細菌外膜囊泡的抗腫瘤機制及其應用研究進展

陳歐亮，張 紅，趙鑫鋮，羅尹琳，岑怡靜

(海南大學動物科技學院，海南海口 570228)

近年來，隨著細菌用于抗腫瘤治療研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)由革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生的外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)也有著與其來源細菌類似的抗腫瘤作用，比如專性厭氧菌和兼性厭氧菌對腫瘤低氧區(qū)的特殊靶向性和激發(fā)抗腫瘤免疫反應等。而由于OMVs沒有細菌的繁殖復制能力，在將其應用于患腫瘤動物治療時將會展現(xiàn)比細菌更佳的生物安全性。此外，OMVs是納米級別的小泡，更容易經(jīng)血液傳遞和穿透組織，從而快速到達腫瘤組織發(fā)揮抗腫瘤作用。不僅如此，OMVs對各種生物工程改造有著極強的耐受性，比如超聲、過濾擠壓、電擊等。通過改造，可以實現(xiàn)其腫瘤靶向性的增強，以及腫瘤治療藥物的高效運輸。OMVs的給藥方式也不是單一的，不同給藥方式可以更好地滿足不同腫瘤類型的治療?？偟膩碚f，OMVs的生物和理化特性使其在腫瘤治療上具有巨大潛力。

1 細菌外膜囊泡的抗腫瘤機制

1.1 OMVs是納米級脂質雙層囊泡結構

OMVs由各種免疫刺激成分組成的納米級脂質雙層囊泡結構(直徑20 nm～250 nm)，是許多科學家公認的候選疫苗和藥物遞送載體的免疫刺激劑之一[1]。OMVs的大小利于其直接通過淋巴引流和吞噬進入淋巴結，隨后由抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APCs)攜帶，如OMVs的特殊納米結構可以增加樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)對其攝取[2]。據(jù)報道，在小鼠靜脈注射OMVs后，能夠在腫瘤組織中積累，誘導抗腫瘤免疫反應并最終根除腫瘤[3]。OMVs的脂膜成分使其在經(jīng)皮給藥時具有良好的透皮效果，可以廣泛滲透進表皮和真皮層。因此是一種有巨大潛力的治療各種皮膚疾病如皮膚癌和痤瘡的靶向性納米平臺[4]。

1.2 OMVs攜帶細菌抗原

革蘭氏陰性細菌在自然生長過程中會連續(xù)釋放出OMVs，OMVs主要由細菌外膜成分組成，含有大量來自親本細菌外膜和周質的物質，這些物質是可以誘導保護性免疫反應(包括抗腫瘤免疫)所需的關鍵抗原成分，OMVs所具有的高度免疫原性使它們成為激發(fā)天然免疫力和作為疫苗載體的極佳制劑[5]。

OMVs中豐富的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)可以激活免疫系統(tǒng)，適應性免疫反應的產(chǎn)生需要APCs發(fā)揮其功能，OMVs包含的PAMPs可以與APCs上相應的模式識別受體相互作用，從而激活APCs[1]。此外，PAMPs還可以激活Toll樣受體(TLR)，從而引發(fā)強有力的炎癥反應[1]。脂蛋白A是脂多糖的一個組成部分，是一種被TLR4和髓樣分化因子2識別的磷酸化和?；亩前?，在宿主天然免疫細胞上被識別。

