干細胞在糖尿病創(chuàng)面愈合中的應用進展

溫作君，朱冰 ，孫杰，顧隆森

1 安吉縣第三人民醫(yī)院骨科，浙江湖州 313300；2 安吉縣第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江湖州 313300

糖尿病是一種高發(fā)的代謝紊亂性疾病，其引起的神經(jīng)、微血管和大血管病變以及免疫反應低下可導致創(chuàng)面愈合不良［1］。創(chuàng)面愈合困難經(jīng)常因組織缺血或持續(xù)的壓力而加劇，特別是在足部，如果沒有得到適當?shù)闹委煟罱K可導致截肢。研究表明，糖尿病足潰瘍（DFU）的治療成本是非 DFU 的十倍［2］，且DFU 的直接成本和患者 5 年生存率與癌癥相當［3］。因此，探索改善糖尿病創(chuàng)面愈合的創(chuàng)新療法有利于減輕該疾病對患者和社會的負擔。近年越來越多的證據(jù)表明，干細胞療法有利于組織再生和創(chuàng)面愈合［4］?，F(xiàn)從干細胞類型、干細胞的給藥途徑和干細胞的操縱技術(shù)三個方面展開綜述，為干細胞進一步應用于臨床治療糖尿病創(chuàng)面提供參考。

1 用于治療糖尿病創(chuàng)面的干細胞類型

1.1 成體（成人）干細胞 間充質(zhì)干細胞（MSC）是最常見的用于治療的體細胞。MSC 是一種具有自我更新能力的多能干細胞，存在于骨髓、脂肪組織、臍帶、胎盤和外周血等多種組織器官中［5］。在合適的條件下，MSC 可分化為成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞；也可分化為其他細胞類型，如內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞和皮膚附屬細胞。更重要的是，MSC 是營養(yǎng)工廠，可產(chǎn)生各種各樣的細胞因子和生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、血管生成素-1（Ang-1）和基質(zhì)衍生因子-1（SDF-1）［6］。這些因子有助于不同階段的創(chuàng)面愈合，其中一些因子還具有免疫調(diào)節(jié)功能，如增加抗炎因子IL-10、IL-4水平，降低TNF-α和IFN-γ水平［7］。這些因子還通過抗菌肽LL-37發(fā)揮抗菌作用，這對易感染的糖尿病創(chuàng)面非常有益［8］。因此，MSC是組織工程技術(shù)和皮膚再生細胞療法的理想細胞。

MSC 具有免疫豁免特性，因此在多個同種異基因移植人體臨床試驗中顯示出良好安全性。隨機臨床試驗的薈萃分析表明，無論年齡大小或潰瘍大小，自體干細胞均有助于治愈糖尿病潰瘍［9］。骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSC）是一種具有轉(zhuǎn)化前景的干細胞類型，適用于糖尿病創(chuàng)面的同種異體細胞和自體細胞治療。目前，BM-MSC 是糖尿病創(chuàng)面臨床前和臨床研究的首選細胞類型［10］。這可能是由于其臨床轉(zhuǎn)化效果較好和安全性良好。然而，BM-MSC 的分離具有很強的侵襲性，目前正在尋找其他更易獲得的替代來源，如脂肪、胎盤組織、臍帶。

有趣的是，對干細胞治療DFU 的文獻進行綜合分析發(fā)現(xiàn)，與臨床前研究相比，臨床研究中使用外周血干細胞的報道較多［10］。這種差異表明，更容易獲得的自體成人干細胞來源（如血液和脂肪）將更有可能在臨床上應用?；|(zhì)血管組分（SVF）是成人基質(zhì)/干細胞家族的新成員，是從脂肪組織提取出來的多種細胞的混合體，包括MSC、內(nèi)皮祖細胞（EPC）、調(diào)節(jié)性T細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞（SMC）、周細胞和脂肪前體細胞。富含高水平EPC和MSC的SVF有助于新生血管再生。HAN 等［11］研究結(jié)果顯示，SVF 可刺激糖尿病成纖維細胞的增殖和膠原合成，并縮短治愈時間，為DFU 提供一個簡單和有效的治療方法。最近一項臨床研究表明，SVF可以通過促進血管修復和血管化方式安全地加速創(chuàng)面愈合［12］。由于SVF較易在手術(shù)室中收集和處理，其可以作為即時治療方法。此外，SVF 可移植回患者體內(nèi)，避免了昂貴的GMP 實驗室處理。然而，目前SVF 臨床應用仍存在困難，包括缺乏標準的提取方案（尤其是在機械處理和酶處理方面）、膠原酶消化成本高，以及加工過程中可能存在污染風險。盡管存在這些障礙，SVF作為一種術(shù)中細胞治療方法，其應用前景是光明的。

