基于1H-NMR結(jié)合LC-MS技術(shù)分析熊膽粉及常見膽類中藥中的膽酸類成分

曹 妍，張佩杰，李 婷，許 霞，常安琪，李 軍, 2，劉地發(fā)，屠鵬飛，宋月林, 2*

基于1H-NMR結(jié)合LC-MS技術(shù)分析熊膽粉及常見膽類中藥中的膽酸類成分

曹 妍1，張佩杰1，李 婷1，許 霞1，常安琪1，李 軍1, 2，劉地發(fā)3，屠鵬飛1，宋月林1, 2*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥品質(zhì)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029 3. 江西青峰藥業(yè)有限公司 創(chuàng)新天然藥物與中藥注射劑國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000

建立基于核磁共振氫譜技術(shù)（1H-NMR）結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）的分析方法，闡明熊膽粉中膽酸類成分組成，找出熊膽粉與其他常見膽類中藥中的差異性成分。利用1H-NMR非靶標(biāo)分析熊膽粉及其他常見膽類中藥的化學(xué)成分組，通過信號歸屬表征熊膽粉中膽酸類成分組成，以1H-NMR圖譜分段積分后峰面積為變量進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。利用LC-MS對熊膽粉及其他常見膽類中藥中10個(gè)膽酸類成分（膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸、甘氨熊去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、?；悄懰?、甘氨膽酸）進(jìn)行含量測定，并以含量為變量進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析?；?H-NMR圖譜及多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)膽酸類成分為膽類中藥的主要成分，也是熊膽粉與其他常見膽類中藥的主要差異性成分。結(jié)合文獻(xiàn)及對照品比對，從熊膽粉中初步鑒定出7個(gè)膽酸類成分。進(jìn)一步結(jié)合LC-MS含量測定結(jié)果和多元統(tǒng)計(jì)分析驗(yàn)證熊膽粉與其他常見膽類中藥的主要差異性膽酸類成分為熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；切苋パ跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸。熊膽粉與其他常見膽類中藥的膽酸類成分存在顯著差異。與其他膽類中藥相比，熊膽粉中熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸及其牛磺型結(jié)合膽酸含量較高。1H-NMR技術(shù)具有對化學(xué)成分組全面、快速分析的優(yōu)勢，可與LC-MS檢測相互補(bǔ)充，共同應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系成分分析和代謝組學(xué)的深入研究。

1H-NMR；LC-MS；熊膽粉；常見膽類中藥；膽酸類成分；多元統(tǒng)計(jì)分析；熊去氧膽酸；鵝去氧膽酸；?；切苋パ跄懰幔慌；蛆Z去氧膽酸

膽類中藥是我國傳統(tǒng)中藥的重要組成部分，如熊膽、蛇膽、豬膽、牛膽、羊膽、牛黃等，具有悠久的臨床使用歷史。其中熊膽粉是熊科動物黑熊Cuvier或棕熊L.經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁并干燥而得到的粉末。其性寒味苦，具有封脈竅、止腐、生肌、明目之功效，主治熱病燥渴、風(fēng)熱目赤、黃疸等癥[1]?，F(xiàn)代臨床研究表明熊膽中所含的?；切苋パ跄懰帷⑿苋パ跄懰?、鵝去氧膽酸等幾十種膽汁酸成分及膽固醇、氨基酸等對治療肝膽疾病及因肝膽失調(diào)引起的相關(guān)疾病具有顯著療效[2-4]。目前以熊膽粉為原料的中成藥已上市150多種，如熊膽膠囊、熊膽救心丸、熊膽痔靈膏等[5]。隨著熊膽粉藥用需求的增大和野生動物捕獵的禁止，市場上熊膽資源緊缺，經(jīng)常有不法分子將豬、牛、羊膽通過黃柏或者黃連浸汁等方式進(jìn)行混偽后銷售[6]。因此，亟需建立快速、高效的膽類中藥分析方法從而闡明熊膽粉化學(xué)成分組，進(jìn)一步找出熊膽粉與其他常見膽類中藥的差異性成分，推進(jìn)熊膽粉替代資源開發(fā)工作，保證臨床用藥安全與有效。

核磁共振（NMR）及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）作為最常用的代謝組學(xué)分析技術(shù)，經(jīng)常用于中藥復(fù)雜體系的分析[7-9]。其中核磁共振氫譜技術(shù)（1H-NMR）無需復(fù)雜的樣品前處理，如分離和衍生化，無需預(yù)知目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)類型，無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可在短時(shí)間內(nèi)獲得樣品中化學(xué)成分組的定性、定量信息，非常適合非靶標(biāo)整體代謝輪廓分析。并且實(shí)驗(yàn)后樣品可再次回收使用，尤其適用于分析熊膽這類來源稀缺、價(jià)格昂貴的樣品。NMR的主要缺陷是不具備色譜分離功能，并且靈敏度低。而LC-MS可以同時(shí)彌補(bǔ)這2個(gè)缺陷，對樣品中的目標(biāo)化合物進(jìn)行更加準(zhǔn)確地定性定量分析。目前，1H-NMR及LC-MS相結(jié)合的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中，并且為化學(xué)成分組的分析提供了更多的信息[10-12]。前期課題組將二者結(jié)合的技術(shù)初步應(yīng)用于蛇膽中化學(xué)成分分析，不僅可以通過1H-NMR快速了解蛇膽整體代謝輪廓譜，還進(jìn)一步結(jié)合LC-MS提供的高分辨數(shù)據(jù)鑒定出57個(gè)膽酸類成分，基本闡明了蛇膽中膽酸類成分組成[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)將通過利用1H-NMR對熊膽粉及常見膽類中藥中化學(xué)成分組進(jìn)行非靶標(biāo)性輪廓分析，闡明熊膽粉中的主要膽酸類成分，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析找出熊膽粉及其他常見膽類中藥的差異性成分。然后利用LC-MS對主要膽酸類成分進(jìn)行絕對定量分析，找出更加精準(zhǔn)的差異性成分，為建立熊膽粉及常見膽類中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。同時(shí)探討1H-NMR與LC-MS聯(lián)合應(yīng)用于膽類中藥質(zhì)量快速評價(jià)的可能性和科學(xué)價(jià)值，為中藥化學(xué)成分的分析提供新思路。

