蓋他病毒Cap和E2蛋白多克隆抗體的制備

莫清榮，任同偉，農(nóng)作榮，王 豪，黃 靜，陳 櫻，歐陽康，黃偉堅(jiān)，韋祖樟

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

蓋他病毒(Getah virus，GETV)是披膜病毒科、甲病毒屬成員之一，為單股正鏈線形RNA病毒，呈典型的甲病毒結(jié)構(gòu)[1]。其主要是經(jīng)過吸血節(jié)肢動(dòng)物(如蚊蟲等)對(duì)脊椎動(dòng)物造成損害，主要感染的對(duì)象是豬和馬。感染母豬后導(dǎo)致母豬的繁殖系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，感染馬后導(dǎo)致馬匹出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、發(fā)熱、后肢腫脹以及皮疹等癥狀，同時(shí)對(duì)兩棲動(dòng)物、鼠類以及爬行類和鳥類也具有感染性[2-3]。一年四季都有該病發(fā)生的報(bào)道，主要以7月～9月為高發(fā)期[4]。近年來，GETV迅速傳播，并多次在動(dòng)物群體中引起疫情[5-9]。GETV顆粒為圓球形，直徑約為50 nm～70 nm，基因組長度約為11 kb～12 kb[10]，含有2個(gè)開放閱讀框(ORF)，首、末端分別為5′和3′非編碼區(qū)(UTR)，ORF1編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4)，ORF2編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白(Cap、6K、E3、E2、E1)[11]。在結(jié)構(gòu)蛋白中，衣殼蛋白Cap在病毒粒子的形成過程發(fā)揮著非常重要的作用[12]。E2蛋白是甲病毒重要囊膜蛋白的組成之一[13]，同時(shí)也是病毒的抗原識(shí)別位點(diǎn)和中和位點(diǎn)。

為制備Cap和E2蛋白的多克隆抗體，本研究將蓋他病毒Cap和E2蛋白基因連接至原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，然后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，將純化好的重組蛋白皮下注入新西蘭大白兔，從而制備多克隆抗體，通過Western blot和間接免疫熒光(IFA)驗(yàn)證多克隆抗體與病毒蛋白的反應(yīng)。本研究制備的多克隆抗體為GETV的血清學(xué)檢測(cè)方法提供了材料，也為GETV Cap和E2蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地購入2只雌性新西蘭大白兔。

1.1.2 病毒、菌株、細(xì)胞與載體 GETV病毒GX201808由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存[10]；E.coliDH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞自CWBIO公司購入；豬腎細(xì)胞(PK-15)、乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、原核表達(dá)載體pET-32a(+)均由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 Ni瓊脂糖凝膠、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白Marker、RIPA細(xì)胞裂解液，康為世紀(jì)有限公司產(chǎn)品；HRP-山羊抗兔IgG，Abcam公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量，TaKaRa公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶，NEB公司產(chǎn)品；IPTG，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)、FITC Conjugate，全式金公司產(chǎn)品；PMSF(100 mmol/L)，碧云天公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 不同規(guī)格移液槍、低溫離心機(jī)，Eppendorf公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀和垂直電泳儀，Bio-RAD公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品；普通倒置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床細(xì)菌培養(yǎng)箱、細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱和PCR儀，Thermo公司產(chǎn)品；超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的GETV毒株 GX201808全基因組(GenBank登錄號(hào)：MT269657)設(shè)計(jì)Cap蛋白和E2蛋白的兩對(duì)特異性引物。Cap上游引物GETV -Cap-F：5′-CGGGATCCATGAATTACATCCCAACTCA-3′(下劃線為BamHⅠ的酶切位點(diǎn))，下游引物GETV-Cap-R：5′-CCGGAATTCCCATTCTTCTGTTCCTT-3′(下劃線為EcoRⅠ的酶切位點(diǎn))；E2上游引物GETV-E2-F：5′-CGGGATCCAG TGTGACGGAACACTT-3′(下劃線為內(nèi)酶切BamHⅠ位點(diǎn))，下游引物GETV-E2-R：5′-CCGGAATTCGGCATGCGCTCGTGGCGCGCA-3′(下劃線為內(nèi)酶切EcoRⅠ位點(diǎn))。在上海杰李生物有限公司進(jìn)行引物的合成過程，使用濃度均為10 pmol/μL。

