基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討參知健腦方防治阿爾茨海默病的作用機(jī)制

劉川銘，李謝 ，盧熙奎，曾點(diǎn)點(diǎn)，李畏嫻

1 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；3 昆明市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，云南昆明 650041

阿爾茨海默?。ˋD）是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的神經(jīng)退行性疾病。AD 的主要病理特征是β-淀粉樣蛋白（Aβ）在神經(jīng)元胞外聚集形成淀粉樣斑塊以及胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白Tau 的過度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs），還包括突觸功能障礙、線粒體損傷、miRNA 的失調(diào)、特異性神經(jīng)遞質(zhì)減少和神經(jīng)炎癥等多種病理過程［1］。因此，如何防治和延緩AD 已成為現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)之一。參知健腦方是基于王永炎院士提出的“正虛毒損絡(luò)阻”病機(jī)學(xué)說而創(chuàng)立的中藥復(fù)方，全方由人參、知母、赤芍三味中藥組成。多項(xiàng)研究［2-4］表明，人參、知母和赤芍中的活性成分均具有改善癡呆動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶的能力，從而改善其認(rèn)知功能。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)參知健腦方中的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)生物信號(hào)通路等幾個(gè)方面的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了探討，探究人參、知母、赤芍中潛在活性成分治療AD 的作用機(jī)制，并采用分子對(duì)接方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 參知健腦方中活性成分篩選與潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，https：//old. tcmsp-e. com/tcmsp. php）、本草組鑒（HERB，http：//herb. ac. cn/）和中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（TCMIP，http：//www. tcmip. cn/TCMIP/index. php/）等數(shù)據(jù)庫(kù)，分別以“人參”“知母”“赤芍”作為關(guān)鍵詞檢索其含有的活性成分，并通過查閱文獻(xiàn)進(jìn)行手工篩選以確定活性成分。如有文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇是一種神經(jīng)保護(hù)特性的多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌和抗淀粉樣蛋白等作用［5］，而人參皂苷Rg1 可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力介導(dǎo)的途徑來抑制NFTs和Aβ的積累［6］。使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 作為篩選條件［7］。隨后利用SwissTarget（http：//swisstargetprediction.ch/）、PharmMapper（http：//www. lilab-ecust. cn/pharmmap?per/）和 SEA（https：//sea. bkslab. org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)查詢各活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，并將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行校正，獲取靶點(diǎn)官方基因名。

1.2 AD 潛在靶點(diǎn)的收集 利用DisGeNET（https：//www. disgenet. org/home/）數(shù)據(jù)庫(kù)以“Alzheimer's dis?ease”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取跟AD 相關(guān)的靶點(diǎn)，將上述獲得的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Ven?ny2.1.0（https：//bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/）平臺(tái)進(jìn)行映射取交集，獲取藥物治療疾病的關(guān)鍵作用基因。

1.3 藥物—活性成分—疾病—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將上一步得到的關(guān)鍵作用基因，即藥物活性成分作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的共有基因，以及對(duì)應(yīng)的活性化合物導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件中，構(gòu)建藥物—活性成分—疾病—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將上述映射得到的關(guān)鍵作用基因以gene symbol 形式上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），物種選擇為“人類（Homo sapiens）”，設(shè)置最低相互作用閾值“high confidence（?0.7）”，并隱藏游離節(jié)點(diǎn)，得到蛋白相互作用信息。將得到的相互作用參數(shù)導(dǎo)入Cy?toscape3.7.1 軟件構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，通過“Network Analyzer”插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取度值（degree）高于平均數(shù)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.5 GO 分析與KEGG 通路富集分析 將上述關(guān)鍵作用基因上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行富集分析，篩選P<0.01 的前 20 個(gè)條目，借助微生信在線平臺(tái)（http：//www. bioinfor?matics.com.cn/）進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，以闡釋參知健腦方中活性成分治療AD 的生物功能以及相關(guān)信號(hào)通路。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 通過PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www. rcsb. org/）下載核心靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用PyMOL 軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去除水分子、分離原配體等操作，并借助ChemOffice 軟件繪制活性化合物的3D 結(jié)構(gòu)并使其能量最小化，通過Autodock-Vina 1.1.2 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并選取其中結(jié)合能最小的對(duì)接模型，一般認(rèn)為結(jié)合能小于-5 kJ/mol 時(shí)配體與受體可以較好地結(jié)合，最后采用PyMOL 軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)接結(jié)果可視化，建立對(duì)接相互作用模式圖。

