圍產(chǎn)期奶牛子宮的免疫調(diào)節(jié)研究進(jìn)展

曹 旭，馬 馨，呂文發(fā)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118)

炎癥是影響子宮能否順利復(fù)歸的重要因素。分娩后子宮內(nèi)膜脫落，子宮復(fù)歸和上皮再生大約需要4周[1]。在此期間，奶牛子宮內(nèi)膜非常容易受到外界病原菌的侵害，同時(shí)機(jī)體會(huì)重新分配營養(yǎng)物質(zhì)以支持泌乳期間營養(yǎng)需求。因此，產(chǎn)后發(fā)生先天免疫受損和新陳代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，大約50%產(chǎn)后奶牛在圍產(chǎn)期經(jīng)歷一種或多種生殖道炎疾病，包括胎衣不下、亞臨床子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜炎、宮頸炎和陰道炎[2]。

奶牛圍產(chǎn)期中性粒細(xì)胞的趨化性、吞噬作用以及氧化爆發(fā)功能降低，被認(rèn)為是導(dǎo)致子宮感染幾率增加的主要原因之一。這種中性粒細(xì)胞功能降低的機(jī)制可能包括營養(yǎng)缺乏、能量負(fù)平衡及相關(guān)的組織動(dòng)員而導(dǎo)致的血液代謝物濃度紊亂。本文綜述了影響生殖道先天免疫的因素，并探討了圍產(chǎn)期奶牛免疫功能調(diào)節(jié)的有效治療方法，以期為圍產(chǎn)期奶牛生殖道疾病的預(yù)防及飼養(yǎng)管理提供理論依據(jù)。

1 產(chǎn)后子宮的復(fù)歸

分娩后，牛產(chǎn)道和子宮會(huì)出現(xiàn)天然損傷。牛的胎盤屬于結(jié)締絨膜胎盤，在胎盤形成時(shí)，胚胎絨毛膜上成簇的絨毛插入母體子宮肉阜內(nèi)形成的陷窩中，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞被侵蝕，絨毛直接與母體的結(jié)締組織接觸。因此，當(dāng)胎盤脫落后，子宮內(nèi)膜對(duì)子宮肉阜保護(hù)喪失，加之分娩后機(jī)體免疫力下降，細(xì)菌的負(fù)荷和致病性、感染或病理性炎癥占上風(fēng)，導(dǎo)致子宮炎癥的發(fā)生[3]。

中性粒細(xì)胞是產(chǎn)犢后在子宮內(nèi)出現(xiàn)的最豐富的炎癥細(xì)胞類型。子宮中性粒細(xì)胞增加是子宮上皮細(xì)胞和常駐巨噬細(xì)胞的免疫受體被激活引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，導(dǎo)致以分泌炎性細(xì)胞因子和趨化因子(TNF-α、IL-1、IL-6)為特征的促炎狀態(tài)。這種炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活后，子宮腔中的中性粒細(xì)胞比例在產(chǎn)后第1周達(dá)到40%以上，到產(chǎn)后第4周降至5%以下[4]。目前，尚不清楚過度或持續(xù)的炎癥是否是由不同類型或數(shù)量細(xì)菌感染、或免疫功能及代謝調(diào)節(jié)的不穩(wěn)定引起，或者由兩者共同作用引起[5]?；加蟹亲訉m疾病的奶牛與患有胎盤殘留或子宮炎的奶牛在隨后產(chǎn)犢的比例上有類似程度降低，患有非子宮疾病的奶牛在第5天或第6天的高質(zhì)量胚胎百分比降低，以及從第45天到足月的更大妊娠損失。

2 能量負(fù)平衡和全身炎癥

產(chǎn)犢前3周至產(chǎn)犢后3周先天免疫功能降低和炎癥調(diào)節(jié)功能紊亂是生殖道炎性疾病發(fā)生的重要原因。雖然所有圍產(chǎn)期奶牛在產(chǎn)后早期都經(jīng)歷了不同程度的能量負(fù)平衡和全身炎癥，但機(jī)體對(duì)能量負(fù)平衡的適應(yīng)及全身炎癥的加重可能是引發(fā)生殖道炎性疾病的重要原因。產(chǎn)后早期酮體或非酯化脂肪酸(NEFA)濃度升高與亞臨床型子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生呈正相關(guān)，同時(shí)，奶牛圍產(chǎn)期中性粒細(xì)胞功能降低與NEFA、觸珠蛋白濃度、酮體濃度呈負(fù)相關(guān)，與細(xì)胞內(nèi)糖原儲(chǔ)存呈正相關(guān)[6]。

