基于STAT3通路探討芍藥苷對垂體瘤細胞增殖凋亡的影響

徐大偉，刁玉領(lǐng)，惠 磊，周文科，汲乾坤

垂體瘤是顱內(nèi)常見的良性腫瘤，發(fā)生率占顱內(nèi)腫瘤的10%～15%，僅次于腦膠質(zhì)瘤和腦膜瘤，居第3位[1]。垂體瘤形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為良性，但部分腫瘤呈侵襲性生長，可侵入鄰近組織，引起各種并發(fā)癥，影響病人內(nèi)分泌及神經(jīng)功能。垂體瘤具有惡性腫瘤特征，瘤細胞惡性增殖和侵襲性與復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)[2]。目前，垂體瘤的治療方法主要包括手術(shù)、藥物和放射，手術(shù)治療引起一系列后遺癥與并發(fā)癥，放射治療對垂體功能損傷較大[3]。因此，研發(fā)安全有效的藥物意義重大。芍藥苷是從毛茛科植物芍藥中提取的一種單萜類葡萄糖苷化合物，是芍藥的主要活性單體成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化應(yīng)激、擴張血管、神經(jīng)保護等藥理作用[4-5]。有研究顯示，芍藥苷對神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌等具有良好的抗腫瘤活性[6]。目前，關(guān)于芍藥苷治療垂體瘤的研究報道較少。本研究以人垂體瘤細胞為實驗對象，探討芍藥苷對垂體瘤細胞增殖凋亡的影響及作用機制，為芍藥苷相關(guān)藥物的研發(fā)及垂體瘤的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 垂體瘤組織 垂體瘤標本由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科提供，經(jīng)臨床表現(xiàn)和病理組織學(xué)檢查，手術(shù)中取新鮮垂體瘤組織塊置于無菌生理鹽水中，4 ℃保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，且通過病人知情同意。

1.1.2 實驗藥品及試劑 芍藥苷(HPLC>98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)；四唑鹽(MTT，美國Sigma公司)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒及核蛋白提取試劑盒(南京凱基公司)；引物(上海生工生物工程股份有限公司)；鼠抗人Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)一抗、兔抗人磷酸化JAK2(p-JAK2)一抗、鼠抗人信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription，STAT3)一抗、兔抗人磷酸化STAT3(p-STAT3)一抗(美國Thermo Fisher Scientific公司)；鼠抗人B淋巴細胞瘤-2基因(B cell lymphoma-2，Bcl-2)一抗、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗和鼠抗人β-actin一抗(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、HRP標記的羊抗鼠二抗(英國Abcam公司)；酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，蛋白凝膠電泳儀(上海天能科技有限公司)，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)儀(美國Bio-Rad公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 垂體瘤細胞的分離與培養(yǎng) 取新鮮垂體瘤組織，去除結(jié)締組織、壞死組織及血塊，剪碎至糊狀。對其進行原代培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化1 h，待細胞分散良好后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，添加終濃度為0.87% NH4CI于37 ℃條件下作用5 min。100目細胞濾網(wǎng)過濾后，1 000 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min，棄上清液，加入含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 pg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞并使其分散，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 d更換1次細胞培養(yǎng)液，直至細胞形成單層，使用0.25%胰蛋白酶消化，鏡檢計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×106/mL重新接種，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖 取對數(shù)期垂體瘤細胞，以1×105/mL的細胞密度接種于96孔板，每孔200 μL。待細胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12h后，更換不同濃度10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、1 000 μg/mL芍藥苷的RPMI 1640培養(yǎng)液，陰性對照組加入不含芍藥苷培養(yǎng)液。每組設(shè)置3個復(fù)孔，孵育48 h。每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，微振蕩10 min。選擇波長490 nm在酶標儀上讀取各孔吸光度(A490 nm)值。實驗重復(fù)3次，計算腫瘤細胞存活率：腫瘤細胞存活率(%)=(實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值)×100%。選擇細胞存活率為50%對應(yīng)的芍藥苷濃度作為后續(xù)實驗的處理濃度，設(shè)置對照組、芍藥苷組、JAK2/STAT3激動劑(Olanzapine)組和芍藥苷+激動劑組，按照上述MTT法測定垂體瘤細胞存活率，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的垂體瘤細胞，以1×106/mL細胞密度接種于24孔板上。分別使用芍藥苷(200 μg/mL)、JAK2/STAT3激動劑Olanzapine(20 μmol/L)、芍藥苷(200 μg/mL)+JAK2/STAT3激動劑Olanzapine(20 μmol/L)處理垂體瘤細胞，對照組為不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。48 h后收集細胞，以2 000 r/min(離心半徑10 cm)離心5～10 min，使用預(yù)冷1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)4 ℃重懸細胞，2 000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min，洗滌細胞2次；加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細胞；先后加入5 μL的Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)避光室溫孵育15min，采用流式細胞儀檢測，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 RT-qPCR檢測JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax mRNA表達水平 收集各組細胞，PBS清洗細胞2次，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，超微量分光光度計測定A260/280及其濃度。反轉(zhuǎn)錄體系：5×Mix 4 μL，RNA 1 μg，加DEPC-H2O至20 μL；反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋到1 mL作為cDNA。按照PCR試劑盒配制反應(yīng)體系后進行反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 45 s。其中，95 ℃預(yù)變性60 s；共循環(huán)40次[7]。待測基因qPCR引物使用Primer 3.0設(shè)計，序列見表1。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax蛋白表達 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法檢測樣品濃度。蛋白變性，上樣到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕式轉(zhuǎn)膜儀將其轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用JAK2(1∶500)、p-JAK2(1∶200)、STAT3(1∶500)、p-STAT3(1∶200)、Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)、β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，再用HRP標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，電化學(xué)發(fā)光(ECL)暗室中顯影，對感光膠片條帶進行分析，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 芍藥苷對垂體瘤細胞的生長抑制作用 與陰性對照組比較，不同濃度芍藥苷作用于垂體瘤細胞48 h后，細胞生長受到抑制，隨著芍藥苷濃度升高細胞存活率下降。芍藥苷>20 μg/mL，垂體瘤細胞存活率下降；芍藥苷為40～1 000 μg/mL時，細胞存活率從85.35%降低至18.62%。芍藥苷為200 μg/mL時，細胞存活率為50%。因此，選擇200 μg/mL濃度芍藥苷進行實驗。詳見圖1。