2 結(jié)果

2.1 參知健腦方中活性成分的獲取結(jié)果 通過TCMSP、HERB、TCMIP 數(shù)據(jù)庫(kù)以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，共獲取人參活性成分27 個(gè)、知母活性成分17 個(gè)、赤芍活性成分 15 個(gè)，利用 SwissTarget、PharmMapper 和SEA等平臺(tái)挖掘活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)分別為人參833 個(gè)、知母687 個(gè)、赤芍493 個(gè)。藥物部分活性成分信息見表1~3。

表1 人參活性成分部分篩選結(jié)果

表2 知母活性成分部分篩選結(jié)果

表3 赤芍活性成分部分篩選結(jié)果

2.2 參知健腦方治療AD 的作用靶點(diǎn) 利用Dis?GeNET數(shù)據(jù)庫(kù)以“Alzheimer's disease”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取跟AD 有關(guān)的靶點(diǎn)共2 601 個(gè)，人參、知母、赤芍的作用靶點(diǎn)合并去重后與AD 相關(guān)靶點(diǎn)取交集，最終獲得425 個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。利用Venny 2.1.0 在線作圖工具繪制出藥物—AD 共有靶點(diǎn)的Venn圖。見圖1。

圖1 藥物-AD共有靶點(diǎn)Venn圖

2.3 參知健腦方中治療AD的關(guān)鍵有效成分 利用Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建藥物—活性成分—疾病—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，得到一個(gè)488 個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 826 條邊的網(wǎng)絡(luò)。見圖2。節(jié)點(diǎn)之間的連線表示藥物—活性成分—AD—靶點(diǎn)之間的靶向關(guān)系，連線越多越密集，表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)核心地位。通過cytoHub?ba 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，選取degree 值大于平均節(jié)點(diǎn)連接度的成分作為參知健腦方治療AD 的關(guān)鍵有效成分，排名靠前的化合物分別為白藜蘆醇、山奈酚和芍藥苷等。詳見表4。

表4 參知健腦方治療AD主要活性成分的節(jié)點(diǎn)度排名

圖2 藥物—活性成分—AD—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 參知健腦方治療AD 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 參知健腦方治療AD 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。該網(wǎng)絡(luò)共包含100 個(gè)節(jié)點(diǎn)791 條邊，其中節(jié)點(diǎn)顏色深淺與degree成正相關(guān)。顏色越紅，則degree越高，表明這些蛋白占據(jù)該網(wǎng)絡(luò)的核心地位。利用“Network Analyzer”插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取degree 高于平均數(shù)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，篩選得到APP、MAPK1、TNF等核心靶點(diǎn)。見表5。

表5 參知健腦方治療AD核心靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

圖3 參知健腦方治療AD關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖

2.5 參知健腦方治療AD 關(guān)鍵作用基因的GO 與KEGG 分析結(jié)果 將上述425 個(gè)關(guān)鍵作用基因上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共獲取914個(gè)GO 條目，其中包括生物過程（BP）637 個(gè)，主要涉及對(duì)缺氧的響應(yīng)、細(xì)胞凋亡過程的負(fù)向調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜鈣離子濃度的正向調(diào)節(jié)以及對(duì)氧化應(yīng)激的響應(yīng)等方面；細(xì)胞組成（CC）108 個(gè)，主要涉及細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞膜膜筏、神經(jīng)元胞體和投射神經(jīng)元等；分子功能（MF）169 個(gè)，主要涉及酶結(jié)合、乙酰膽堿結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性和氧化還原酶活性等。見圖4A。

KEGG 信號(hào)通路富集分析共獲得53 條通路，根據(jù)P<0.01，取排名前20 的通路借助微生信在線平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。見圖4B。通路結(jié)果中主要涉及AD、細(xì)胞凋亡、鈣信號(hào)通路和TNF 信號(hào)通路等。

