豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因測序的臨床應(yīng)用

張振東，王 聰，王小泉，李 豪，卞 婷，李 智，曲向陽*

(1．江蘇科技大學，江蘇鎮(zhèn)江 212018；2.中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100070；3.南京博維特健康管理有限公司，江蘇南京 211800)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種以母豬的繁殖障礙及豬呼吸障礙為主要特征的病毒性疾病。PRRSV最早分離于20世紀90年代，是一種呈球形、有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子大小為60 nm～65 nm，基因組全長約15.4 kb，主要分為PRRSV 1(歐洲型)和PRRSV 2(美洲型)[1]。PRRSV具有快速變異與演化的特性，由于我國養(yǎng)殖密度大且生豬及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，頻繁的國外引種、生豬調(diào)運以及PRRSV減毒活疫苗(modified live virus，MLV)的無序使用等各種問題普遍存在，PRRSV在多種篩選壓力下進行著廣泛的變異與演化，自然變異毒株、疫苗演化毒株及重組毒株層出不窮，給我國PRRS的防控帶來了極大挑戰(zhàn)[2-4]?；驕y序是一種基因檢測技術(shù)，隨著二代測序技術(shù)的出現(xiàn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學中未知病原體的鑒定、耐藥基因的檢測、遺傳病的早期篩查、腫瘤的早期診斷及精準治療等各個方面[5-6]。在病毒學研究領(lǐng)域，基因測序主要應(yīng)用于病毒基因組研究以及病毒的遺傳演化規(guī)律。近年來，基因測序在PRRSV臨床診斷、鑒定及防控過程中的應(yīng)用逐漸增多，但根據(jù)筆者調(diào)查了解，多數(shù)從業(yè)者對PRRSV基因測序的目的與意義認識不夠，甚至存在一些誤區(qū)。因此，本文對PRRSV基因測序在臨床中的實際應(yīng)用及問題進行綜述，以期為我國PRRSV的臨床指導及科學防控提供參考。

1 我國PRRSV的遺傳變異與演化

自PRRSV在我國出現(xiàn)以來，其發(fā)生了廣泛的變異與演化，大量的PRRSV毒株被分離，但主要以PRRSV 2的散發(fā)與流行為主[7]。有研究對8624個PRRSV 2的ORF5基因序列進行了遺傳演化分析，將PRRSV 2劃分為9個譜系[8]，我國PRRSV 2的主要流行毒株為譜系1、3、5、8[2,7,9]。從發(fā)病豬場流產(chǎn)胎兒樣本中分離到毒株CH-1a，是我國第1個PRRSV分離毒株[10]，CH-1a及其疫苗毒株CH-1R屬于譜系8；1997年分離到1株與PRRSV 2原始毒株VR2332高度同源的毒株BJ-4[11]，屬于譜系5，包括VR2332的疫苗毒株RespPRRS以及R98毒株。另外，以CH-1a及VR2332等為代表的nsp2區(qū)域未發(fā)生缺失的毒株在我國也常被稱為“經(jīng)典毒株”。2006年，我國暴發(fā)以nsp2區(qū)域存在30個氨基酸缺失為分子特征的高致病性PRRSV毒株(HP-PRRSV)，臨床上以“高熱、高發(fā)病率、高致死率”為主要特征，常見參考毒株包括JXwn06、JXA1、TJ、HuN4等野毒株及JXA1疫苗毒株JXA1-P80、TJ疫苗演化毒株TJbd14-1及HuN4疫苗演化毒株HeN1201[2-3]，屬于譜系8。2013年以來，NADC30-like毒株傳入我國，參考毒株為NADC30及CHsx1401等[12]，屬于譜系1；2017年，我國分離到NADC34-like毒株，參考毒株為NADC34及HLJDZD32-1901等[13]，屬于譜系1。此外，我國華南部分地區(qū)散發(fā)流行QYYZ-like毒株[14]，常見參考毒株為QYYZ及GM2等，屬于譜系3。我國PRRSV 1的案例及分離毒株鮮有報道，常見參考毒株為PRRSV 1原始毒株LV、變異株Lena及我國分離到的Amervac疫苗演化毒株GZ11-G1[15-17]。

了解我國PRRSV的發(fā)生、流行及演化，熟悉各譜系常見參考毒株，是進行PRRSV基因測序后遺傳演化分析的關(guān)鍵和前提。

2 PRRSV基因測序的臨床應(yīng)用

PRRSV全長核苷酸約15.4 kb，主要包括nsp1α、nsp2等16個非結(jié)構(gòu)蛋白和GP2a、E、GP3、GP4、GP5、M、N以及GP5a等結(jié)構(gòu)蛋白[18]。臨床實際中，ORF7(N蛋白)、ORF5(GP5蛋白)以及nsp2常用作檢測靶標。其中，N蛋白保守性較高，常用作PRRSV感染后的疫病診斷檢測，不適用于遺傳演化分析；nsp2是PRRSV基因組中最大的蛋白，存在不同形式的堿基插入、缺失及突變，常被用作分子流行病學調(diào)查，但其擴增效率相對較低；GP5基因序列是PRRSV譜系劃分的依據(jù)，各毒株間亦存在較大的差異，因此臨床實際中GP5最常被應(yīng)用于PRRSV檢測及測序的靶標[19]。