1 材料

1.1 儀器

Varian Unity-500型核磁共振波譜儀，配備TCI冷凍探頭及Z方向脈沖梯度場，美國Varian公司；Mettler ME204型電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；超聲波輔助儀，美國Danbury公司；HPLC液相色譜儀，配備LC-20ADXR泵、SIL-20AC自動進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、DGU-20A脫氣機(jī)、CBM-20A控制器，日本島津公司，連接5500Qtrap三重四級桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜儀，美國ABSciex公司；Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 試劑

分析級甲醇（批號20189526）、磷酸二氫鉀（批號20183642）、磷酸氫二鈉（批號20183642）均購自北京化工廠；LC-MS級甲醇（批號186273）、甲酸（批號186204）均購自美國Thermo-Fisher公司，水為實(shí)驗(yàn)室自制Milli-Q超純水。氘代甲醇（批號189773）及重水（批號189826）購自美國CIL公司；sodium 3-trimethlysilyl[2,2,3,3-4] propionate（TSP-4，批號T175296）購自美國阿法埃莎（Alfa Aesar）化學(xué)有限公司；膽汁酸對照品包括去氧膽酸（DCA，批號B21032）、熊去氧膽酸（UDCA，批號B21405）、豬去氧膽酸（HDCA，批號B21152）、鵝去氧膽酸（CDCA，批號B20347）、?；切苋パ跄懰幔═UDCA，批號B21642）、?；蛆Z去氧膽酸（TCDCA，批號B20624）、甘氨熊去氧膽酸（GUDCA，批號B21091）、膽酸（CA，批號B20274）、牛磺膽酸（TCA，批號B21318）、甘氨膽酸（GCA，批號B22379）、甘氨豬去氧膽酸（GHDCA，批號B21825）、人參皂苷Rb2（ginsenoside Rb2，批號111715）均購自上海源葉生物科技有限公司。經(jīng)HPLC-ELSD檢測，各對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。

1.3 樣品

熊膽粉（XD1～7，批號分別為20181101、20180103、20181201、20180101、20180701、20180401、20180801）均購自黑龍江黑寶藥業(yè)股份有限公司，XD8（批號2-131）購自吉林省延邊州第一養(yǎng)殖場義城有限公司，XD9（Z01097289）購自吉林白頭山制藥有限公司；熊膽（XD10，批號Z20183143）購自中國藥材公司；蛇膽（SD）、雞膽（JD）、鴨膽（YAD）、鵝膽（ED）、牛膽（ND）、牦牛膽（MND）、羊膽（YD）、豬膽（ZD）、牛蛙膽（NWD）、狗膽（GD）、兔膽（TD）、鯉魚膽（LYD）、白鰱魚膽（BLYD）、武昌魚膽（WCYD）、草魚膽（CYD）從當(dāng)?shù)赝涝讏鲑彽?，人工牛黃（RGNH，批號20183253）和天然牛黃（TRNH，批號20188223）均購自北京同仁堂藥店。所有樣品均經(jīng)過北京大學(xué)屠鵬飛教授鑒定為正品，標(biāo)本存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 利用1H-NMR非靶標(biāo)性分析熊膽粉及其他常見膽類中藥

2.1.1 氘代磷酸緩沖液（PBS）的制備 精密稱取氯化鈉200.00 mg、磷酸二氫鉀89.50 mg、氯化鉀5.00 mg、磷酸氫二鉀6.75 mg于燒杯中，用重水充分溶解。另外精密稱取一定量的TSP-4固體粉末，配制成含0.03% TSP-4的10 mmol/L磷酸鹽重水緩沖溶液，與氘代甲醇等體積混合，即得混合氘代溶劑，待用。

2.1.2 核磁共振測試供試樣品和對照樣品的制備 所有膽類中藥樣品均在40 ℃烘箱中干燥處理3 d，粉碎后過40目篩，精密稱取粉末20 mg，加入50倍量甲醇，超聲提取30 min，加入甲醇補(bǔ)足失重，取混懸液置于干凈離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液至另一個(gè)干凈離心管中，減壓濃縮后置于真空干燥箱，30 ℃環(huán)境中干燥處理2 h，用0.5 mL混合氘代溶劑復(fù)溶殘?jiān)?，并迅速轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中，即得供試樣品。取“1.2”項(xiàng)下對照品各2.0 mg，用0.5 mL混合氘代溶劑溶解，并迅速轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中，即得對照品。

另精密稱取各批次熊膽粉各20 mg，混合均勻后，稱取120 mg，一式6份平行制備，作為質(zhì)控樣品，采集1H-NMR圖譜，通過圖譜疊加判斷整個(gè)分析系統(tǒng)的重現(xiàn)性。

