金屬元素Cu、Fe對(duì)肝素鈉氧化過(guò)程的影響

田志鵬，李志敏，黃 棟，李利娜，王 亮

(河北常山生化藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050800)

肝素是一種高度硫酸化的糖胺聚糖[1]，作為一線抗凝血藥物，在臨床應(yīng)用已達(dá)80余年[2-4]，目前主要用于預(yù)防深靜脈血栓和肺栓塞的形成[5-6]。肝素在醫(yī)藥領(lǐng)域有著舉足輕重的地位，受到世界各國(guó)的廣泛重視，同時(shí)也是我國(guó)主要的出口藥物之一[7-8]。肝素鈉生產(chǎn)主要以豬小腸黏膜為起始原料，提取過(guò)程中首先去除大量雜質(zhì)得到肝素粗品，然后對(duì)肝素粗品進(jìn)行溶解、鹽解、熱變性、氧化等處理，最終精制純化得到肝素鈉精品[9]。

肝素鈉可以直接制成肝素鈉制劑供臨床使用，也可以進(jìn)一步加工，降解為低分子量肝素。《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)肝素鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括性狀、比旋度、鑒別、有關(guān)物質(zhì)、酸堿度、溶液澄清度與顏色、分子量及分子量分布、效價(jià)、核酸與蛋白質(zhì)含量、重金屬含量等指標(biāo)[10]。其中，分子量及分子量分布要求重均分子量應(yīng)為15 000～19 000 Da，分子量大于24 000 Da的級(jí)分不得大于20%，且分子量8 000～16 000 Da的級(jí)分與分子量16 000～24 000 Da的級(jí)分比應(yīng)不小于1.0；而效價(jià)測(cè)定要求抗Ⅱa因子效價(jià)(干品計(jì))≥180 IU·mg-1，抗Xa因子效價(jià)與抗Ⅱa因子效價(jià)比應(yīng)為0.9～1.1。

肝素鈉的生產(chǎn)應(yīng)從源頭開(kāi)始進(jìn)行全過(guò)程控制，以保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量[11]。肝素鈉中的元素雜質(zhì)主要來(lái)源于生產(chǎn)過(guò)程中用到的原輔料、生產(chǎn)設(shè)備、純化水和包裝材料，其中可能引入的元素雜質(zhì)為錳(Mn)、鉻(Cr)、鎳(Ni)、銅(Cu)、鉬(Mo)、鈦(Ti)、鐵(Fe)、釩(V)、砷(As)、鉛(Pb)、鈣(Ca)、鎂(Mg)等。而Cu、Fe作為常見(jiàn)金屬元素，被引入的風(fēng)險(xiǎn)較大。為此，作者在不同條件下制備肝素鈉，通過(guò)測(cè)定肝素鈉的分子量及分子量分布、效價(jià)、二糖組成，研究金屬元素Cu、Fe對(duì)肝素鈉氧化過(guò)程的影響，擬對(duì)肝素鈉的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

肝素鈉粗品(除蛋白)，河北常山生化藥業(yè)股份有限公司；30%過(guò)氧化氫，西隴科學(xué)股份有限公司；鹽酸，煙臺(tái)雙雙化工有限公司；氫氧化鈉，天津永大化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉，河北華晨藥業(yè)有限公司；乙醇，梅河口阜康酒精有限公司；銅標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg·mL-1)、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg·mL-1)，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；肝素鈉二糖標(biāo)準(zhǔn)品(ΔⅠA、ΔⅡA、ΔⅢA、ΔⅣA、ΔⅠS、ΔⅡS、ΔⅢS、ΔⅣS)，英國(guó)Dextra 公司；高氯酸鈉，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

HH-8S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器公司；FE28型精密pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；0.45 μm濾膜，默克化工技術(shù)有限公司；DZF-6210型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；S10-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司；Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國(guó)熱電。

1.2 肝素鈉樣品的制備

組別設(shè)置：對(duì)照組CG、實(shí)驗(yàn)組EGC、實(shí)驗(yàn)組EGI。對(duì)照組CG：不含Cu2+、Fe3+；實(shí)驗(yàn)組EGC：加入銅標(biāo)準(zhǔn)溶液，使Cu2+濃度分別為10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1，依次記為EGC-1～EGC-4；實(shí)驗(yàn)組EGI：加入鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，使Fe3+濃度分別為10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1，依次記為EGI-1～EGI-4。