1.2 誘導多能干細胞（iPSC） 盡管MSC 是一種有希望用于治療目的的細胞類型，但它們并沒有無限增殖能力，這限制了其在再生醫(yī)學領域的應用。TAKAHASHI 等［13］于 2006 年成功研發(fā) iPSC，他們將體細胞重新編程為多能干細胞，使其具有增殖能力和分化潛力，用于解決成人干細胞有限的問題。成年體細胞通過病毒或非病毒遞送系統(tǒng)誘導四種轉(zhuǎn)錄因子（通常為Oct4/Sox2/KLF4/cMyc 或Oct4/Sox2/NANOG/LIN28）的表達，可重編程為 iPSC。iPSC 最大的優(yōu)點是其無限分化為各種靶細胞的能力，可用于創(chuàng)面愈合的治療。此外，應用iPSC 還可避免胚胎干細胞（ESC）面臨的倫理問題。

越來越多研究發(fā)現(xiàn)iPSC 具有強大的治療潛力。KASHPUR 等［14］將 iPSC 衍生的成纖維細胞接種到3D 組織上，發(fā)現(xiàn)其可以長入糖尿病創(chuàng)面并促進創(chuàng)面愈合，表明iPSC 具有治療DFU 的潛力。最近，GORECKA 等［15］發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠模型中，將新生兒成纖維細胞的iPSC 分化為SMC（實驗組）并經(jīng)膠原基質(zhì)進行輸送，可加速小鼠創(chuàng)面愈合和創(chuàng)面床的新生血管生成。與對照組脂肪來源的MSC（ADSC）相比，實驗組SMC 在植入后7 d 仍存在于創(chuàng)面床上，并分泌更高水平的促血管生成細胞因子，加速創(chuàng)面閉合。此外，實驗組創(chuàng)面區(qū)域促炎癥相關的M1 型巨噬細胞數(shù)量減少，促再生作用的M2 型巨噬細胞數(shù)量增加。ITOH 等［16］將來源于健康者和隱性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥患者皮膚的iPSC 誘導分化為功能性真皮成纖維細胞和角質(zhì)細胞，并移植到3D 皮膚模型中用于創(chuàng)面治療［17］。另外一項研究使用人iPSC 分化的SMC 治療下肢缺血模型小鼠，小鼠下肢缺血狀況顯著改善［18］。上述這些研究表明iPSC是治療創(chuàng)面的理想細胞類型之一。

由于真皮層高度血管化，血液供應不良的慢性糖尿病創(chuàng)面使用常規(guī)方法愈合不佳。因此，優(yōu)化創(chuàng)面部位的新生血管生成是另一個至關重要的治療目標。MSC與內(nèi)皮細胞或EPC的共培養(yǎng)為快速微血管組裝提供了必要的原材料，進而增強血管連接。然而，內(nèi)皮細胞具有高度的免疫原性，因此不可能僅依賴同種異體來源的這些細胞，使用自體iPSC衍生的內(nèi)皮細胞可以解決這一難題。ABACI等［19］利用iPSC衍生的內(nèi)皮細胞結(jié)合新型3D生物打印技術(shù)成功創(chuàng)建血管網(wǎng)絡，并在小鼠模型中成功驗證。SHEN等［20］使用來自1型糖尿病患者和健康者的iPSC內(nèi)皮細胞生成帶血管的皮膚結(jié)構(gòu)，植入后3 d內(nèi)可實現(xiàn)宿主血管灌注。這種聯(lián)合組織工程技術(shù)有利于制造個性化的血管化皮膚。