2.1.3 樣品1H-NMR測定條件 各樣品的1H-NMR測定條件為樣品在298 K于500 MHz核磁共振儀上測定，測定頻率為499.91 MHz，信號累積256次，弛豫時(shí)間（d1）2 s，譜寬8 012.6 Hz （?1.0～16.0），采集時(shí)間為2.044 7 s，脈沖角度90°（11.05 μs），LB為0.3 Hz。峰的對稱性、基線與定標(biāo)峰校正均為人工手動進(jìn)行，利用TSP-4定標(biāo)，CD3OD進(jìn)行鎖場。

2.1.41H-NMR數(shù)據(jù)處理 各批次樣品的1H-NMR數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成ASCII格式，進(jìn)一步用MestReNova軟件（Version 11.0.4，西班牙Mestrelab Research公司）處理數(shù)據(jù)。對核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行分段積分、歸一化和尺度標(biāo)準(zhǔn)化等處理，使數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)化。以0.02積分段對0.5～10.0進(jìn)行分段積分，并將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為.csv格式，導(dǎo)入SIMCA-P軟件（Version 14.0，瑞典Umetrics公司）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.1.5 基于1H-NMR圖譜分析熊膽粉及常見膽類中藥中的膽酸類成分 中藥1H-NMR圖譜是其各組分質(zhì)子信號的疊加，圖譜的信號往往來源于主要成分。熊膽粉的典型1H-NMR圖譜如圖1所示。將圖譜分為2個(gè)區(qū)域，芳香區(qū)（5.0～9.0）及脂肪區(qū)（0.5～4.5），可以直觀發(fā)現(xiàn)信號峰集中在脂肪區(qū)，其中亞甲基和次甲基的出峰位置處（1.2～2.4）信號重疊較為嚴(yán)重，表明熊膽中主要成分為膽酸類成分。通過與對照品（如UDCA、CDCA、TUDCA、TCDCA、DCA等）比對，并結(jié)合文獻(xiàn)的報(bào)道及開源數(shù)據(jù)庫，如HMDB（www.hmdb.ca）、BMRB（http://www.bmrb. wisc.edu/ref_info/）等，對各主要信號進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬。在高場區(qū)，可以明顯地觀察到C-18、C-19、C-21角甲基在0.67～0.69和0.85～1.00處出現(xiàn)裂分的信號峰。對照品UDCA在0.68 (3H, s, 18-CH3)、0.94 (3H, s, 19-CH3) 和0.96 (3H, d,= 6.5 Hz, 21-CH3) 出峰，CDCA的角甲基信號出現(xiàn)在0.67 (3H, s, 18-CH3)、0.92 (3H, s, 19-CH3) 和0.95 (3H, d,= 4.5 Hz, 21-CH3)，而CA的角甲基信號出現(xiàn)在0.73 (3H, s, 18-CH3)、0.92 (3H, s, 19-CH3) 和1.02 (3H, d,= 6.5 Hz, 21-CH3)。這些信號在熊膽的1H-NMR圖譜中均可以找到對應(yīng)的信號峰。圖1中也可以明顯看到?；撬峤Y(jié)合型膽酸的牛磺酸殘基特征性信號3.57 (2H, t,= 6.5 Hz, H-25) 和3.08 (2H, t,= 6.5 Hz, H-26)，由此推測熊膽中可能含有UDCA、CDCA、CA及其?；撬峤Y(jié)合型膽酸，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[14]，熊膽中還含有牛磺熊去氧酮膽酸，在該圖譜中也可以歸屬其信號（表1）。

數(shù)字編號與表1相同

表1 熊膽粉1H-NMR譜化學(xué)位移歸屬(氘代甲醇-重水1∶1)

Table 1 Signal assignment for 1H-NMR spectrum of bear bile powder (CD3OD-D2O 1∶1)

編號化合物化學(xué)位移(δ)文獻(xiàn) 1UDCA*0.68 (3H, s), 0.94 (3H, s), 0.96 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.36 (1H, s)15-16 2CDCA*0.67 (3H, s), 0.92 (3H, s), 0.95 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.77 (1H, m), 4.01 (1H, m)15-18 3CA*0.73 (3H, s), 0.92 (3H, s), 1.02 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.37 (1H, m), 3.79 (1H, m), 3.97 (1H, m)15-18 4TUDCA*0.65 (3H, s), 0.91 (3H, s), 0.92 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.41 (1H, m), 3.43 (1H, m), 3.46 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.97 (2H, t, J = 6.5 Hz)18 5TCDCA*0.69 (3H, s), 0.90 (3H, s), 0.95 (3H, d, J = 6.5 Hz), 2.95 (2H, t, J = 6.5 Hz), 3.55 (2H, t, J = 6.5 Hz), 3.35(1H, m), 3.88 (1H, m)18 6TCA*0.58 (3H, s), 0.80 (3H, s), 0.84 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.28(2H, t, J = 6.5 Hz), 3.60 (2H, t, J = 6.5 Hz)18 7?；切苋パ跬懰?.67 (3H, s), 0.97 (3H, s), 0.92 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.79 (1H, m), 3.53 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.92 (2H, t, J = 6.5 Hz,)19

*對照品指認(rèn)

*identities were confirmed with authentic compounds.