OMVs攜帶細菌蛋白和毒力因子，包括可以介導與宿主細胞黏附的表面因子。已有研究表明OMVs攜帶的來自親本細菌的毒性分子賦予了其一定的免疫調節(jié)能力，可以破壞體內B細胞的耐受性[6]。體內注射OMVs可以刺激參與抗腫瘤免疫反應的細胞因子的表達，如干擾素-γ(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6((interleukin-6,IL-6)等[7]。研究表明，OMVs能夠誘導較高的抗原特異性抗體，并且比由重組蛋白或糖結合物佐劑組成的傳統(tǒng)疫苗制劑具有更強的功能性[8]。來自沙門氏菌(Salmonella)的OMVs被發(fā)現(xiàn)可以誘導樹突狀細胞上CD86和主要組織相容性復合體Ⅱ類分子的表達，TNF-α和IL-12的產(chǎn)生，并促進保護性B細胞和T細胞反應的發(fā)展。有研究人員研究了單純使用革蘭陰性菌大腸埃希氏菌(E.coli)、沙門氏菌自然產(chǎn)生的OMVs的抗腫瘤作用。結果表明，OMVs在荷瘤小鼠體內具有顯著的誘導抗腫瘤免疫反應和治愈腫瘤的能力，且沒有引發(fā)明顯的不良反應。OMVs在IFN-γ缺陷荷瘤小鼠中產(chǎn)生沒有類似的效果，證明這種抗腫瘤效應是IFN-γ依賴性的[9]。

1.3 OMVs將抗腫瘤藥物靶向傳送到腫瘤組織

為了能進一步產(chǎn)生更顯著的抗腫瘤效應，多項研究利用OMVs的生理形態(tài)特點對OMVs進行改造，使OMVs成為抗腫瘤藥物傳遞的載體，將其直接運送到腫瘤內部發(fā)揮抗腫瘤效應，包括替加氟[10]、多柔比星[11]、紫杉醇和小抑制RNA[12]等。也有研究致力于增強OMVs的腫瘤靶向性從而相應地減少OMVs在腫瘤以外其他健康組織的非特異性積累[4]。

1.4 OMVs表達異源蛋白

癌細胞在突變過程中會發(fā)生基因改變而導致蛋白表達異常，結果就是產(chǎn)生正常體細胞沒有的新抗原表位，新抗原特異性T細胞反應性是癌癥免疫治療成功的主要活性成分[13]。攜帶腫瘤抗原的OMVs進入動物機體后會誘導機體產(chǎn)生特異性免疫應答，從而起到治療和預防腫瘤的效果[14]。

2 細菌外膜囊泡的加工方法

2.1 基因工程修飾

通過質粒轉化可使大腸埃希氏菌表達的異源外膜和周質蛋白可以裝載到其分泌的OMVs上。編碼Ail(小腸結腸炎耶爾森氏菌的外膜黏附素/侵抗素)的質粒被導入大腸埃希氏菌DH5、HB101和MC4100菌株中后，從來自這些菌株的純化OMVs和外膜中均檢測到了Ail。攜帶Ail的OMVs的黏附和內化特性會發(fā)生改變。在Tat-GFP(雙精氨酸轉運蛋白-綠色熒光蛋白)轉化的大腸埃希氏菌菌株的OMVs中檢測到鏈霉蛋白酶抗性熒光，表明GFP存在于完整的OMVs中。后來有研究也通過質粒轉化的方法使不同的細菌OMVs攜帶各種異源蛋白[15]?？刂飘愒吹鞍卓乖倪^度表達，有助于增加誘導的免疫反應的廣度和幅度，從而增強對同一細菌物種的不同菌株或多個物種的保護作用[2]。

除了異源蛋白，將合成目的多糖所需的基因克隆到表達載體，然后再轉化到特定菌株中，也可使OMVs裝載異源多糖。有研究展示了糖工程OMVs作為小鼠肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)和雞空腸彎曲菌(C.jejuni)疫苗的有效性[16]。使用某些基因缺失的菌株來生產(chǎn)相應功能改變的OMVs也是研究人員對OMVs進行開發(fā)利用的常用手段，如msbB基因缺失的大腸埃希氏菌突變體產(chǎn)生的脂多糖比野生型脂多糖具有更少的酰基鏈，這會使細菌及其產(chǎn)生的囊泡的毒性降低[17]。

2.2 物理方法

除了用基因改造的方法使革蘭氏陰性菌OMVs攜帶特定蛋白或多糖，還可以用物理方法將各類具有抗腫瘤效應的藥物并入OMVs中，例如通過電穿孔將小干擾RNA導入OMV后，OMVs在腫瘤組織聚集并釋放小干擾RNA以抑制腫瘤進展。也有研究人員用超聲或擠壓的方式將OMVs包裹在裝載有藥物的納米顆粒上[10]。通過超聲的方法還可以使OMVs與其他細胞的胞膜融合以達到增強特異性抗腫瘤免疫和提高其腫瘤靶向性的目的[18]。