制備方法：參照文獻(xiàn)[12]，將10 g肝素鈉粗品加入到150 mL純化水中，攪拌溶解，按組別設(shè)置分別加入銅標(biāo)準(zhǔn)溶液或鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入氯化鈉4.5 g，攪拌溶解；升溫至30 ℃，調(diào)節(jié)pH值至10.0；加入30%過(guò)氧化氫4.5 mL，氧化36 h，監(jiān)控溫度、pH值，若有偏離及時(shí)調(diào)整；將氧化后的溶液過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值至6.2，加入95%乙醇沉淀，靜置12 h；收集沉淀，研磨，乙醇脫水，60 ℃下真空干燥，即得肝素鈉樣品。

1.3 分析方法

1.3.1 分子量及分子量分布

參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)四部通則0514分子排阻色譜法測(cè)定肝素鈉分子量及分子量分布。

取肝素鈉樣品、肝素鈉分子量對(duì)照品適量，分別加流動(dòng)相溶解并稀釋成濃度為5 mg·mL-1的溶液。以親水性鍵合硅膠為填充劑(TSK預(yù)柱，6 mm×40 mm；TSKgel G4000SWXL，7.8 mm×300 mm；TSKgel G3000SWXL，7.8 mm×300 mm；串聯(lián)使用)，以0.1 mol·L-1醋酸銨溶液為流動(dòng)相，流速為0.6 mL·min-1，柱溫為30 ℃，示差折光檢測(cè)器，進(jìn)樣量為25 μL。取對(duì)照溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算肝素鈉峰的總面積及每個(gè)點(diǎn)的累積峰面積百分比。以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)、分子量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制校正曲線。另取肝素鈉樣品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按下式計(jì)算肝素鈉樣品的重均分子量(MW)。

MW=∑(RiMi)/∑Ri

式中:Ri為洗脫的i級(jí)分的物質(zhì)的量，即示差色譜圖的峰高;Mi為由校正曲線計(jì)算得出的i級(jí)分的分子量。

1.3.2 效價(jià)

參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)四部通則1208肝素生物測(cè)定法測(cè)定抗Ⅱa因子、抗Xa因子效價(jià)。

1.3.3 二糖組成

精密稱取肝素鈉樣品適量，加水溶解配制成20 mg·mL-1溶液；精密量取上述溶液20 μL、醋酸鈣溶液(pH值 7.0)70 μL、肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合溶液100 μL，混勻；于25 ℃水浴中酶解48 h，即為肝素鈉樣品溶液。另精密稱取肝素鈉二糖標(biāo)準(zhǔn)品ΔⅠA、ΔⅡA、ΔⅢA、ΔⅣA、ΔⅠS、ΔⅡS、ΔⅢS、ΔⅣS適量，加水溶解配制成0.25 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各肝素鈉二糖的保留時(shí)間定性，參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)四部通則0512高效液相色譜法測(cè)定肝素鈉樣品溶液中二糖的相對(duì)含量。色譜條件：強(qiáng)陰離子交換柱(Thermo Hypersil SAX，250 mm×4.6 mm)；0.028%磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)為流動(dòng)相A，高氯酸鈉-磷酸鹽溶液(取高氯酸鈉140 g，用流動(dòng)相A溶解并稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)為流動(dòng)相B；流速0.45 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)234 nm；柱溫50 ℃；進(jìn)樣量10 μL。按表1進(jìn)行線性梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相線性梯度洗脫條件

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+、Fe3+對(duì)肝素鈉分子量及分子量分布的影響(表2)

由表2可以看出，與對(duì)照組CG相比，當(dāng)Cu2+、Fe3+的含量較少時(shí)，肝素鈉分子量及分子量分布變化較?。浑S著含量的增加，分子量下降明顯，低分子量的糖片段占比增加。說(shuō)明在氧化過(guò)程中，Cu2+、Fe3+對(duì)肝素鈉糖鏈具有破壞作用，由于肝素鈉為多糖鏈混合物[13]，氧化過(guò)程中Cu2+或Fe3+催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生自由基，使肝素鈉糖鏈斷裂，肝素鈉發(fā)生降解，導(dǎo)致分子量降低，低分子量的糖片段占比增加。當(dāng)Cu2+、Fe3+含量相同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組EGC的肝素鈉分子量比實(shí)驗(yàn)組EGI的低，說(shuō)明相同條件下，Cu2+對(duì)肝素鈉的破壞作用較Fe3+的強(qiáng)一些。