熊膽、雞膽、鵝膽等10余種常見膽類中藥提取后，平行采集1H-NMR圖譜（圖2），可以明顯看出不同膽類中藥的1H-NMR圖譜存在一定差異。在人工牛黃、羊膽、牛膽、牦牛膽、熊膽、狗膽、兔膽、蛇膽、鵝膽、雞膽、鴨膽的圖譜中都出現(xiàn)了?；撬釟埢奶卣餍孕盘?.57 (2H, t,= 6.5 Hz, H-25) 和3.08 (2H, t,= 6.5 Hz, H-26)，表明這些膽類中藥均含有豐富的?；切湍懰?。在豬膽、牛膽、牦牛膽的1H-NMR圖譜中可以觀察到甘氨型膽酸的甘氨酸殘基特征性信號3.74 (2H, t,= 6.5 Hz, H-25)，表明它們富含甘氨型結(jié)合膽酸。收集到的4種魚膽的1H-NMR圖譜輪廓與其他膽類中藥明顯不同，既沒有牛磺酸殘基的特征信號也沒有甘氨酸殘基的特征信號，其主要成分為游離型膽酸。因此，通過從1H-NMR圖譜可以快速了解膽類中藥中主要膽酸類成分的結(jié)構(gòu)類型。天然牛黃的1H-NMR圖譜相對簡單，與對照品比對后發(fā)現(xiàn)天然牛黃中主要含有CA和TCA。由于天然牛黃來源稀缺，供不應(yīng)求，人工牛黃就是人們在研究牛黃的化學(xué)成分基礎(chǔ)上，采用成分配制的方式制作的替代品。根據(jù)《中國藥典》2020年版[20]對人工牛黃的記載，“本品由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬帷⒛懠t素、膽固醇、微量元素等加工而成”，其中豬去氧膽酸是由豬膽汁提取加工制成，膽固醇是由牛、豬、羊腦經(jīng)提取加工制成，所以人工牛黃與豬膽、牛膽和羊膽1H-NMR圖譜都有相似之處，在人工牛黃中也可以看到豬膽的特征性成分HDCA的特征信號0.83 (3H, s, 18-CH3)[21-22]。牦牛膽和牛膽的1H-NMR圖譜相似度較高，主要成分均為?；切湍懰?，尤其是TCDCA含量較高[23]。蛇膽和兔膽的1H-NMR圖譜中信號相對較少，與對照品比對后發(fā)現(xiàn)蛇膽的1H-NMR圖譜與TCA對照品的圖譜幾乎一致，而兔膽與DCA對照品圖譜非常相似，表明TCA和DCA分別是蛇膽和兔膽的主要成分，與文獻(xiàn)中利用LC-MS技術(shù)測得結(jié)果一致[12,24-25]。

圖2 熊膽粉及其他常見膽類中藥的1H-NMR圖譜

2.1.6 膽類中藥1H-NMR測定結(jié)果的主成分分析（principal component analysis，PCA） 為了更全面地比較熊膽粉與其他常見膽類中藥中化學(xué)成分組的差異，將所有批次樣品的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成ASCII格式，并利用MestReNova軟件分段積分后，獲得定量數(shù)據(jù)矩陣。將10批熊膽粉歸為一組，17批其他膽類中藥樣品歸為一組，進(jìn)一步采用多元統(tǒng)計(jì)分析軟件SIMCA-P進(jìn)行無監(jiān)督性的PCA。各批次樣品經(jīng)過PCA后的得分圖（score plot）和載荷圖（loading scatter plot）分別如圖3-A和圖3-B所示。

所有的樣品都分布在95%的置信區(qū)域內(nèi)，2組具有明顯的分離趨勢，表明熊膽粉與其他膽類中藥的化學(xué)成分組存在一定差異。如得分圖（圖3-A）所示，4種魚膽樣品分布在右側(cè)，而非魚膽類樣品都分布在左側(cè)，進(jìn)一步證實(shí)魚膽樣品與其他膽類中藥化學(xué)成分組存在差異。另外，載荷圖（圖3-B）顯示分布在第1、4象限的差異性信號大部分化學(xué)位移隸屬于脂肪區(qū)，例如脂肪酸的特征信號1.30、1.32、1.38，表明魚膽中脂肪酸含量較高。除XD8（購自吉林義城）外，大多數(shù)熊膽粉樣品分布在第3象限，并且XD9與XD1～XD7及XD10相距較遠(yuǎn)，結(jié)合載荷圖分析發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地和廠家的熊膽粉在膽酸類成分含量上也存在差異。在第3象限可以看到UDCA特征信號0.68、0.94、0.96，CDCA的特征信號0.92和牛磺酸殘基特征信號2.97、3.46等，表明與其他膽類中藥相比，熊膽粉中UDCA、CDCA及其?；切徒Y(jié)合膽酸含量較高。

圖3 熊膽粉與其他常見膽類中藥的PCA得分圖(A) 和載荷圖(B)

2.2 利用LC-MS靶標(biāo)性分析熊膽粉及常見膽類中藥的膽酸類成分

2.2.1 LC-MS測試對照樣品和供試品溶液的制備1H-NMR測定結(jié)束后，將“2.1.2”項(xiàng)下配制的核磁供試樣品和對照樣品進(jìn)行回收。然后取各對照品適量，精密稱定，分別用DMSO配制成10 mmol/L的對照品儲備液，4 ℃保存，待用。取內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rb2（IS）適量，用DMSO配制成10 mmol/L的內(nèi)標(biāo)儲備液，再用50%甲醇稀釋20倍，配制成500 μmol/L的內(nèi)標(biāo)溶液，即得對照樣品。精密稱取回收后的各批次膽類中藥粉末10 mg，分別用1 mL的70%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋后經(jīng)12 000 r/min 離心10 min，取97 μL上清液，加入3 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋1 min，即得LC-MS供試品溶液。