2.3 其他

給細菌培養(yǎng)基里添加某種藥物可獲得含有這種藥物的OMVs[19]。在大腸埃希氏菌(BL21)OMVs上覆蓋一層磷酸鈣(CaP)不僅可以克服OMVs在靜脈注射時產(chǎn)生的抗體依賴性清除和高毒性障礙，還可以中和酸性腫瘤微環(huán)境，導致巨噬細胞由M2到M1的高度極化。此外，CaP層還有和葉酸和光敏劑吲哚菁綠結合的特性，這進一步提高了抗腫瘤效果[20]。

3 細菌外膜囊泡的抗腫瘤應用研究

3.1 基因工程改造OMVs的抗腫瘤應用研究

3.1.1 表達腫瘤抗原的OMVs 研究人員設計了一個基于OMVs的多功能疫苗平臺，通過特異性地將抗原呈遞到OMVs表面來誘導特異性的抗腫瘤免疫反應。首先通過與ClyA蛋白融合的方式在OMVs表面展示腫瘤抗原，結果表明由OMVs表面的ClyA蛋白展示的抗原肽成功的激活了小鼠腫瘤模型的機體免疫反應，促進了樹突狀細胞的成熟及其對相應抗原的遞呈，抑制了表達相應抗原的黑色素瘤的肺轉移現(xiàn)象。然后再通過使用由標簽/捕捉蛋白對組成的即插即用顯示系統(tǒng)簡化抗原顯示過程。用不同的蛋白質捕捉器修飾的OMV可以同時顯示多種不同的腫瘤抗原，從而引發(fā)協(xié)同抗腫瘤免疫反應[14]。高?；蛐腿巳轭^瘤病毒(HPV)持續(xù)感染會引發(fā)宮頸癌的發(fā)生。研究人員通過基因重組技術將人類乳頭瘤病毒16型早期蛋白基因嵌入到工程OMVs中，成功誘導HPV-16癌蛋白E6、E7和c-Ha-ras癌基因共轉化TC-1移植瘤荷瘤小鼠的特異性細胞免疫反應并抑制腫瘤生長[21]。

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，BFGF)是除血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)外的另一種重要的血管生成分子。VEGF信號被抑制后，BFGF水平會代償性升高，從而再次促進血管生成，導致抗VEGF治療的耐藥性。有研究人員開發(fā)了一種以OMVs為載體的抗腫瘤治療納米疫苗。用基因重組技術將154個氨基酸組成的BFGF裝載到大腸埃希菌OMVs上。利用OMVs的強佐劑作用誘導宿主產(chǎn)生抗BFGF自身抗體，并憑借OMVs的特性打破B細胞自身耐受。小鼠經(jīng)3次免疫后可產(chǎn)生持久的抗BFGF自身抗體來對抗BFGF的功能，其作用包括多種腫瘤抑制功能，比如抑制腫瘤血管生成、誘導腫瘤細胞凋亡、逆轉腫瘤免疫屏障和促進腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTLs)，最終導致腫瘤消退[22]。用穩(wěn)定表達人表皮生長因子受體變異Ⅲ 型變異基因的B16F10黑色素瘤細胞系上的兩個保護性表位來修飾OMVs，最終得到的工程OMVs免疫小鼠后可誘導高滴度的抗人表皮生長因子受體變異Ⅲ 型抗體，抑制了黑色素瘤細胞系在小鼠的成瘤性[23]。