葡萄糖是免疫功能的重要原料[7]。在奶牛體內(nèi)，葡萄糖被大量重新分配到乳腺以合成用于產(chǎn)乳的乳糖，奶牛產(chǎn)犢前最后1周采食量平均會(huì)減少30%，在產(chǎn)犢后1周才恢復(fù)食量，在哺乳期營養(yǎng)需求量增加了1倍以上。能量負(fù)平衡以適應(yīng)性及同源性反應(yīng)為特征，其特征在于外周胰島素抵抗和脂肪動(dòng)員，以及隨后將NEFA釋放到血流中。非酯化脂肪酸通過激素敏感脂肪酶的作用從甘油三酯分子中分離出來，作為生產(chǎn)牛乳的能源[8]。在肝臟中，NEFA重新酯化為甘油三酯或通過β-氧化產(chǎn)生能量。然而，NEFA也可能促進(jìn)炎癥[9]、抑制中性粒細(xì)胞氧化暴發(fā)功能和造成胰島素抵抗，肝細(xì)胞攝取NEFA也會(huì)產(chǎn)生酮體。酮類作為外周組織(尤其是肌肉)的能量底物，有研究將酮癥與全身炎癥指標(biāo)聯(lián)系起來。產(chǎn)犢后發(fā)生酮癥的奶牛，其循環(huán)脂多糖(LPS)濃度升高，LPS濃度的升高可能刺激全身炎癥，但目前無法確定LPS的來源。此外，酮癥(血BHB>3 mmol/L)常伴隨著血清中促炎細(xì)胞因子TNF-β、IL-1β和IL-18的濃度升高及抗炎性IL-10的濃度較低，暗示肝臟中NF-κB通路可能被激活[10]。

分娩與炎癥加劇有關(guān)(如宮頸中IL-8的表達(dá))。目前胎盤分離的機(jī)制尚不完全清楚，但是包括來自中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶在產(chǎn)犢期間常造成子宮組織損傷。因此，在分娩、胎盤排出和子宮復(fù)歸等正常生理活動(dòng)中會(huì)存在一定程度的炎癥。然而，人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到炎癥不僅是機(jī)體對(duì)損傷或疾病的反應(yīng)，而且可能是代謝紊亂的后果[11]。促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α可以刺激肝臟產(chǎn)生急性期蛋白，包括觸珠蛋白和血清淀粉樣蛋白α。這些促炎物質(zhì)可能來自脂肪動(dòng)員或胃腸道，也有可能是產(chǎn)后子宮的炎癥過程。脂肪活化產(chǎn)生TNF-α和IL-6，其能阻斷胰島素的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，從而促成胰島素抵抗，反過來又加劇了脂肪中NEFA的釋放[12]。此外，NEFA通過結(jié)合Toll樣受體-4(LPS的傳感器，來自革蘭氏陰性細(xì)菌的主要毒素，子宮炎的重要參與者)可以直接導(dǎo)致炎癥進(jìn)程的加劇。

3 先天免疫功能

分娩時(shí)，循環(huán)皮質(zhì)醇濃度急劇增加，導(dǎo)致L-選擇素表達(dá)下調(diào)。并通過抑制遷移來增加循環(huán)中的中性粒細(xì)胞數(shù)量，但分娩后中性粒細(xì)胞數(shù)量略有下降，可能是中性粒細(xì)胞遷移到炎癥部位，如產(chǎn)后子宮和乳腺。這種先天免疫功能的改變?cè)黾恿颂ヒ虏幌?、子宮炎、PVD、亞臨床子宮內(nèi)膜炎和乳腺炎的風(fēng)險(xiǎn)。