2.2.2 LC-MS測定條件 液相條件、質(zhì)譜基本參數(shù)設(shè)置同文獻(xiàn)所述[12]。所測膽酸類成分的定量離子對、保留時(shí)間及其他質(zhì)譜參數(shù)（脫簇電壓和碰撞能）見表2。

2.2.3 LC-MS測定方法學(xué)考察 吸取適量各對照品的儲備液，混合，并用50%甲醇水稀釋至1.0 mL，配制成CA、HDCA、TUDCA、TCA、GHDCA、GUDCA、CDCA、TCDCA、UDCA、GCA質(zhì)量濃度分別為1450、1400、1780、1840、1600、714、1400、1780、836、714 μg/mL的混合對照品儲備液。經(jīng)50%甲醇水梯度稀釋后，加入等量的內(nèi)標(biāo)溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)條件進(jìn)行測定。以各膽酸類成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為縱坐標(biāo)（），各膽酸類成分質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（）。同時(shí)對檢測限（LOD）、定量下限（LLOQ）、回收率、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行考察[26]。10個(gè)待測成分的線性回歸方程、線性范圍、、LOD和LLOQ見表3。考察回收率、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，各對照品成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD均小于15%，均符合方法學(xué)的要求。

表2 10種膽酸類成分及內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間、離子對、脫簇電壓和碰撞能

Table 2 Retention time, ion transition, declustering potential, and collision energy of each bile acid and internal standard (IS)

化合物tR/min離子對駐留時(shí)間/ms脫簇電壓/V碰撞能/eV TUDCA8.18498.3＞80.050?100?130 TCA8.65514.3＞80.050?100?130 GUDCA12.58448.3＞74.050?100?80 GCA12.73464.3＞74.050?100?80 GHDCA12.95448.3＞74.050?100?80 TCDCA13.29498.3＞80.050?100?130 人參皂苷Rb2（IS）13.311 123.3＞1 077.350?100?30 CA19.92407.3＞407.350?100?60 UDCA21.55391.3＞391.350?100?15 HDCA22.43391.3＞391.350?100?15 CDCA24.77391.3＞391.350?100?15

2.2.4 熊膽粉及常見膽類中藥中主要膽酸類成分含量測定及PCA 將制備好的各膽類中藥的LC-MS測試供試品溶液注入LC-QqQ系統(tǒng)，按照“2.2.2”項(xiàng)條件進(jìn)行樣品測定，重復(fù)3次。將所得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各供試品溶液中膽酸類成分的含量。如表4所示，不同膽類中藥中膽酸類成分含量存在差異，收集的10批熊膽粉中膽酸類成分含量也存在一定個(gè)體差異。各膽類中藥中含量較高的膽酸類成分與前期1H-NMR測試分析結(jié)果一致。熊膽粉中TUDCA和TCDCA的含量最高，二者的含量占比高達(dá)90%以上。其中TUDCA含量在296～990 nmol/mg，遠(yuǎn)高于其他膽類中藥，TCDCA含量在198～383 nmol/mg。熊膽粉中甘氨型膽酸含量較少，GCA、GUDCA及GCDCA含量均低于50 nmol/mg。另外，只有熊膽粉中UDCA含量在定量限以上，含量為7.59～31.18 nmol/mg，是熊膽粉的特征性成分，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[27-29]。HDCA及其結(jié)合型膽酸是豬膽的特征性成分，在豬膽中含量較高。由于人工牛黃的配方中加入了HDCA，因此在人工牛黃中也存在大量HDCA，然而在天然牛黃中并沒有檢測到該成分。同時(shí)，牛膽中的TCA和GCA含量遠(yuǎn)高于天然牛黃，表明膽汁和結(jié)石中的膽酸類成分可能存在一定差異。所測定的10個(gè)膽酸類成分在魚類膽汁中含量較少，僅有少量CA、TCA和TCDCA存在。

表3 10個(gè)膽酸類成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量下限和檢測限

Table 3 Linear regression data, correlation index, lower limits of quantification (LLOQ) and limits of determination (LOD) for 10 bile acids

分析物線性方程r線性范圍/(ng·mL–1)LOD/(ng·mL–1)LLOQ/(ng·mL–1) TCAy＝0.065 2 x＋1.060.999 81.47～18400.150.525 GCAy＝0.007 09 x＋0.006 560.999 80.57～7140.050.263 CAy＝0.373 x＋7.860.998 21.16～14500.020.100 GUDCAy＝0.177 x＋0.061 60.999 60.57～7140.050.253 GHDCAy＝0.079 2 x＋0.052 60.999 61.28～16000.050.640 TUDCAy＝0.183 x＋4.170.999 61.42～17800.150.535 TCDCAy＝0.002 11 x＋2.070.996 81.42～17800.150.523 UDCAy＝0.003 68 x＋2.410.998 01.34～8360.050.167 HDCAy＝0.113 x＋17.70.999 01.12～14000.050.153 CDCAy＝0.107 x＋37.50.998 31.12～14000.050.175

表4 熊膽粉及其他常見膽類中10個(gè)膽酸類成分含量測定結(jié)果(n = 3)

Table 4 Determination results of 10 bile acids in bear bile powder and other medicinal bile(n = 3)