圖1 不同濃度芍藥苷對垂體瘤細胞存活率的影響

2.2 各組垂體瘤細胞存活率比較 各組垂體瘤細胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組比較，芍藥苷組垂體瘤細胞存活率降低，激動劑組垂體瘤細胞存活率升高(P<0.05)；與芍藥苷組比較，激動劑組、芍藥苷+激動劑組垂體瘤細胞存活率升高(P<0.05)；與激動劑組比較，芍藥苷+激動劑組垂體瘤細胞存活率降低(P<0.05)。詳見表1、圖2。

表2 各組垂體瘤細胞存活率比較(±s，n=3) 單位：%

與對照組比較，＊P<0.05；與芍藥苷組比較，#P<0.05；與激動劑組比較，△P<0.05。圖2 各組垂體瘤細胞存活率比較

2.3 各組垂體瘤細胞凋亡率比較 各組垂體瘤細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組比較，芍藥苷細胞凋亡率升高，激動劑組垂體瘤細胞凋亡率降低(P<0.05)；與芍藥苷組比較，激動劑組、芍藥苷+激動劑組垂體瘤細胞凋亡率降低(P<0.05)；與激動劑組比較，芍藥苷+激動劑組垂體瘤細胞凋亡率升高(P<0.05)。詳見表3、圖3。

表3 各組垂體瘤細胞凋亡率比較(±s，n=3) 單位：%

與對照組比較，＊P<0.05；與芍藥苷組比較，#P<0.05；與激動劑組比較，△P<0.05。圖3 各組垂體瘤細胞凋亡情況(A為流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況；B為各組細胞凋亡率比較柱狀圖)

2.4 各組垂體瘤細胞JAK2、STAT3、Bcl-2和Bax mRNA水平比較 各組垂體瘤細胞Bcl-2和Bax mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組比較，芍藥苷組Bcl-2 mRNA相對表達量降低，Bax mRNA相對表達量升高，激動劑組Bcl-2 mRNA相對表達量升高，Bax mRNA相對表達量降低(P<0.05)；與芍藥苷組比較，激動劑組和芍藥苷+激動劑組Bcl-2 mRNA相對表達量升高，Bax mRNA相對表達量降低(P<0.05)；與激動劑組比較，芍藥苷+激動劑組Bcl-2 mRNA相對表達量降低，Bax mRNA相對表達量升高(P<0.05)。各組JAK2、STAT3 mRNA表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4、圖4。

與對照組比較，＊P<0.05；與芍藥苷組比較，#P<0.05；與激動劑組比較，△P<0.05。圖4 各組垂體瘤細胞JAK2、STAT3、Bcl-2和Bax mRNA水平比較柱狀圖

2.5 各組垂體瘤細胞JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達比較 各組垂體瘤細胞p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組比較，芍藥苷組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加，激動劑組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達減少(P<0.05)；與芍藥苷組比較，激動劑組和芍藥苷+激動劑組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達減少(P<0.05)；與激動劑組比較，芍藥苷+激動劑組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加(P<0.05)。各組JAK2、STAT3蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5、圖5。