分娩后白細(xì)胞會(huì)向子宮募集。中性粒細(xì)胞釋放后，其主要功能包括活化內(nèi)皮細(xì)胞黏附和遷移、病原體識(shí)別和中和。中性粒細(xì)胞的胞漿中有許多含有溶菌酶的顆粒，與病原體的相互作用刺激溶酶與吞噬體的融合，從而促進(jìn)病原體殺滅和進(jìn)一步的吞噬作用，功能性中性粒細(xì)胞合成細(xì)胞因子(如IL-8)以維持對(duì)急性炎癥的正反饋并招募更多的中性粒細(xì)胞[13]。在清除感染源后，中性粒細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(凋亡)。如果細(xì)胞凋亡失敗，可能導(dǎo)致促炎癥途徑的持續(xù)激活引起慢性炎癥，如亞臨床子宮內(nèi)膜炎。成功凋亡的最終結(jié)果是中性粒細(xì)胞分裂成與膜結(jié)合的小體，被新到達(dá)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞清除。此外，凋亡的中性粒細(xì)胞會(huì)進(jìn)行反向遷移并返回骨髓以調(diào)節(jié)進(jìn)一步的中性粒細(xì)胞反應(yīng)。

目前，關(guān)于炎癥是如何被下調(diào)并轉(zhuǎn)變?yōu)橛现敝赁D(zhuǎn)變?yōu)榛A(chǔ)狀態(tài)的過程仍知之甚少。炎癥所需的自我限制部分由專門的促分解介質(zhì)介導(dǎo)，如由ω-3脂肪酸合成的分解素、脂氧素和保護(hù)素；這與來自花生四烯酸途徑的促炎類花生酸(如前列腺素)相反。中性粒細(xì)胞在解決炎癥和啟動(dòng)組織修復(fù)中的作用可能還未被充分認(rèn)識(shí)。吞噬凋亡的中性粒細(xì)胞導(dǎo)致釋放抗炎或恢復(fù)性細(xì)胞因子，如IL-10和TGF-β，而不是促炎細(xì)胞因子[14]。與巨噬細(xì)胞的經(jīng)典型(M1)和活化型(M2)表型相似，中性粒細(xì)胞被描述為具有相似的N1和N2功能亞群?？紤]到產(chǎn)后的子宮健康，分娩后需要迅速、有力和有效的中性粒細(xì)胞流入子宮，亞臨床子宮內(nèi)膜炎可能在一半的病例中是一種持續(xù)的、失調(diào)的“無菌”炎癥。假設(shè)炎癥的調(diào)節(jié)是亞臨床子宮內(nèi)膜炎發(fā)病機(jī)制的核心，通過營養(yǎng)和藥物途徑調(diào)節(jié)炎癥的解決應(yīng)該是未來奶牛研究的一個(gè)重要目標(biāo)。

4 子宮免疫功能調(diào)節(jié)

4.1 非甾體抗炎藥

一個(gè)健康并且具有良好調(diào)節(jié)作用的產(chǎn)后子宮炎癥反應(yīng)對(duì)于耐受或消除病原體、恢復(fù)卵巢功能和避免生殖疾病是必不可少的[15]。但是如果全身炎癥狀態(tài)過度或持續(xù)時(shí)間過長，可能會(huì)影響正常的子宮復(fù)歸。炎癥和免疫的異常調(diào)節(jié)是導(dǎo)致臨床型或亞臨床子宮內(nèi)膜炎的決定因素。因此，使用非甾體抗炎藥(NSAID)可減少產(chǎn)后早期的全身性炎癥，并最終可能有助于減少生殖道疾病的發(fā)生。

高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后代謝特征是促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8)的基因表達(dá)或循環(huán)濃度升高。非甾體抗炎藥的治療作用是通過抑制環(huán)氧化酶(COX)，減少前列腺素的形成實(shí)現(xiàn)的。環(huán)氧合酶有2種亞型，即組成型環(huán)氧合酶-1(COX-1)和誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶-2(COX-2)。非甾體抗炎藥通過抑制COX-2抑制全身炎癥，但是其副作用則是會(huì)抑制COX-1。非甾體抗炎藥可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB，它可以調(diào)節(jié)包括TNF-α和IL-1β在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