1.2.2 RNA的提取和目的基因的擴(kuò)增 用傳統(tǒng)法抽提提取GETV的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以該產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增出Cap、E2基因。使用的反轉(zhuǎn)錄體系如下：5×MLV buffer 2.5 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 0.25 μL，dNTP mix 1 μL，Reverse primer 0.5 μL，酶抑制劑 RRI 0.25 μL，RNA模板8 μL。在42℃條件下反轉(zhuǎn)錄1 h。PCR擴(kuò)增的模板為經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，反應(yīng)體系如下：cDNA模板 4 μL，dNTP 8 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，LATaq酶 0.5 μL，LA buffer 5 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min(35 cycles)；72℃ 7 min。PCR所得產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳正確后，使用DNA膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收。

1.2.3 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a(+)載體和目的片段回收液同時(shí)使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，用反應(yīng)液回收試劑盒對(duì)已經(jīng)酶切的產(chǎn)物進(jìn)行回收，在T4 DNA Ligase的作用下，16℃環(huán)境中連接8 h以上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有Amp+的LA平板，篩選出陽性菌落。對(duì)陽性菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，質(zhì)粒經(jīng)過BamHⅠ和EcoRⅠ酶切正確后送至廣州華大公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 將重組質(zhì)粒pET-32a-Cap、pET-32a-E2分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，涂板，挑取平板上的單個(gè)菌落至4 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h～16 h。翌日，經(jīng)菌液PCR判定正確后以原始菌液：LB培養(yǎng)基為1∶100的比例將菌液體積擴(kuò)大培養(yǎng)至200 mL中，置于37℃搖床中，200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4 h～5 h，當(dāng)菌液的OD600nm值約達(dá)到0.6時(shí)向其中加入IPTG，使其在菌液中終濃度為0.5 mmol/L。在16℃、200 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中進(jìn)行過夜誘導(dǎo)。4℃條件下，誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，使用8 mL PBS磷酸鹽緩沖液進(jìn)行重懸后超聲，使全部菌體破碎完全，再經(jīng)4℃、8 000 r/min離心10 min后分離沉淀與上清。經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳、染色后分析誘導(dǎo)的重組蛋白可溶性情況，以同樣條件下誘導(dǎo)的pET-32a(+)空載蛋白做陰性對(duì)照。

1.2.5 pET-32a-Cap、pET-32a-E2蛋白的純化 將重組質(zhì)粒菌液以原始菌液與LB培養(yǎng)基比例為1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)至500 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4 h～5 h，加入IPTG后使得終濃度達(dá)到0.5 mmol/L，在16℃條件下進(jìn)行菌液誘導(dǎo)12 h～16 h。誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后用PBS重懸菌體沉淀，進(jìn)行超聲波完全破碎，8 000 r/min離心15 min后分別收集上清、沉淀。采用鎳柱純化蛋白說明書的操作，分別收集流穿峰和洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析純化后的效果。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書測(cè)定純化后的蛋白濃度。

1.2.6 多克隆抗體的制備 計(jì)算每只新西蘭大白兔以1 mg純化重組蛋白的劑量與完全弗氏佐劑等體積劑量完全乳化混勻，采取多點(diǎn)皮下注射的方式對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物初次免疫，初次免疫后每隔10 d進(jìn)行增強(qiáng)免疫，后續(xù)免疫采取純化蛋白與不完全弗氏佐劑等體積劑量完全的乳化，直至第4次免疫后5 d采血，采集血清備用。同時(shí)采集陰性對(duì)照組的血清。

1.2.7 IFA鑒定多克隆抗體 將0.01 MOI的GETV病毒液接種至BHK-21細(xì)胞中，并設(shè)立陰性細(xì)胞對(duì)照孔，待陽性病變出現(xiàn)至30%左右時(shí)加入冰甲醇于4℃固定30 min，10 g/L BSA室溫封閉30 min后，以1∶100稀釋的Cap、E2多克隆抗體為一抗，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，用PBS清洗5次,每次振蕩清洗的時(shí)間為5 min，以1∶300稀釋的Goat anti-rabbit IgG(H+L)為二抗，37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，用PBS清洗5次，每次振蕩清洗時(shí)間為5 min。最后，將其置于熒光倒置顯微鏡下，觀察IFA的情況。