樣品含量/(nmol·mg?1) GHDCAGUDCACATCAGCATUDCATCDCAUDCAHDCACDCA MND0.35ND12.99248.72445.4084.84388.78BLBL1.45 ND1.380.6319.36413.77510.23BL411.82BLBL1.79 RGNHBLND22.9236.07119.58BL76.35ND104.223.86 ZD518.01ND1.322.7838.59BL11.72BL4.53BL TRNHBLBL18.3845.72134.59BL2.48BLBLBL YDBLBL8.2652.1223.8161.01220.44NDND2.02 SDNDND0.561 892.801.01BL104.21NDBLBL JDNDND1.4389.150.69BL889.80NDBL7.99 YADNDNDBL103.430.4282.83118.24NDBL8.82 EDNDND1.1951.66BLBL193.39NDBL11.90 GDBLND1.54404.163.4059.24365.73NDBL1.08 TDBLND0.1653.4918.3556.7372.59NDBL1.99 NWDBLND0.631.67BL23.440.07NDBLBL CYDBLND9.536.03BLBL0.05NDBL0.62 WCYDBLNDBL7.91BLBL0.04NDBLBL LYDBLND3.5429.12BLBL0.34NDBLBL BLYDBLND1.893.72BLBL0.02NDBLBL XD1BLNDBL9.37BL792.17198.407.59ND27.49 XD2BLND4.9918.93BL990.97231.4628.67ND41.05 XD3BLBL2.4327.48BL347.39292.5921.36ND35.87 XD4BLBL1.9614.22BL547.19371.747.26ND13.05 XD5BLBL6.4831.14BL492.97383.7730.66ND39.58 XD6BL0.101.2121.79BL600.65310.3921.04ND23.13 XD7BLBL1.1521.78BL411.96209.339.39ND19.23 XD8BLBL5.1218.69BL296.46302.0319.03ND28.02 XD9BL0.5721.8161.2730.51687.75242.0423.10ND43.99 XD10BLND2.0320.16BL517.54284.3931.18ND19.33

ND-未檢出 BL-低于檢測限

ND-not detedcted BL-below limit of detection.

為了進(jìn)一步比較熊膽粉與其他常見膽類中藥中所測定的10個(gè)膽酸類成分含量差異，將含量測定結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P軟件進(jìn)行PCA。得分圖（圖4-A）顯示，除了SD，所有樣品均分布95%置信區(qū)間內(nèi)。并且以10個(gè)膽酸類成分含量為變量，2組具有明顯的分離趨勢，表明所測定的10個(gè)膽酸類成分在熊膽粉與其他常見膽類中藥中含量具有顯著差異。熊膽粉樣品全部分布在得分圖的第2象限，而載荷圖（圖4-B）中第2象限距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的分別是TUDCA、TCDCA、UDCA和CDCA，即表示引起熊膽與其他常見膽類差異的膽酸類成分主要是TUDCA、TCDCA、UDCA和CDCA，與“2.1.6”項(xiàng)結(jié)果一致。因此，將這4個(gè)成分含量作為熊膽粉質(zhì)量控制的重點(diǎn)指標(biāo)性成分較為合理。另外，結(jié)合載荷圖分析發(fā)現(xiàn)蛇膽分布在95%的置信區(qū)域外是由于TCA含量非常高，雞膽樣品距離熊膽粉組比較近是由于TCDCA含量較高。

圖4 熊膽粉與其他常見膽類中藥中10個(gè)膽酸類成分含量的PCA得分圖(A) 和載荷圖(B)

3 討論

3.1 提取條件的考察

實(shí)驗(yàn)前期通過對使用20%、50%、70%甲醇水和甲醇提取的熊膽粉提取物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在甲醇熊膽粉提取物中檢測到的化合物數(shù)量最多、峰形和分離度最好。并且由于膽酸類成分遇水振搖后會產(chǎn)生大量泡沫，在中藥提取液濃縮時(shí)容易噴出而難以控制平行操作，所以本實(shí)驗(yàn)采用純甲醇作為提取溶劑。另外，課題組前期[10]發(fā)現(xiàn)將樣品溶于緩沖鹽溶液可以有效緩解利用1H-NMR批量檢測時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)位移漂移問題。本實(shí)驗(yàn)中6批質(zhì)控樣品的1H-NMR圖譜可以完全重疊，其化學(xué)位移值和峰強(qiáng)度均一致，表明檢測系統(tǒng)重現(xiàn)性良好。