盡管干細胞療法（包括MSC和iPSC）前景光明，但細胞表型變異可在不同的個體間發(fā)生，甚至在同一個體上發(fā)生，通常難以確定其總體療效。此外，存在一些安全問題，如培養(yǎng)過程中的潛在致突變性以及植入后未分化細胞的潛在致瘤性。未來需要進一步改進體細胞誘導技術(shù)，以實現(xiàn)更嚴格、更可靠的iPSC表型分析。

2 治療糖尿病創(chuàng)面干細胞的給藥途徑

目前，雖然有一些方法可以將干細胞運送到感興趣的部位，但由于缺乏標準化，很難對比它們的療效。由于糖尿病是全身性疾病，通過全身或局部注射干細胞治療糖尿病創(chuàng)面均是有益的。

全身給藥即將干細胞直接注射到血液循環(huán)中或肌肉中。干細胞全身給藥有助于緩解糖尿病的一些全身并發(fā)癥，例如使用脂肪來源的MSC或iPSC-SMC對肢體缺血進行血運重建，從而改善整體愈合環(huán)境［18，21］。值得注意的是，在靜脈輸注MSC時，大部分MSC 被困于肺部，這使得MSC 在給藥后體內(nèi)存留時間短暫［22］。因此，避免細胞被困于肺部可能會提高循環(huán)MSC 的存活率。采用動脈注射，如通過股動脈、頸動脈、左心室或腎動脈，可以避免這個問題［23］。雖然動脈給藥有利于MSC 靶向器官，但這種途徑增加了侵襲性和并發(fā)癥的風險。

雖然局部注射干細胞治療創(chuàng)面較簡單，但是存在細胞植入不良情形。一項研究顯示，局部注射BM-MSC 至創(chuàng)面后，第28 天僅檢測到2.5%的原始細胞［24］。為了改善植入效果，可在創(chuàng)面部位使用細胞基質(zhì)載體進行局部給藥。包含生物材料的支架一方面將干細胞輸送到需要再生的區(qū)域，另一方面直接促進創(chuàng)面愈合。研究發(fā)現(xiàn)，水凝膠和聚合物支架可誘導和維持MSC 活性，從而促進血管生成、免疫調(diào)節(jié)、基質(zhì)重塑和再生細胞因子的產(chǎn)生［25-26］。

單細胞轉(zhuǎn)錄組學有助于識別供體干細胞的再生潛力，以及通過使用亞群標記物潛在地幫助篩選和減少臨床使用干細胞的供體變異性。KHONG等［27］研究發(fā)現(xiàn)，與衰老BM-MSC 相比，年輕BM-MSC 含有較高比例的高表達組織再生相關基因細胞，有利于加速創(chuàng)面愈合。此外，使用單細胞轉(zhuǎn)錄組學可以識別創(chuàng)面不同空間區(qū)域的基因表達差異，有利于特異性治療創(chuàng)面，加速創(chuàng)面愈合。因此，利用單細胞轉(zhuǎn)錄組學輔助局部或全身個性化治療創(chuàng)面具有廣泛應用前景。

3 治療糖尿病創(chuàng)面干細胞的操縱技術(shù)

通過干細胞操縱可以幫助宿主細胞歸巢至創(chuàng)面部位，主要包括增加循環(huán)干細胞、增強細胞與創(chuàng)面部位的結(jié)合、促進干細胞分化為目標細胞以及增加血管生成。到目前為止，促進創(chuàng)面的新生血管生成是創(chuàng)面愈合的最重要目標，因為它是促進創(chuàng)面愈合過程的限制因素。以下討論了為實現(xiàn)這一目標而在干細胞操縱方面取得的各種進展。