1.2.8 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定 對(duì)經(jīng)過4次免疫后的新西蘭大白兔心臟采血，疫后血清與陰性血清均經(jīng)ELISA測(cè)定其效價(jià)。首先，將GETV Cap/E2蛋白使用包被液包被于ELISA板，包被濃度為5 μg/(mL·孔)，每孔加入體積為100 μL，置于4℃包被過夜，PBST清洗5次。向各孔中加入300 μL封閉液后在37℃培養(yǎng)箱2 h，棄液，用PBST清洗5次。以免疫后血清和陰性血清作為一抗均從1∶500倍比稀釋至1∶64 000，每孔加入體積均為100 μL，孵育時(shí)間1 h，孵育條件為37℃培養(yǎng)箱。孵育結(jié)束后棄液，PBST洗5次。以HRP-山羊抗兔IgG為二抗按照1∶10 000稀釋，反應(yīng)45 min后，用PBST清洗5次。每孔加入100 μL的TMB顯色液，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育10 min后終止反應(yīng)，終止液加入體積為50 μL/孔。在450 nm波長下測(cè)定各孔中吸光值。當(dāng)四免后的兔血清OD450 nm值/陰性對(duì)照血清的OD450 nm值≥2.1即判定為陽性，其出現(xiàn)陽性最大的稀釋度作為該多克隆抗體的有效效價(jià)。

1.2.9 Western blot鑒定多克隆抗體 將GETV接種于PK-15細(xì)胞,待出現(xiàn)明顯病變后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌3次。按照PMSF與RIPA比例為1∶100的比例配制細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解PK-15細(xì)胞15 min，4℃條件下13 000 r/min離心10 min。將處理好的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，使用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，PBST清洗PVDF膜5次。在37℃條件下，使用50 g/L的脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h，PBST充分振蕩洗滌5次。按照1∶1 000的比例使用10 g/L BSA 稀釋一抗兔血清，37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行2 h的孵育，PBST清洗5次。按照1∶10 000的比例用10 g/L脫脂奶粉稀釋HRP-山羊抗兔IgG二抗，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行1 h的孵育，PBST清洗5次。加入DAB工作液與PVDF膜充分接觸，在暗室條件下顯色3 min～5 min，立即通過Western blot蛋白印跡成像儀觀察并分析蛋白條帶，最后拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以GETV病毒RNA為模板對(duì)Cap及E2基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，擴(kuò)增出的Cap基因大小為804 bp,E2基因大小為1 266 bp(圖1A)。將經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切的pET-32a(+)載體與雙酶切的目的片段進(jìn)行T4連接后，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，可見兩條帶(圖1B)。經(jīng)測(cè)序后鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功，分別命名為pET-32a-Cap、pET-32a-E2。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；A.1.Cap基因；2.E2基因；B.3.重組質(zhì)粒pET-32a-Cap雙酶切；4.重組質(zhì)粒pET-32a-E2雙酶切

2.2 重組質(zhì)粒的表達(dá)

IPTG誘導(dǎo)下重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中成功表達(dá)，誘導(dǎo)的pET-32a-Cap在48 ku處出現(xiàn)條帶，pET-32a-E2在64 ku處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小相符，pET-32a在18 ku處表達(dá)了His標(biāo)簽大小(圖2)。

2.3 重組蛋白可溶性分析及純化

對(duì)2個(gè)重組蛋白進(jìn)行可溶性分析，對(duì)破碎菌體后離心收集的上清樣品以及沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,pET-32a-Cap和pET-32a-E2均在上清表達(dá)，蛋白大小與預(yù)期相符，純化后得到較為單一的條帶。重組菌表達(dá)的上清目的蛋白經(jīng)鎳柱純化后得到的洗脫液按BCA蛋白定量試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度，pET-32a-Cap、pET-32a-E2蛋白質(zhì)量濃度分別為1.03 mg/mL和0.8 mg/mL(圖3)。

2.4 IFA鑒定多克隆抗體的特異性

以GETV病毒液1∶100接毒至BHK-21細(xì)胞，四免后兔血清為一抗，Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)為二抗，在熒光顯微鏡下觀察到感染的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，證明2種多克隆抗體均能夠識(shí)別GETV病毒產(chǎn)生的蛋白，且未感染病毒的細(xì)胞未見熒光(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)的pET-32a空載；2.誘導(dǎo)的pET-32a空載；3.未誘導(dǎo)的pET-32a-Cap；4.誘導(dǎo)的pET-32a-Cap；5.未誘導(dǎo)的pET-32a-E2；6.誘導(dǎo)的pET-32a-E2

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1/2.誘導(dǎo)的pET-32a-Cap上清/沉淀；3.純化后的pET-32a-Cap蛋白；4/5.誘導(dǎo)的pET-32a-E2上清/沉淀；6.純化后的pET-32a-E2蛋白

Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified recombination proteins