非甾體抗炎藥通過抑制COX-2通路、腫瘤形成和腫瘤生長，減少了與胰島素抵抗相關(guān)的全身炎癥，降低了結(jié)腸癌和直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。研究還表明，服用大劑量非甾體抗炎藥的2型糖尿病患者的空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯和胰島素清除率降低。奶牛產(chǎn)后第1周口服非甾體抗炎藥會(huì)導(dǎo)致機(jī)體低葡萄糖和高NEFA的不利反應(yīng)，但治療奶牛在短期內(nèi)具有更高的肝臟胰島素敏感性，并且在整個(gè)哺乳期產(chǎn)奶量升高[16]，不過目前其代謝作用和對(duì)子宮健康的影響還未見報(bào)道。研究指出，用美洛昔康治療奶牛全身炎癥的第2天到最后1天血清觸珠蛋白降低，并改善了能量代謝指標(biāo)(治療期間β-羥基丁酸酯較少，胰島素樣生長因子-1較高)[17]。產(chǎn)后14 d的多形核中性粒細(xì)胞(PMN)功能得到改善，但子宮內(nèi)膜炎癥狀態(tài)沒有受到影響。可以進(jìn)一步研究抗炎治療對(duì)全身炎癥、能量代謝的作用機(jī)制，并優(yōu)化非甾體抗炎藥劑量、治療時(shí)間和持續(xù)時(shí)間，以改善動(dòng)物健康。

4.2 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子

粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)可以刺激干細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)和單核細(xì)胞。單核細(xì)胞離開循環(huán)并遷移到組織中，隨后它們成熟為巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞[18]。因而是免疫/炎癥級(jí)聯(lián)的一部分，通過該級(jí)聯(lián)，少量巨噬細(xì)胞的活化可以迅速導(dǎo)致其數(shù)量的增加，這是對(duì)抗感染一個(gè)關(guān)鍵的過程。此外，在胚胎著床、胎盤發(fā)育時(shí)期以及在月經(jīng)周期等子宮結(jié)構(gòu)劇烈變化時(shí)期，GM-CSF對(duì)子宮內(nèi)膜組織再生具有促進(jìn)作用[19]。GM-CSF可以靶向建立或維持妊娠所需的白細(xì)胞。研究表明，免疫環(huán)境的破壞會(huì)損害胎盤的發(fā)育，其后果包括胎兒生長受限和不良的圍產(chǎn)期結(jié)局，類似于在GM-CSF缺失突變小鼠中看到的結(jié)果[20]。

有研究使用子宮灌注乙醇的方式建立小鼠子薄型子宮內(nèi)膜模型，使用不同濃度的GM-CSF處理其組織貼壁細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GM-CSF有利于小鼠受損子宮內(nèi)膜再生，增加子宮內(nèi)膜厚度，促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞中Ki67的表達(dá)，并改善植入位點(diǎn)的數(shù)量[21]。此外，GM-CSF可以促進(jìn)原發(fā)性人類子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞的增殖和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移。GM-CSF通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)人子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞的增殖。也有研究表明，GM-CSF可以提高子宮內(nèi)中性粒細(xì)胞豐度[22]。而產(chǎn)后奶牛正處于免疫力波動(dòng)時(shí)期，因此在產(chǎn)后使用GM-CSF來提高中性粒細(xì)胞豐度，進(jìn)而提高產(chǎn)犢后奶牛的子宮免疫功能，降低產(chǎn)后疾病是可行的。但是關(guān)于這一方向仍需進(jìn)一步研究[23]。

4.3 牛重組白細(xì)胞介素-8

白細(xì)胞介素-8(IL-8)是一種有效的中性粒細(xì)胞趨化激活因子，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，由于其調(diào)節(jié)先天免疫功能的潛力，體外試驗(yàn)證明重組牛白介素-8(rbIL-8)處理的中性粒細(xì)胞趨化特性是對(duì)照組的10倍[24]。在奶牛生殖道進(jìn)行體內(nèi)中性粒細(xì)胞趨化試驗(yàn)。子宮內(nèi)注射1125 μg生理鹽水稀釋的rbIL-8，分別在給藥后3 h和1 h顯著增加陰道和子宮腔中中性粒細(xì)胞的比例。靜脈注射或?qū)m內(nèi)注射1125 μg rbIL-8后，未觀察到對(duì)健康的不良影響。在進(jìn)一步的試驗(yàn)中[25]，同一研究組在104頭初產(chǎn)奶牛和109頭多產(chǎn)荷斯坦奶牛產(chǎn)后24 h內(nèi)分別注入低或高劑量的rbIL-8(11.25 μg和1125 μg rbIL-8稀釋于250 ml鹽水中)。監(jiān)測(cè)奶牛胎衣不下、產(chǎn)褥期子宮炎和PVD。rbIL-8治療降低了多產(chǎn)奶牛產(chǎn)后子宮炎的發(fā)生率，但對(duì)胎盤殘留或PVD的發(fā)生率沒有影響。雖然有試驗(yàn)證明rbIL-8對(duì)產(chǎn)后奶牛的子宮健康有積極效果，但仍然需要更大的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來評(píng)估分娩后使用rbIL-8對(duì)子宮炎、PVD和亞臨床子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率的影響。但目前rbIL-8的作用機(jī)制尚不明確。