3.2 1H-NMR非靶標(biāo)檢測及LC-MS靶標(biāo)檢測在膽類中藥化學(xué)成分分析中的應(yīng)用

1H-NMR最大的優(yōu)勢在于可以對樣品中所有化學(xué)成分進(jìn)行無結(jié)構(gòu)、無極性偏向性地檢測。因此，利用1H-NMR分析熊膽粉及常見膽類中藥可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)氨基酸、脂肪酸及膽汁酸等成分的檢出，通過分段積分即可獲得所有成分的相對定量數(shù)據(jù)，從而可以對整體代謝輪廓進(jìn)行初步分析和比較。然而在使用LC-MS檢測時(shí)，膽酸類成分通常在C18柱保留效果更好，負(fù)離子模式下響應(yīng)較好；而像氨基酸這種大極性成分在C18柱上幾乎不保留，通常使用Amide柱實(shí)現(xiàn)色譜分離后于正離子模式下檢測，所以需要構(gòu)建聯(lián)柱系統(tǒng)并且在正、負(fù)離子切換模式下才可以實(shí)現(xiàn)樣品中的膽汁酸、氨基酸等成分的同時(shí)檢測[8-9]。但是1H-NMR不具備分離功能，膽酸類成分結(jié)構(gòu)十分相似導(dǎo)致信號堆疊嚴(yán)重，給差異性成分的鑒定和微量膽酸類成分的檢出帶來很多困難。因此，在對中藥復(fù)雜體系整體輪廓初步分析比較時(shí)，1H-NMR具有一定優(yōu)勢；需要對化學(xué)成分進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析時(shí)，LC-MS選擇性更高。先利用1H-NMR非靶標(biāo)性分析，將樣品回收后進(jìn)一步利用LC-MS靶標(biāo)性分析，既可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，也符合了“綠色化學(xué)”的理念。因此，1H-NMR與LC-MS等檢測平臺信息的相互補(bǔ)充可以為中藥復(fù)雜體系分析提供更加全面、準(zhǔn)確的定性定量信息，為分析膽類中藥和建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供更可靠的參考依據(jù)。

3.3 小結(jié)

本研究基于1H-NMR結(jié)合LC-MS技術(shù)比較研究熊膽粉及常見膽類中藥的膽酸類成分，基于1H-NMR圖譜從熊膽粉中初步鑒定出7個(gè)膽酸類成分，利用LC-MS對10個(gè)膽酸類成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量，初步闡明熊膽粉中膽酸類成分組成?；谛苣懛叟c其他常見膽類中藥的1H-NMR圖譜分段積分?jǐn)?shù)據(jù)和10個(gè)膽酸類成分的準(zhǔn)確定量結(jié)果，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)熊膽與其他常見膽類中藥的膽酸類成分存在顯著差異，差異性成分主要是UDCA、CDCA、TUDCA和TCDCA，為建立熊膽粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和分析常見膽類中藥奠定基礎(chǔ)。今后，本課題組將收集更多的膽類中藥樣品，對常見膽類中藥的膽酸類成分組成進(jìn)行全面分析。

基于本研究結(jié)果，驗(yàn)證了1H-NMR在化學(xué)成分輪廓分析中應(yīng)用的可行性，有望實(shí)現(xiàn)中藥等復(fù)雜體系不依賴于對照品的定性定量分析。同時(shí)，為珍貴的中藥樣本以及臨床樣本分析提供了思路，先利用1H-NMR非靶標(biāo)性分析，再結(jié)合LC-MS對目標(biāo)性成分準(zhǔn)確分析，可以基于有限的樣品量提供更加全面、準(zhǔn)確的定性和定量信息，推動中藥復(fù)雜體系及臨床代謝組學(xué)的發(fā)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 宇妥·云丹貢布. 四部醫(yī)典[M]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古人民出版社, 1997: 49-50.

[2] Wang N, Feng Y, Cheung F,. A comparative study on the hepatoprotective action of bear bile andaqueous extract on experimental liver fibrosis in rats [J]., 2012, 12: 239.

[3] 熊敏琪, 賈成林, 崔金剛, 等. 熊膽粉在麝香通心滴丸抗動脈粥樣硬化中的作用機(jī)制研究 [J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2015, 35(9): 1083-1089.

[4] 雷云霞, 張慧田, 劉新. 清肝寧胃湯聯(lián)合熊去氧膽酸對原發(fā)性膽汁反流性胃炎患者療效分析[J]. 世界中醫(yī)藥, 2019, 14(12): 3265-3268.

[5] 巫秀美, 李成功, 鄭園園, 等. 熊膽產(chǎn)品的研究進(jìn)展 [J]. 大理學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 13(10): 28-31.

[6] 張曉曄. 熊膽的偽品鑒別 [J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2016, 35(16): 47.

[7] 趙芳, 李文竹, 潘堅(jiān)揚(yáng), 等. 基于核磁共振氫譜的組學(xué)技術(shù)在中藥制藥過程研究中的應(yīng)用與展望[J]. 世界中醫(yī)藥, 2021, 16(23): 3414-3418.

[8] Song Q Q, Liu W J, Yan Y,. Polarity-extended quantitative analysis of bear bile and its analogues using serially coupled reversed phase-hydrophilic interaction liquid chromatography-tailored multiple reaction monitoring [J]., 2017, 7(83): 52822-52831.

[9] Song Q Q, Liu W J, Chen X J,. Serially coupled reversed phase-hydrophilic interaction liquid chromatography-tailored multiple reaction monitoring, a fit-for-purpose tool for large-scale targeted metabolomics of medicinal bile [J]., 2018, 1037: 119-129.

[10] Liu W J, Song Q Q, Cao Y,. From1H NMR-based non-targeted to LC-MS-based targeted metabolomics strategy for in-depth chemome comparisons among fourspecies [J]., 2019, 162: 16-27.

[11] 田鶴. 基于LC-MS與1H NMR方法的熱應(yīng)激奶牛代謝組學(xué)研究 [D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2016.

[12] 曹妍, 李婷, 常安琪, 等. 蛇膽中膽汁酸類化學(xué)成分分析 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(1): 130-138.

[13] 袁丹, 金鳳, 于山川, 等. FT-IR法定性鑒別熊膽粉等常見動物膽類藥材 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2010, 12(1): 30-32.

[14] Bi D, Chai X Y, Song Y L,. Novel bile acids from bear bile powder and bile of geese [J]., 2009, 57(5): 528-531.