3.1.2 攜帶腫瘤表面受體配體的OMVs 腫瘤細胞在持續(xù)暴露于IFN-γ后其表面表達程序性死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)是腫瘤的一個免疫逃逸機制。PD-L1與T細胞表面的程序性死亡1(programmed death 1，PD1)結合后會誘導T細胞功能障礙和凋亡從而抑制炎癥反應，保護腫瘤細胞免受免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。有研究報道了通過插入PD1外結構域修飾表面的基因工程OMVs抗腫瘤的作用。OMV-PD1可以結合腫瘤細胞表面的PD-L1，促進其內化和減少，從而保護T細胞免受PD-L1 /PD-L1免疫抑制軸的影響。通過免疫激活和檢查點抑制的聯(lián)合作用，工程OMVs驅動效應T細胞在腫瘤中積累，進而導致對腫瘤生長的強烈抑制[24]。

人類表皮生長因子受體2是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，在細胞生長調節(jié)、存活和分化中發(fā)揮重要作用。在18%～25%的乳腺癌、卵巢癌、胃癌和唾液腺腫瘤中過表達，因此，這是癌癥診斷和治療的一個有吸引力的目標。有研究將細菌分泌的OMVs經(jīng)過生物工程降低其內毒素，并表達靶向人類表皮生長因子受體2的高效親和配體，這進一步增強了OMVs對腫瘤的靶向性。有研究人員將可編碼腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的質粒導入大腸埃希氏菌中，當含有TRAIL的大腸埃希氏菌衍生的OMVs應用于皮膚黑色素瘤部位時，OMVs可以靶向黑色素瘤體，最終通過釋放TRAIL活性分子來啟動腫瘤治療效果[4]。

3.2 載藥OMVs的抗腫瘤應用研究

有研究人員[10]提出了一種生物工程方法，將減毒鼠傷寒沙門氏菌OMVs包裹在裝載有癌癥化療藥物替加氟的聚合物膠束上，還以聚乙二醇和腫瘤靶向配體修飾OMVs表明以增加OMVs的穩(wěn)定性和腫瘤靶向性。這樣設計的工程OMVs可發(fā)揮化療和免疫調節(jié)雙重作用，使腫瘤細胞對CTLs敏感，并直接殺傷腫瘤細胞。全身注射這種OMVs，不僅能對黑色素瘤的發(fā)生提供有效的保護性免疫，而且能顯著抑制體內腫瘤的生長，延長黑色素瘤小鼠的存活率，還可以有效地抑制腫瘤向肺部的轉移。

研究表明，OMVs是腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)重編程的強大免疫刺激劑。而通過仿生礦化將CaP覆蓋在大腸埃希氏菌(BL21)OMVs上可以克服OMVs在靜脈注射時產(chǎn)生的抗體依賴性清除和高毒性障礙。CaP對pH敏感的特點有助于酸性TME的中和，導致巨噬細胞由M2到M1的高度極化，從而提高抗腫瘤效果。此外，將葉酸摻雜到CaP中可以促進組裝OMV對腫瘤的主動靶向。還用光敏劑吲哚菁綠對組裝OMV進行功能化，以促進光熱誘導的免疫原性細胞死亡。被CaP包裹的OMVs也能夠有效地被動積聚在腫瘤區(qū)域，即使重復注射也是如此。用來覆蓋OMVs的CaP大大降低了OMVs的毒性，即使采取高劑量靜脈注射的方式將組裝OMVs輸送到實驗小鼠體內也沒有出現(xiàn)突發(fā)致死現(xiàn)象[20]。

有研究人員[12]將OMVs用于同時裝載紫杉醇和調控發(fā)育和DNA損傷反應1 (Redd1)-siRNA，以調控腫瘤代謝微環(huán)境，抑制腫瘤生長。在腫瘤微環(huán)境的pH6.8情況下，OMVs中的紫杉醇的釋放首先會被觸發(fā)，然后Redd1-siRNA被M2巨噬細胞吸收，增加M2型巨噬細胞糖酵解水平，將巨噬細胞的代謝表型從促進腫瘤進展的表型調控到抑制腫瘤進展的表型。在三陰性乳腺癌模型中，此OMVs對腫瘤相關巨噬細胞復極化、腫瘤抑制、腫瘤免疫激活和TME重塑具有巨大潛力。研究表明[25]，將OMVs與黑色素瘤細胞膜通過超聲的方式融合形成對黑色素瘤有特殊靶向作用的雜交仿生膜，再將其包裹于聚多巴胺納米顆粒。這樣的雜交膜進入實驗小鼠機體后會激活抗腫瘤免疫反應并造成部分腫瘤細胞的死亡，而后靶向并聚集在腫瘤位點，與腫瘤細胞接觸后被其內化，此時多巴胺發(fā)揮光熱治療作用進一步產(chǎn)生腫瘤殺滅效果?？鼓[瘤藥物多柔比星通過OMVs運輸用于治療腫瘤降低了其在實驗小鼠機體引起的副作用[11]。