A.Cap多克隆抗體對(duì)GETV感染細(xì)胞中Cap蛋白表達(dá)的IFA分析；B.GETV感染的BHK-21細(xì)胞中的白光；C.E2多克隆抗體對(duì)GETV感染細(xì)胞E2蛋白表達(dá)的IFA分析；D.GETV感染的BHK-21細(xì)胞中的白光；E/F.模擬感染BHK-21細(xì)胞中的熒光或白光對(duì)照

2.5 多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定

新西蘭大白兔經(jīng)4次免疫后采集心臟血清，ELISA檢測(cè)免疫后的血清和陰性對(duì)照血清的效價(jià)，按照免疫后血清OD450 nm值/陰性對(duì)照血清OD450 nm值≥2.1判為陽性，出現(xiàn)陽性達(dá)到的最大稀釋梯度即該抗體的有效效價(jià)。結(jié)果顯示，所檢測(cè)的免疫后血清的效價(jià)均達(dá)到了1∶64 000，說明注射至新西蘭大白兔體內(nèi)的免疫抗原Cap、E2蛋白均取得了良好的免疫效果。

2.6 多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析

將純化后的多克隆抗體Cap和E2經(jīng)過純化，Western blot分析其特異性，表明制備并純化的多克隆抗體Cap和E2均能與GETV感染的PK-15細(xì)胞的細(xì)胞裂解物結(jié)合，并在Western blot蛋白印跡成像儀下觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的條帶，出現(xiàn)在PDVF膜上的條帶大小與預(yù)期的蛋白條帶大小相一致，而未感染GETV的PK-15細(xì)胞沒有出現(xiàn)條帶，陰性對(duì)照成立(圖5)。

3 討論

甲病毒衣殼蛋白(Cap蛋白)對(duì)病毒粒子的形成十分重要，與病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和感染性密切相關(guān)，而且衣殼蛋白的構(gòu)象也決定了病毒包膜的裝配以及與包膜蛋白的相互作用[15]。E2蛋白是甲病毒重要囊膜蛋白的組成之一[13]，是主要的免疫保護(hù)性蛋白。近年來，對(duì)蓋他病毒流行病學(xué)、診斷制劑和致病機(jī)制的研究還不多，本試驗(yàn)制備的蓋他病毒結(jié)構(gòu)蛋白多克隆抗體對(duì)蓋他病毒的研究具有實(shí)際意義。

A：1.Cap多克隆抗體對(duì)GETV感染的細(xì)胞裂解物的Western blot驗(yàn)證；2.未感染GETV的細(xì)胞裂解物；B：1.E2多克隆抗體對(duì)GETV感染的細(xì)胞裂解物的Western blot驗(yàn)證；2.未感染GETV的細(xì)胞裂解物

本研究用原核表達(dá)載體pET-32a(+)，其自身攜帶的His標(biāo)簽?zāi)芘c鎳柱結(jié)合，有利于后續(xù)蛋白的純化。誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間以及溫度都會(huì)影響重組蛋白的表達(dá)[14]。誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白的表達(dá)影響較大，37℃～39℃為大腸埃希氏菌的最適生長溫度，但在此溫度下更容易使重組蛋白表達(dá)為包涵體。16℃低溫的條件使重組蛋白的表達(dá)變慢，但會(huì)增大重組蛋白表達(dá)為可溶性蛋白的可能性，本試驗(yàn)選用終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，16℃誘導(dǎo)過夜，重組pET-32a-Cap、pET-32a-E2蛋白在上清中表達(dá)量較多。免疫動(dòng)物前采用的完全弗氏佐劑與抗原蛋白1∶1混合充分形成乳液狀，目的是佐劑能夠使抗原在體內(nèi)留存時(shí)間更長，增加了抗原與宿主體內(nèi)免疫細(xì)胞相遇的幾率，能夠誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)及局部炎癥反應(yīng)，刺激免疫細(xì)胞增值。第1次免疫采用完全弗氏佐劑，其后采用不完全弗氏佐劑。

本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Cap和pET-32a-E2，并對(duì)重組蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和純化，獲得了較高濃度和純度的重組蛋白。以在大腸埃希氏菌中高效表達(dá)的蓋他病毒蛋白為免疫抗原，通過多點(diǎn)皮下注射新西蘭大白兔制備了抗蓋他病毒多克隆抗體。IFA和Western blot結(jié)果顯示，所制備的抗蓋他病毒多克隆抗體能夠與蓋他病毒特異性結(jié)合。制備的重組蛋白及多克隆抗體對(duì)蓋他病毒檢測(cè)制劑和病毒蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。