[15] Shoda M. Ursodesoxycholic acid in the bile of bears and its physiological action [J]., 1927, 7: 505-506.

[16] Miyaji S. Glycylursodesoxycholic acid from bear bile [J]., 1937, 250: 34-35.

[17] Hammarsten O. Investigations on biles of some polar animals: On the bile of the polar bear; II [J].,1902, 36: 525-526.

[18] Yamaguchi S, Qian Z Z, Nohara T. Bile acids of fel ursi [J]., 1998, 46(10): 1653-1655.

[19] 張?jiān)S, 王達(dá)祺, 劉買利. ?；切苋パ跬懰岱肿咏Y(jié)構(gòu)的1H、13CNMR研究 [J]. 波譜學(xué)雜志, 1999, 16(1): 33-39.

[20] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 5.

[21] 趙艷紅, 阮金秀. 牛黃及其代用品的藥理作用及臨床應(yīng)用 [J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊, 2007, 31(2): 175-178.

[22] 游元元, 萬德光. 動物膽汁藥用研究進(jìn)展 [J]. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 29(4): 58-61.

[23] 曹妍, 宋青青, 李軍, 等. 牦牛膽中膽汁酸類化學(xué)成分分析 [J]. 中國中藥雜志, 2019, 44(12): 2538-2543.

[24] 譚文敏, 任東波, 何忠梅. 兔膽化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展 [J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2016(1): 39-40.

[25] Zhang J, Fan Y, Gong Y,. Simultaneous determination of nine kinds of dominating bile acids in various snake bile by ultrahigh-performance liquid chromatography with triple quadrupole linear iontrap mass spectrometry [J]., 2017, 1068/1069: 245-252.

[26] Liu Y, Song Q Q, Zheng J,. Sensitive profiling of phenols, bile acids, sterols, and eicosanoids in mammalian urine by large volume direct injection-online solid phase extraction-ultra high performance liquid chromatography-polarity switching tandem mass spectrometry [J]., 2016, 6(85): 81826-81837.

[27] Qiao X, Ye M, Pan D L,. Differentiation of various traditional Chinese medicines derived from animal bile and gallstone: Simultaneous determination of bile acids by liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry [J]., 2011, 1218(1): 107-117.

[28] 薩茹拉, 溫都蘇畢力格, 朝格巴達(dá)日呼, 等. 熊膽在蒙醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用 [J]. 中國民族醫(yī)藥雜志, 2019, 25(1): 53-55.

[29] 王杰, 熊愛珍, 程絨絨, 等. 不同來源引流熊膽粉的化學(xué)成分系統(tǒng)分析 [J]. 中國中藥雜志, 2018, 43(11): 2326-2332.

Analysis of bile acid profiles in bear bile powder and other medicinal bile using1H-NMR and LC-MS

CAO Yan1, ZHANG Pei-jie1, LI Ting1, XU Xia1, CHANG An-qi1, LI Jun1, 2, LIU Di-fa3, TU Peng-fei1, SONG Yue-lin1, 2

1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. Beijing Key Laboratory for Quality Evaluation of Chinese Meteria Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. State Key Laboratory of Innovative Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine Injections, Jiangxi Qingfeng Pharmaceutical Co., Ltd., Ganzhou 341000, China

To establish an analysis method based on1H-NMR combined with LC-MS technology to clarify the bile acid profiles in bear bile powder, and find out the differences between bear bile powder and other medicinal bile.The1H-NMR spectra of each medicinal bile was recorded in parallel, the bile acid profiles of bear bile powder were characterized by signal attribution, and the datasets of piecewise integration were introduced for multiple statistical analysis to find the potential biomarkers. Then, the content of 10 bile acids [cholic acid (CA), ursodeoxycholic acid (UDCA), hyodeoxycholic acid (HDCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), tauroursodeoxycholic acid (TUDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), glycyrsodeoxycholic acid (GUDCA), glycohyodeoxycholic acid (GHDCA), taurocholic acid (TCA), glycocholic acid (GCA)] were determined using LC-MS, and then the content was used as variables for multivariate statistical analysis.Based on1H-NMR spectrum and multivariate statistical analysis results, it was found that bile acid profiles were the main components of medicinal bile and the main differences between bear bile powder and other medicinal bile. With the assistance of literature and reference compounds, seven bile acids were tentatively identified from the representative spectrum of bear bile powder. Combined with LC-MS results, it was found that UDCA, CDCA, TUDCA and TCDCA contributed to primary differences.The bile acid profiles in bear bile powder is significantly different from that in other medicinal bile, UDCA, CDCA, TUDCA and TCDCA have the potential to be the biomarkers. Furthermore,1H-NMR spectroscopy can provide comprehensively qualitative and quantitative information for TCMs, and it should be an eligible tool as well as LC-MS for the quality evaluation of TCMs.

1H-NMR; LC-MS; bear bile powder; other medicinal bile; bile acid profiles, multivariate statistical analysis; hyodeoxycholic acid; chenodeoxycholic acid; tauroursodeoxycholic acid; taurochenodeoxycholic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2022)17 - 5283 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.004

2021-05-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81773832）；創(chuàng)新天然藥物與中藥注射劑國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（QFSKL2018002）；中國科協(xié)青年人才托舉工程（2017QNRC001）

曹 妍，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評價(jià)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail: cyan199409@163.com

宋月林，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評價(jià)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail: syltwc2005@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]