4 OMVs用于獸醫(yī)臨床腫瘤治療的展望

細菌療法已經(jīng)出現(xiàn)多年了，從早期的直接應用野生型細菌，憑借細菌天然的對腫瘤環(huán)境的靶向與定植效應與腫瘤細胞接觸，到后來將細菌進行工程改造，降低其毒性，提高其對腫瘤的靶向性及殺傷能力。細菌的抗腫瘤研究取得了一定成果，但因其安全性和有效性問題，還仍未達到臨床轉化的水平。而OMVs來源于細菌，攜帶大量來自細菌的抗原及毒性分子，所以不可避免地需要考慮和細菌一樣減毒或去毒的問題，但是OMVs沒有活性，所以它的應用比細菌更容易把控。而同樣是進行基因改造，OMVs被細菌產(chǎn)出后不存在突變的情況，這使得OMVs的安全性有了可控的保障。此外，對于藥物的裝載，OMVs擁有比細菌小的多的體積，易于將藥物由血液循環(huán)帶到特定的治療位點，且有載藥效率高的特點。

腫瘤性疾病在獸醫(yī)臨床是一類高發(fā)疾病，雖然一部分病例能夠通過常規(guī)的手術、化療或放療治愈或控制，但仍有很多問題亟待解決。比如IL-2獲得美國食品藥品管理局許可用于轉移性腎細胞癌和黑色素瘤的免疫治療，且證明對犬腫瘤有治療效果[26]。但是直接注射IL-2對機體存在嚴重毒性，比如可導致毛細血管滲漏綜合征。運用生物載體將IL-2輸送到腫瘤組織是保留其腫瘤療效和避免其毒性的一個有效的方法。但是將表達IL-2的細菌直接進行靜脈注射有產(chǎn)生嚴重不良反應的風險，如血小板減少、貧血、持續(xù)性菌血癥等，雖然口服可以避免這種風險，但似乎也會失去細菌原有的抗腫瘤效應。而OMVs具有類似細菌的抗腫瘤作用，且產(chǎn)生毒性的風險低于細菌，更合適作為向機體遞送藥物的生物載體。此外，OMVs經(jīng)培養(yǎng)細菌就可獲得，經(jīng)濟成本較低，若成功開發(fā)出成熟的基于OMVs的抗腫瘤制劑，即可以批量生產(chǎn)，減輕臨床上治療腫瘤的費用昂貴的壓力，用于寵物行業(yè)以及野生動物，提高動物福利。雖然細菌外膜囊泡用于獸醫(yī)臨床的應用研究還未見報道，但筆者認為這項研究的意義是深遠的，可能會為動物腫瘤性疾病的治療提供理論依據(jù)和支持，也可能為人類腫瘤研究提供重要的動物模型參考，這將具有重要的比較醫(yī)學和臨床轉化的意義。

5 結語

綜上所述，與傳統(tǒng)腫瘤治療方法相比，基于OMVs的療法有著它獨特的優(yōu)勢，可以避免細菌療法所產(chǎn)生的臨床應用問題。而且OMVs可以隨著細菌的大量繁殖即得到極高的產(chǎn)量，可實現(xiàn)大量提取，所以非常有利于研究人員對其的研究與開發(fā)。相信在未來，憑借生物工程技術的發(fā)展及研究人員的深入探索，OMVs有望成為理想的抗腫瘤免疫反應激活劑和腫瘤治療藥物傳遞平臺，為人類和動物臨床上的腫瘤治療提供經(jīng)濟有效的手段。