圖4 關(guān)鍵作用基因的GO與KEGG分析

2.6 AD 相關(guān)核心靶點(diǎn)與主要有效成分的分子對(duì)接 選取節(jié)點(diǎn)連接度排名靠前的6 個(gè)核心成分，分別與排名靠前的8 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，蛋白基本信息見表6。分子對(duì)接結(jié)果顯示，各化合物與目標(biāo)受體蛋白對(duì)接的結(jié)合能均小于-5 kJ/mol，以結(jié)合能值最低的藥物—靶點(diǎn)組合繪制分子對(duì)接模式圖，見圖5A~D。

圖5 核心成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接模式圖

表6 PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的疾病相關(guān)靶點(diǎn)蛋白信息

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，其整合了靶標(biāo)、藥物和疾病作為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)，它們之間的聯(lián)系作為邊，利用網(wǎng)絡(luò)分析來觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響，從而推斷藥物活性成分對(duì)疾病的治療作用和作用機(jī)制。

本研究預(yù)測(cè)參知健腦方中發(fā)揮治療AD 的有效成分主要為白藜蘆醇、山奈酚、芍藥苷、人參皂苷Rg1 和β-谷甾醇。白藜蘆醇作為SIRT1 的有效激活劑［8］，通過激活 SIRT1 依賴性的 ADAM10 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，增加了α-分泌酶的生成并提高其活性，從而降低 Aβ 的產(chǎn)生［9］。白藜蘆醇還可通過調(diào)節(jié) AMPKSIRT1介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路或miRNA介導(dǎo)的信號(hào)通路來控制Tau的過度磷酸化、神經(jīng)炎癥、BACE1活性和 Aβ 在 AD 中的積聚，從而對(duì)抗 AD［10］。氧化應(yīng)激是細(xì)胞死亡的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制，腦內(nèi)ROS 的過量產(chǎn)生被認(rèn)為是多種神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的根本原因，YANG 等［11］采用不同濃度的白藜蘆醇處理含有Aβ1-42的PC12 細(xì)胞，核因子紅系 2 相關(guān)因子（Nrf）與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的結(jié)合可調(diào)節(jié)一組抗氧化/解毒基因的表達(dá)，這些基因協(xié)同作用以通過連續(xù)的酶促反應(yīng)清除ROS。有研究［12］以Aβ25-35損傷的嗜鉻細(xì)胞瘤（PC-12）細(xì)胞作為AD 的體外模型以探究山奈酚對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制，研究結(jié)果表明山奈酚可通過ER/ERK/MAPK 信號(hào)通路以劑量依賴性的方式保護(hù)PC-12 細(xì)胞免受Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。KOUHESTANI 等［13］研 究 了 山 奈 酚 對(duì) 卵 巢 切 除（OVX）大鼠AD 模型的認(rèn)知障礙、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)過氧化和神經(jīng)炎癥標(biāo)志物的影響，結(jié)果表明山奈酚能夠減輕鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的OVX 大鼠的記憶障礙，腦組織中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等抗氧化酶的水平明顯升高，而TNF-α 和丙二醛水平顯著降低，山奈酚在此實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了神經(jīng)保護(hù)作用。芍藥苷通過抑制由糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）和NF-κB 信號(hào)通路以及核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3 炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，對(duì)APP 和PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用［14］，此外，芍藥苷可通過降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量，抑制鈣蛋白酶活化，從而干擾鈣蛋白酶/蛋白激酶 B（Akt）/GSK-3 信號(hào)通路，最終減少了岡田酸誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）中過度磷酸化的Tau 蛋白［15］。人參皂苷Rg1 是人參總皂苷中活性最顯著的相關(guān)成分，其對(duì)突觸功能可塑性及神經(jīng)發(fā)生、Aβ水平、線粒體功能、膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥過程等方面的影響可用于治療AD［16］。Ach 是副交感神經(jīng)系統(tǒng)中的主要神經(jīng)遞質(zhì)，AD患者腦內(nèi)該神經(jīng)遞質(zhì)水平較正常人具有明顯的異常，CHOI等［17］的研究結(jié)果表明Rg1對(duì)誘導(dǎo)AD的AChE、BChE、BACE1均具有明顯的抑制作用，且具有用于開發(fā)AD 預(yù)防或治療藥物的潛力。β-谷甾醇作為植物甾醇，是甾醇類成分中的主要成分之一，具有多種生物活性和藥理作用［18］。SHI 等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，以膽固醇螯合劑2-羥丙基-β-環(huán)糊精（HPβCD）為載體，β-谷甾醇進(jìn)入線粒體后可提高線粒體內(nèi)膜的流動(dòng)性，增加線粒體跨膜電位和ATP 含量，線粒體中ATP 水平的治療性提升則有益于改善AD等神經(jīng)退行性疾病。

由PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選得到20 個(gè)核心靶點(diǎn)，其中APP、MAPK 和TNF 等排名靠前的核心靶點(diǎn)可能在AD 的治療過程中發(fā)揮較為重要的作用。APP作為淀粉樣前體蛋白是一種Ⅰ型單通道跨膜蛋白，在人體中廣泛存在，其通過淀粉樣代謝途徑得到的Aβ1-42具有較強(qiáng)的毒性和疏水性，并且更易聚集，其聚集體在腦內(nèi)被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬并釋放出炎癥因子引起神經(jīng)損傷，產(chǎn)生慢性退行性神經(jīng)病變，最終可導(dǎo)致AD 的發(fā)生。上調(diào)α-分泌酶活性并抑制β-分泌酶（如BACE1）和γ-分泌酶活性是減少Aβ 形成的重要因素，因此通過影響APP 代謝過程中的Aβ 分泌酶可能作為AD 的潛在治療靶點(diǎn)。APP 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體網(wǎng)絡(luò)中可進(jìn)行泛素化、磷酸化、糖基化和棕櫚?；纫幌盗械姆g后修飾［20］，在 Aβ 的沉積過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，針對(duì)APP 翻譯后修飾相關(guān)調(diào)控過程的研究將有助于AD 藥物靶點(diǎn)的選擇。TNF-α是腦淀粉樣斑塊附近小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的最主要的炎癥細(xì)胞因子之一，小膠質(zhì)細(xì)胞聚集在AD 患者和動(dòng)物模型的淀粉樣斑塊周圍，表達(dá)細(xì)胞表面受體，如CD36、A1 型清道夫受體、RAGE（晚期糖基化終產(chǎn)物受體）和Toll 樣受體（TLRs），這些受體能夠與Aβ 相結(jié)合，結(jié)合后的Aβ激活小膠質(zhì)細(xì)胞以增加MHCⅡ類分子的表達(dá)以及細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）和趨化因子（如CCL2、MIP-1α）的產(chǎn)生，從而觸發(fā)外周單核細(xì)胞通過血腦屏障的遷移［21］?；罨纳窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞引起的大腦急性炎癥反應(yīng)是有益的，可以修復(fù)大腦的受損區(qū)域并有助于恢復(fù)大腦穩(wěn)態(tài)，但如果炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)慢性持續(xù)狀態(tài)且不受控制，小膠質(zhì)細(xì)胞被長(zhǎng)期激活，不斷地釋放促炎介質(zhì)，增加氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激，將加重AD 等神經(jīng)退行性疾病。MAPK1 和MAPK3 是MAPK 的家族成員，在許多有關(guān)細(xì)胞增殖的信號(hào)通路中具有重要作用，可參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、癌變 和 凋 亡 ，MAPK1/ERK2 和 MAPK3/ERK1 是 在MAPK/ERK 級(jí)聯(lián)中發(fā)揮重要作用的兩個(gè)MAPKs。MAPK 信號(hào)通路主要由ERK 信號(hào)通路、p38 信號(hào)通路和JNK 信號(hào)通路組成，p38MAPK 是該家族中Aβ誘導(dǎo)毒性的最重要的調(diào)節(jié)器，p38 誘導(dǎo)NF-κB 的激活、谷氨酸興奮性毒性和突觸可塑性的破壞，這些都是證明p38MAPK是打破Aβ毒性惡性循環(huán)的潛在靶點(diǎn)［22］。LIU 等［23］對(duì)注射 Aβ 的大鼠采用腹腔注射硫氫化鈉進(jìn)行治療，NaHS 抑制IκB-α 的降解和 NF-κB的激活，以及抑制Aβ 誘導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）活性和p38MAPK 活性，顯著減輕了Aβ1-42所引起的認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)炎癥。有研究表明［24］，阻斷 ERK1/2 和 p38 通路還可減少小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，從而減輕腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。CAT（過氧化氫酶）是一種存在于人體正常組織中的抗氧化酶，可抑制脂質(zhì)過氧化物在細(xì)胞中的聚集，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)元和細(xì)胞的損傷。據(jù)報(bào)道［25］，Aβ 刺激細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制可能是：Aβ與過氧化氫酶的直接結(jié)合導(dǎo)致其催化活性降低，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激條件，此外，全長(zhǎng)的β 淀粉樣肽在其N 位末端可與Cu2+結(jié)合并將其還原為Cu+，而β 淀粉樣-Cu+的復(fù)合物可導(dǎo)致過氧化氫的產(chǎn)生，因此，過氧化氫酶與AD 的發(fā)病機(jī)制有直接或間接的關(guān)系。