3.1 支架微環(huán)境 支架基質(zhì)可用于操縱干細胞微環(huán)境，以增強其促再生能力。DASH 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，支架膠原纖維密度可通過調(diào)節(jié)iPSC-SMC 的分泌功能提高細胞的再生能力。密集的纖維狀膠原可增加促愈合細胞因子產(chǎn)生，如VEGF、IL-8、IL-10、TGF-β和角質(zhì)形成細胞生長因子（KGF），以及增加內(nèi)皮細胞增殖和遷移。應用生物活性聚合物對支架進行表面修飾也會影響干細胞的行為。例如，添加層粘連蛋白和透明質(zhì)酸可提高細胞存活率，并促進種植細胞產(chǎn)生VEGF［29］。此外，支架微環(huán)境中的分子間鍵通過物理作用調(diào)節(jié)細胞增殖和分化。例如，MSC 在不同硬度（0.1~25 kPa）的聚丙烯酰胺水凝膠中培養(yǎng)，可分化為神經(jīng)元、成肌細胞或成骨細胞；“較軟”基質(zhì)（0.1~1 kPa）有利于分化為神經(jīng)源性細胞，而“較硬”基質(zhì)（8~17 kPa）有利于分化為肌源性細胞［30］。納米技術(shù)的最新進展也強調(diào)了支架物理性質(zhì)的重要性，例如通過調(diào)節(jié)孔隙率來操縱細胞命運，進而加速創(chuàng)面愈合［31］。因此，改變基質(zhì)的機械性質(zhì)有助于植入的干細胞感知機械環(huán)境因素，從而促進細胞遷移和分化，加速不同階段創(chuàng)面愈合。

3.2 缺氧預處理 細胞缺氧預處理可增強MSC 促血管生成能力，進而促進創(chuàng)面愈合。ROSOVA 等［32］提出細胞在移植前需進行缺氧預處理細胞步驟，使細胞在移植到具有嚴重缺氧的體內(nèi)環(huán)境時能夠抵抗凋亡刺激，例如慢性創(chuàng)面或其他損傷部位的缺血組織。MSC 缺氧預處理的另一個優(yōu)點是保持細胞干性和多能性，這對需要組織再生的區(qū)域非常有益。

3.3 基因改造 干細胞也可以通過基因改造來提高其再生和治療潛力。iPSC的使用為進一步的基因改造創(chuàng)造了機會，以糾正基因缺陷。TEO等［33］提出應用ZFN、TALEN、CRISPR 等技術(shù)體外修復與糖尿病相關的突變基因序列，然后再移植回糖尿病患者。從基因上糾正老年糖尿病患者的iPSC，去除與糖尿病、衰老相關的缺陷基因，增強自體細胞治療效果。SONG 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒轉(zhuǎn)染方式將v-Myc導入人ADSC中，可促進VEGF的分泌和體外血管生成。FIERRO等［35］的臨床前研究也證實，在小鼠下肢缺血模型中，使用慢病毒載體可以安全地對MSC 進行基因改造，以產(chǎn)生高水平的VEGF，促進血管生成。

3.4 納米技術(shù) 納米技術(shù)可以增強干細胞潛能和分化能力。脂肪干細胞植入至光敏和仿生核殼納米纖維支架后，在光刺激下可分化為表皮角質(zhì)形成細胞［36］。納米顆粒也可用于將遺傳物質(zhì)輸送到細胞。YANG等［37］發(fā)明了一種非病毒、可生物降解的聚合物納米顆粒，可將VEGF基因傳遞給MSC和ESC來源的細胞；經(jīng)處理的干細胞顯著增強了VEGF的生成能力、細胞活力和結(jié)合靶組織的能力。在小鼠下肢缺血模型中進一步證實，經(jīng)生物降解聚合物納米顆粒向MSC轉(zhuǎn)入VEGF基因組的血管密度顯著高于對照組，同時肌肉退化和組織纖維化減少。這些結(jié)果表明，基于生物降解聚合物納米顆粒的工程干細胞是缺血性疾病的有效治療手段，并顯示出治療創(chuàng)面的潛力。

