倍數(shù)后可見清晰完整線粒體及大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(×50 000),箭頭為線粒體。

    注:a,模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)大量脂滴積累(×2500),箭頭為脂滴;b, 放大倍數(shù)后可見線粒體結(jié)構(gòu)破壞、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少(×50 000), 箭頭為線粒體。圖2 電鏡下模型組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Figure 2 Ultrastructure of rat liver cells in model groupunder electron microscope

    2.1.3 中藥組表現(xiàn) 低倍鏡下可見細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積較模型組明顯減少,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組增多,且結(jié)構(gòu)較清晰。高倍鏡下可見線粒體形態(tài)明顯較模型組好轉(zhuǎn),雙層膜結(jié)構(gòu)較完整(圖3)。

    注:a,中藥組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少(×2500);b,放大倍數(shù)后可見線粒體膜較完整(×50 000),箭頭為線粒體。

    2.1.4 易善復(fù)組表現(xiàn) 低倍鏡下可見大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積,數(shù)量較模型組減少,占細(xì)胞面積1/3 以下;線粒體數(shù)量較模型組明顯增多,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少,線粒體結(jié)構(gòu)清晰。 高倍鏡下可見大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整,雙層膜清晰,線粒體嵴排列整齊,少數(shù)線粒體雙層膜破壞,或雙層膜結(jié)構(gòu)完整,但線粒體嵴被破壞(圖4)。

    2.2 化痰祛濕活血方對大鼠肝細(xì)胞線粒體影響的定量分析 與空白組相比,模型組脂滴面積明顯增多,線粒體減少,體密度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01) ;藥物干預(yù)后,易善復(fù)組脂滴面積減少、線粒體數(shù)目增多,與模型組體密度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01);中藥組較易善復(fù)組脂滴面積減少更多、線粒體數(shù)目明顯增加,體密度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

    注:a,對照組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴減少(×2500),箭頭為脂滴;b,放大倍數(shù)后可見線粒體結(jié)構(gòu)較完整(×50 000),箭頭為線粒體。

    表1 各組大鼠脂滴和線粒體體密度比較Table 1 Lipid droplet and mitochondrial body densitywere compared in each group

    3 討論

    線粒體是肝臟脂肪酸β氧化最主要的細(xì)胞器。非酒精性脂肪性肝病初期肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積,誘發(fā)脂肪變性,肝細(xì)胞內(nèi)大量游離脂肪酸轉(zhuǎn)變成脂酰輔酶A,然后進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化[6]。脂質(zhì)貯積增多,肝臟對游離脂肪酸攝取的增加使線粒體β氧化速度代償性增加,進(jìn)而增加活性氧(ROS)的產(chǎn)出,當(dāng)超過抗氧化物質(zhì)的清除能力導(dǎo)致ROS蓄積時,此時ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多聚不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)反應(yīng)形成有毒的脂質(zhì),從而使線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,并破壞線粒體膜的穩(wěn)定性,引發(fā)肝細(xì)胞程序性死亡,通過亞致死性和致死性應(yīng)激效應(yīng)引起肝細(xì)胞的損傷。因此,維持肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量、功能的正常,在NASH治療中不可忽視。

    NASH病因與飲食不節(jié)、形體肥胖、多臥少動密切相關(guān),脾氣虧虛,運化失職致肝失條達(dá)、痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)是本病的主要病機[7]?;颊哌^食肥甘厚味、勞逸失度、情志失調(diào),導(dǎo)致肝失疏泄、脾失健運,脾胃運化失職,水濕內(nèi)停,濕煉為痰,痰阻氣機,氣滯血瘀,“濕、痰、瘀”交阻肝絡(luò)而發(fā)病。探索“痰濕瘀”的病理生理物質(zhì)基礎(chǔ),進(jìn)一步闡明針對痰、濕、瘀的“化痰祛濕活血”干預(yù)NASH形成的微觀聯(lián)系具有重要意義。

    筆者依據(jù)NASH“痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)、肝失條達(dá)”的主要病機創(chuàng)立了化痰祛濕活血方(澤瀉、丹參、郁金、海藻、決明子、山楂、水飛薊、柴胡)。前期研究[8]已證實化痰祛濕活血方可顯著降低NASH患者血清ALT、胰島素抵抗,提高肝/脾CT值,降低甘油三酯、BMI,改善臨床癥狀方面均明顯優(yōu)于對照組。同時筆者的基礎(chǔ)研究[3,5]也發(fā)現(xiàn),化痰祛濕活血方能夠降低NASH模型大鼠相關(guān)炎癥因子、氧化應(yīng)激因子,從而改善肝組織炎癥損傷及肝纖維化程度,具有良好的抗NASH作用。

    本研究發(fā)現(xiàn),電鏡下模型組的肝細(xì)胞線粒體形態(tài)較正常組大,定量分析發(fā)現(xiàn)線粒體體密度減少,說明氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致線粒體膜通透性增加,細(xì)胞器水腫。 經(jīng)化痰祛濕活血方干預(yù)后,線粒體數(shù)量增加,形態(tài)明顯好轉(zhuǎn),腫脹減輕或消失,雙層膜結(jié)構(gòu)較完整,膜密度增加。說明化痰祛濕活血方有減輕線粒體腫脹、改善線粒體膜通透性、恢復(fù)線粒體形態(tài)的作用。 經(jīng)過化痰祛濕活血方干預(yù)后,NASH大鼠肝臟內(nèi)脂滴明顯減少,提示該方可能通過減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積來降低胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而減輕線粒體功能的損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)化痰祛濕活血方組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組明顯增多,分布廣泛,提示本方有改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、增加其數(shù)量和改善其結(jié)構(gòu)的功能和作用。 易善復(fù)可以增加膜穩(wěn)定性,修復(fù)膜功能抗脂質(zhì)過氧化的作用,臨床常用于治療非酒精性脂肪性肝病。 本研究發(fā)現(xiàn),易善復(fù)組大鼠脂滴數(shù)量較模型組減少,線粒體數(shù)量較模型組明顯增多,大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整,雙層膜清晰,線粒體嵴排列整齊,少數(shù)線粒體膜結(jié)構(gòu)破壞。提示在使用化痰祛濕活血方同時可以結(jié)合現(xiàn)代藥理研究增加有修復(fù)生物膜作用的藥物,以提高療效。

    綜上所述,本研究從亞細(xì)胞水平觀察了化痰祛濕活血方對肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響,為中醫(yī)藥防治NASH的機制研究提供了實驗依據(jù)。后續(xù)還會開展針對線粒體損害導(dǎo)致的細(xì)胞程序性死亡方面探究化痰祛濕活血方的作用靶點,為該方的臨床使用提供更多實驗證據(jù)。

    倫理學(xué)聲明:本研究方案于2016年7月經(jīng)由河南中醫(yī)藥大學(xué)審批,批號: DWLL15010018,符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則,通過河南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理審查。

    利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:趙文霞負(fù)責(zé)課題設(shè)計;劉素彤負(fù)責(zé)資料分析,撰寫論文;張麗慧參與收集數(shù)據(jù),修改論文;劉鳴昊負(fù)責(zé)擬定寫作思路;顧亞嬌、郭敏、趙晨露負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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