關(guān)鍵作用靶點(diǎn)通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，排名靠前的KEGG 通路富集結(jié)果即為AD 相關(guān)信號(hào)通路，體現(xiàn)出參知健腦方對(duì)治療AD 具有較強(qiáng)的靶向性。此外，其他富集通路還涉及細(xì)胞凋亡、腎素—血管緊張素系統(tǒng)（RAS）、羥色胺能神經(jīng)突觸通路、鈣信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路和 TNF 信號(hào)通路。有研究［26］表明，AD 患者腦內(nèi)RAS 活性增強(qiáng)，RAS 被激活后，腦內(nèi) ACE 和 AngⅡ表達(dá)增加可直接損害AD 患者的認(rèn)知功能。細(xì)胞內(nèi)鈣水平的增加會(huì)觸發(fā)囊泡遞質(zhì)的釋放，耗盡細(xì)胞內(nèi)的遞質(zhì)儲(chǔ)存，這一過程可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元功能衰竭，此外Aβ 可破壞細(xì)胞的鈣平衡，大量Ca2+內(nèi)流可激活Ca2+依賴性酶，進(jìn)而引發(fā)線粒體功能紊亂和細(xì)胞凋亡［27］。據(jù)報(bào)道［28］，5-HT 活性增強(qiáng)能夠改善正常老齡人群和AD 患者的記憶力，而由5-HT 消耗所引起的腦內(nèi)5-HT 水平的下降則使他們的記憶力受到了損害。cAMP 作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，是由GPCRs 與神經(jīng)遞質(zhì)、激素等信號(hào)分子的配體結(jié)合后刺激激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）催化ATP 環(huán)化而形成的，其在代謝、分泌、鈣穩(wěn)態(tài)和基因轉(zhuǎn)錄等生理過程中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在神經(jīng)元中，cAMP 可通過增加海馬突觸和小腦浦肯野纖維神經(jīng)元突觸的神經(jīng)遞質(zhì)釋放來誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）［29］，LTP則是神經(jīng)元突觸可塑性的直接表現(xiàn)形式，LTP 增強(qiáng)會(huì)促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力，而LTP 減弱會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的下降。TNF按其結(jié)構(gòu)可分為 TNF-α 和 TNF-β，其中 TNF-α 可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并導(dǎo)致細(xì)胞壞死，還能促進(jìn)IL-1、IL-2 和IL-6 的產(chǎn)生和分泌，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TNF-α可增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)，推動(dòng)神經(jīng)炎癥過程，有研究［30］發(fā)現(xiàn)，TNF-α的表達(dá)水平與AD患者的癥狀呈正性相關(guān)，抑制TNF-α 的表達(dá)可改善AD 患者的認(rèn)知能力。

綜上所述，參知健腦方中的有效成分可能作用于APP、MAPK、TNF 等靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、鈣信號(hào)通路和TNF 信號(hào)通路等途徑來減少Aβ 的生成和減輕氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)損傷，從而抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，最終起到神經(jīng)保護(hù)和改善認(rèn)知能力的作用。此外，基于分子對(duì)接預(yù)測(cè)得到的結(jié)果顯示，這些成分與靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合能力，可能為治療AD 過程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵藥效成分。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物作用機(jī)制的預(yù)測(cè)仍存在一定的局限性，所以后期仍需要對(duì)主要活性成分以及關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明劉川銘：研究設(shè)計(jì)，文章撰寫；李謝：參與研究設(shè)計(jì)，繪制文章中的圖片；盧熙奎：參與研究設(shè)計(jì)，并完善文章部分內(nèi)容；曾點(diǎn)點(diǎn)：指導(dǎo)論文撰寫，繪制文章中的圖片；李畏嫻：論文指導(dǎo)