PRRSV基因測序的臨床應(yīng)用主要包括4個方面。①PRRSV的分子流行病學調(diào)查。根據(jù)我國生豬養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)，PRRSV的分子流行病學調(diào)查可從豬場、公司/體系、養(yǎng)殖小區(qū)、區(qū)域以及國家五個維度開展。一個豬場內(nèi)不同豬群(比如母豬群與保育豬群)、一個公司或同一體系內(nèi)、以鎮(zhèn)或縣為單位的養(yǎng)殖小區(qū)內(nèi)、以市或省為單位的區(qū)域內(nèi)以及國家水平上的PRRSV分子流行病學調(diào)查，通過對大量分離毒株及其現(xiàn)場表現(xiàn)規(guī)律的積累，對深入了解我國PRRSV的流行、發(fā)生以及防控具有重要意義。②PRRSV追溯系統(tǒng)的建立。PRRSV可通過豬只、精液、車輛、人員、物資、空氣、疫苗等多個途徑入侵豬群，PRRS暴發(fā)后，對PRRSV毒株的來源、傳播及感染途徑的追溯性調(diào)查對PRRSV的及時防控及決策制定具有重要的指導意義。尤其當同一個體系內(nèi)的不同豬場流行毒株不一致時，往往會因為后備豬只的調(diào)入、人員的交叉、車輛的混用等途徑導致發(fā)病。③“新”毒株的檢測。新毒株主要指從來沒有的毒株，比如美國正在流行1-4-4毒株；自然變異毒株，比如2006年暴發(fā)的自然變異的HP-PRRSV；陽性穩(wěn)定豬群的異源毒株，比如MLV免疫豬場的非MLV毒株(或者稱野毒株)。④后備母豬馴化毒株的確認。尤其適用血清(野毒株)進行馴化時，需要對野毒株進行基因測序，便于后續(xù)的持續(xù)跟蹤監(jiān)測。

3 PRRSV基因測序臨床應(yīng)用的誤區(qū)

雖然生物安全是PRRS防控的首要原則，但在實際生產(chǎn)過程中，科學合理使用PRRSV減毒活疫苗(MLV)仍是較為行之有效的措施，尤其在陽性豬群引種時后備豬只入群前的免疫馴化及排毒監(jiān)測等工作非常關(guān)鍵。我國PRRSV疫苗毒株眾多，疫苗毒株如何選擇？PRRSV毒株同源性越高，保護效力越好[20]，在實際生產(chǎn)中往往也是如此選擇，但并不能以偏概全。通過比較我國PRRSV流行毒株的全長核苷酸及ORF5基因序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典毒株MLV CH-1R與RespPRRS MLV全長基因組及ORF5核苷酸序列同源性分別為91.3%和91.0%，與HP-PRRSV MLV同源性分別為95.0%和95.0%；經(jīng)典毒株RespPRRS MLV與HP-PRRSV MLV同源性分別為90.0%和89.0%；HP-PRRSV MLV與HP-PRRSV MLV同源性分別為99.0%和99.0%；NADC30-like與CH-1R同源性分別為85.0%和87.0%；NADC30-like與RespPRRS MLV同源性分別為85.0%和86.0%；NADC30-like與HP-PRRSV MLV同源性分別為85.0%和86.0%(不同毒株間略有差異，但不超過1%)。因此，經(jīng)典毒株與HP-PRRSV毒株之間全長核苷酸的同源性差異較大，序列比對后選擇同源性較高的疫苗毒株對指導生產(chǎn)是非常有幫助的(非重組毒株)。但同為高致病性疫苗毒株，同源性均高達99%以上，比對后選擇高致病性疫苗毒株并無意義。NADC30-like毒株與現(xiàn)有疫苗毒株的同源性均為85%左右，所以從同源性上分析篩選針對NADC30-like毒株的疫苗毒株，同樣是無意義的。此外，現(xiàn)場PRRS發(fā)病案例中NADC30-like及其與疫苗演化毒株的重組毒株已為主流毒株，僅檢測ORF5單個片段(603 bp，全長約15 400 bp)已然不能代表分離毒株的全貌，所以僅靠ORF5序列比對同源性后選擇疫苗毒株，更加不具有代表性[21]。因此，通過檢測個別片段序列，比對PRRSV分離毒株與疫苗毒株序列的同源性大小，進而篩選疫苗毒株的方法是不可取的。

4 展望

近年來，我國PRRSV流行毒株復雜化程度加劇，尤其不同譜系甚至多譜系毒株之間的重組毒株逐漸增多，為更好地了解臨床致病毒株的基因組序列，建議采用擴增多個片段(GP5、GP3、GP2、nsp2、nsp9等)后進行測序分析的方式，也可與科研院所合作進行PRRSV全基因組測序。此外，隨著核酸測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，二代測序尤其新興的三代測序等高通量測序技術(shù)在臨床病原檢測中展示了極強的應(yīng)用前景[22-23]，并已廣泛應(yīng)用于人類及動物重大病原體的檢測及全基因組測序分析工作中[24-25]，其在PRRSV基因測序中的臨床應(yīng)用及價值值得進一步探索與評估?？傊驕y序在我國PRRSV的分子流行病學調(diào)查及其科學防控過程中的作用越來越重要，只有明確測序的目的與意義，不盲目測序，適時適當?shù)目茖W監(jiān)測，建立不同層級的PRRSV毒株及臨床表征數(shù)據(jù)庫，才能真正為我國PRRS的防控帶來幫助。