圖5 各組垂體瘤細胞JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達條帶圖(A為對照組；B為芍藥苷組；C為激動劑組；D為芍藥苷+激動劑組)

3 討 論

垂體瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，流行病學(xué)研究表明，普通人群垂體瘤發(fā)病率為16.7%，目前的診治難題包括腫瘤復(fù)發(fā)及藥物抵抗等[8]。垂體瘤發(fā)病機制主要是異常的生理調(diào)節(jié)，由于靶腺負反饋調(diào)節(jié)的喪失或丘腦下部異常的正向調(diào)節(jié)，導(dǎo)致過度刺激增生，分化的、激素表達的垂體細胞譜系引起腺瘤發(fā)生，常伴有自發(fā)的激素超量分泌。不同的激素過量分泌取決于細胞起源。應(yīng)答性下丘腦激素和旁分泌增殖信號導(dǎo)致垂體細胞周期失調(diào)，伴有非整倍性、染色體拷貝數(shù)變異和抑制惡性轉(zhuǎn)化的細胞性衰老，癌基因激活或抑癌基因喪失[9]。垂體瘤的治療以外科手術(shù)為主，由于腫瘤侵襲結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在手術(shù)全切困難、全切率低，且有手術(shù)禁忌證、并發(fā)癥、術(shù)后復(fù)發(fā)等局限性。藥物作為重要的輔助治療手段，可減少激素的異常分泌，降低激素高分泌水平狀態(tài)，緩解內(nèi)分泌癥狀，減小腫瘤體積甚至消除腫瘤，從而延緩腫瘤復(fù)發(fā)。

芍藥苷是一種蒎烷單萜糖苷，具有多種生物學(xué)效應(yīng)且毒副作用小[10]。相關(guān)研究表明，芍藥苷具有抗癌活性，包括乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[11-15]?？鼓[瘤的作用機制為抑制腫瘤細胞的增殖和新血管形成，誘導(dǎo)細胞凋亡及抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。目前，芍藥苷治療垂體瘤的研究報道較少。本研究通過探討芍藥苷對垂體瘤細胞增殖凋亡的影響及作用機制，為芍藥苷相關(guān)藥物的研發(fā)及垂體瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，不同濃度芍藥苷對垂體瘤細胞的增殖有抑制作用，細胞存活率呈濃度依賴性。流式細胞分析實驗結(jié)果表明芍藥苷可誘導(dǎo)垂體瘤細胞凋亡。

STAT3是一種細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和免疫反應(yīng)等，參與啟動凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax等表達[16]。細胞外配體與膜受體結(jié)合引起受體亞基多聚化，JAK2在受體的胞漿側(cè)募集，發(fā)生磷酸化，p-JAK2可使STAT3通過SH2區(qū)域發(fā)生同源二聚化，促使STAT3磷酸化，活化的STAT3借助于核轉(zhuǎn)運蛋白α轉(zhuǎn)移到細胞核，進而與特異性核酸序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。相關(guān)研究顯示，50%以上的腫瘤包括實體腫瘤和血液學(xué)腫瘤(卵巢癌、前列腺癌、肺癌、白血病、淋巴瘤等)的發(fā)生與STAT3信號通路激活有關(guān)[17-18]。Zheng等[14]研究表明，芍藥苷通過抑制STAT3信號通路，抑制人胃癌細胞增殖。Nie等[15]研究表明，芍藥苷通過抑制STAT3通路，降低下游與細胞增殖和抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達，從而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的生長抑制和凋亡。本研究取對數(shù)期垂體瘤細胞，經(jīng)芍藥苷、STAT3通路激動劑及芍藥苷+激動劑處理后檢測JAK2、STAT3、Bcl-2和Bax mRNA、蛋白表達及p-JAK2、p-STAT3水平。結(jié)果顯示：芍藥苷可下調(diào)垂體瘤細胞p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2轉(zhuǎn)錄和表達，上調(diào)Bax轉(zhuǎn)錄和表達，抑制p-JAK2、p-STAT3激活，STAT3通路激動劑(Olanzapine)呈相反的作用效果，激動劑和芍藥苷處理后，激動劑對相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的促進或抑制作用被逆轉(zhuǎn)，提示芍藥苷通過調(diào)控STAT3信號通路抑制垂體瘤細胞增殖，促進其凋亡。

綜上所述，芍藥苷可抑制垂體瘤細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，其機制可能是通過抑制STAT3信號通路相關(guān)分子mRNA和蛋白表達，調(diào)控細胞增殖凋亡相關(guān)基因的表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為芍藥苷相關(guān)藥物的研發(fā)及其應(yīng)用于垂體瘤的臨床治療提供實驗支持。