3.5 分泌體組織工程 MSC 通過分泌一些營養(yǎng)物質(zhì)（分泌體），發(fā)揮旁分泌效應，促進移植細胞的治療效果。分泌體由可溶性因子（如細胞因子、趨化因子和生長因子）以及不溶性胞外囊泡（EV）組成。最新研究表明，與MSC 相似，iPSC 也通過旁分泌效應促進創(chuàng)面愈合，而不是直接的細胞相互作用。

越來越多的研究聚焦于如何利用細胞上清液中的分泌體，尤其是從不溶性EV 分離出的可溶性因子。EV 含有來源于細胞的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并作為細胞內(nèi)相互作用的重要介質(zhì)，比可溶性分泌體更重要［38］。局部微環(huán)境可影響EV 的產(chǎn)生，細胞密度、細胞年齡、培養(yǎng)系統(tǒng)幾何形狀、缺氧和機械應力等參數(shù)也會影響EV轉(zhuǎn)運和下游治療效果［39］。因此，可在體外已知促進創(chuàng)面愈合的微環(huán)境中探索EV。

許多研究表明，不同細胞來源的EV 均可通過促進膠原合成和血管生成，進而促進皮膚創(chuàng)面愈合［40-42］。此外，EV 也被作為生物活性分子裝載到組織工程支架上用于創(chuàng)面愈合。TAO 等［43］成功構(gòu)建miR-126-3p 過表達滑膜MSC 控釋外泌體復合殼聚糖基質(zhì)支架，該支架通過增強再上皮化、血管生成和膠原生成，加速糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合。WANG 等［44］設計了一種抗菌多功能FHE 水凝膠（F127/OHAEPL），其可控制釋放來自ADSC 的外泌體。一項關于MSC-EV 促進糖尿病創(chuàng)面愈合的臨床前文獻薈萃分析發(fā)現(xiàn)，富含非編碼RNA或微小RNA的EV，對糖尿病創(chuàng)面的愈合有顯著影響，在血管密度和數(shù)量、疤痕寬度和再上皮化等方面也有積極的改善作用［45］。這些研究結(jié)果有利于推動MSC-EV的臨床轉(zhuǎn)化。

與基于細胞的治療相比，EV的優(yōu)勢在于能夠良好地修飾治療材料，從而在體內(nèi)產(chǎn)生可預測的劑量反應效應。此外，EV 也可以長期存儲而不喪失功能。因此，EV是一種非常有潛力的創(chuàng)面治療非細胞替代品，避免了單獨使用干細胞或與干細胞聯(lián)合使用的潛在并發(fā)癥和風險。

4 總結(jié)與展望

SVF 和iPSC 是治療糖尿病創(chuàng)面的潛在細胞療法，SVF 具有即時使用特性，而iPSC 具有倫理問題少和來源豐富的優(yōu)勢，這使得它們非常適合用于難以治愈的慢性創(chuàng)面和復雜組織損傷。在給藥途徑方面，全身或局部注射干細胞治療糖尿病創(chuàng)面均是有效方式，單細胞轉(zhuǎn)錄組學有助于干細胞給藥途徑更加個性化，加速創(chuàng)面愈合。在干細胞的操縱技術(shù)方面，多種技術(shù)從不同角度均可操縱干細胞，直接或間接增強移植細胞的功能，以促進創(chuàng)面愈合。其中，分泌體是一種很有前途的非細胞治療策略，可以在難以愈合的慢性糖尿病創(chuàng)面中實現(xiàn)創(chuàng)面愈合，越來越多的難治性疾病可能受益于此類治療方法。未來仍需進一步研究，解析干細胞療法的確切機制，評估此類療法的臨床安全性，并專注于創(chuàng)新和臨床轉(zhuǎn)化。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明溫作君：論文撰寫及文獻資料的收集分析；朱冰：文獻資料的收集，指導寫作；孫杰，顧隆森：論文審核及修正，指導寫作