4.4 鈣代謝的調(diào)節(jié)

圍產(chǎn)期鈣穩(wěn)態(tài)被大量輸出用于生產(chǎn)初乳，引起產(chǎn)后血鈣濃度顯著降低[26]。血鈣嚴(yán)重降低可導(dǎo)致臨床低鈣血癥，但亞臨床低鈣血癥(血總鈣<2.1 mmol/L)可影響50%以上的多產(chǎn)奶牛[27]，并與血液中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、中性粒細(xì)胞功能受損和子宮炎發(fā)病率增加有關(guān)[27]。負(fù)的膳食陽離子-陰離子差(dietary cation-anion difference，DCAD)飲食在產(chǎn)前喂養(yǎng)會(huì)引起輕度代謝性酸中毒，導(dǎo)致產(chǎn)后鈣代謝改變及血鈣升高。兩項(xiàng)Meta分析表明，降低DCAD日糧可降低胎盤殘留、子宮炎和整體疾病的幾率[28-29]。喂食DCAD的奶牛發(fā)病率降低可能與免疫功能改善有關(guān)。也有一項(xiàng)研究表明，產(chǎn)前飼喂陰性的DCAD可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞β-防御素的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)后健康[30]。與喂食陽性DCAD(+130 mEq/kg)的奶牛相比，喂食陰性DCAD飼料(-130 mEq/kg)的經(jīng)產(chǎn)奶牛中性粒細(xì)胞的吞噬功能和氧化爆發(fā)熒光強(qiáng)度僅輕度增加[31]。鈣的細(xì)胞外流入對(duì)中性粒細(xì)胞的活化很重要，但鈣在中性粒細(xì)胞功能中的作用還不完全清楚。產(chǎn)犢后給予腸外鈣補(bǔ)充劑對(duì)中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)或吞噬功能沒有改善[32]。在另一項(xiàng)試驗(yàn)中產(chǎn)犢前喂養(yǎng)陰性(-100 mEq/kg)或陽性(+100 mEq/kg)DCAD飼料的奶牛中未發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞吞噬或氧化爆發(fā)的差異。

關(guān)于鈣對(duì)子宮疾病的影響也有研究表明，在診斷為子宮炎奶牛中可以觀察到較低的血清鈣濃度，同時(shí)注射脂多糖也可以誘發(fā)血鈣濃度降低。也就是說，低鈣血癥與生殖道疾病有關(guān)，但其機(jī)制尚不清楚。因此，是否可以通過預(yù)防或早期治療亞臨床低鈣血癥的方法作為提高免疫功能和預(yù)防生殖道疾病的手段還需進(jìn)一步研究。

5 展望

先天免疫功能下降是生殖道炎癥性疾病高發(fā)的重要原因，在產(chǎn)犢前2周到產(chǎn)犢后3周，調(diào)節(jié)圍產(chǎn)期奶牛的先天免疫應(yīng)答，有助于減少生殖道炎癥性疾病的發(fā)生。產(chǎn)后子宮炎癥可能是由于子宮內(nèi)膜對(duì)病原的耐受性失敗所引起，一旦病原體克服子宮內(nèi)膜耐受，迅速而強(qiáng)大的先天免疫反應(yīng)對(duì)于對(duì)抗它們是必不可少的。而相比于現(xiàn)在大多數(shù)產(chǎn)后使用抗生素治療的方法，增強(qiáng)奶牛先天免疫以及中性粒細(xì)胞功能可以降低產(chǎn)后奶牛發(fā)生子宮炎癥幾率，同時(shí)也在一定程度上規(guī)避由抗生素治療帶來的耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。未來隨著對(duì)子宮免疫功能相關(guān)研究的推進(jìn)，將會(huì)減少由子宮炎癥產(chǎn)生的負(fù)面影響及經(jīng)濟(jì)損失，使養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展。