表2 Cu2+、Fe3+對(duì)肝素鈉分子量及分子量分布的影響

2.2 Cu2+、Fe3+對(duì)肝素鈉效價(jià)的影響(表3)

表3 Cu2+、Fe3+對(duì)肝素鈉效價(jià)的影響

經(jīng)檢測(cè)，肝素鈉粗品(除蛋白)的抗Ⅱa因子效價(jià)為191.7 IU·mg-1。由表3可以看出，當(dāng)Cu2+、Fe3+含量低于20 mg·L-1時(shí)，肝素鈉效價(jià)與對(duì)照組CG相比變化不大；但隨著Cu2+、Fe3+含量的增加，效價(jià)及效價(jià)回收率下降明顯。由于肝素鈉抗凝的主要機(jī)制在于它能結(jié)合血漿中的一些抗凝蛋白，使抗凝蛋白的活性增強(qiáng)，而抗凝活性主要取決于可與抗凝血酶結(jié)合的特異性五糖序列；Cu2+、Fe3+的破壞作用使肝素鈉糖苷鍵斷裂，在特異性五糖序列上發(fā)生裂解，從而導(dǎo)致效價(jià)及效價(jià)回收率降低。同樣，相同含量下，Cu2+對(duì)肝素鈉效價(jià)的影響大于Fe3+。

2.3 Cu2+、Fe3+對(duì)肝素鈉二糖組成的影響

通過(guò)直接比對(duì)肝素鈉二糖標(biāo)準(zhǔn)品和肝素鈉酶解產(chǎn)物在SAX-HPLC系統(tǒng)上分離的出峰時(shí)間就可以確定肝素鈉的結(jié)構(gòu)。對(duì)照組CG、實(shí)驗(yàn)組EGC和實(shí)驗(yàn)組EGI的肝素鈉二糖的HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

1.ΔⅣA 2.ΔⅣS 3.ΔⅡA 4.ΔⅢA 5.ΔⅡS 6.ΔⅢS 7.ΔⅠA 8.ΔⅠS

由圖1a可以看出，常見(jiàn)的8種肝素鈉二糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間如下:ΔⅣA(7.1 min)，ΔⅣS(14.2 min)，ΔⅡA(15.8 min)，ΔⅢA(17.5 min)，ΔⅡS(20.8 min)，ΔⅢS(22.6 min)，ΔⅠA(25.6 min)，ΔⅠS(29.2 min);實(shí)驗(yàn)組EGC、EGI的肝素鈉二糖出峰時(shí)間與對(duì)照組CG的基本一致。

二糖組成分析是評(píng)價(jià)肝素鈉序列、結(jié)構(gòu)組成和質(zhì)量的最重要的方法之一。對(duì)照組CG、實(shí)驗(yàn)組EGC和實(shí)驗(yàn)組EGI的肝素鈉二糖組成分析見(jiàn)表4。

表4 肝素鈉二糖組成分析結(jié)果

由表4可以看出，Cu2+、Fe3+含量較少時(shí)，肝素鈉二糖組成變化相對(duì)于對(duì)照組CG不是很明顯；隨著Cu2+、Fe3+含量的增加，ΔⅣA的相對(duì)含量整體逐漸升高，同時(shí)肝素鈉主要二糖ΔⅠS的相對(duì)含量逐漸降低，且Cu2+對(duì)二糖組成變化的影響更為明顯。

2.4 討論

本研究在考察金屬元素Cu、Fe對(duì)肝素鈉氧化過(guò)程的影響時(shí)，采用的是一次加入過(guò)氧化氫的一次氧化，而當(dāng)前肝素鈉精制工藝廣泛采用的是兩次加入過(guò)氧化氫的二次氧化[14]。氧化次數(shù)的增加勢(shì)必會(huì)增強(qiáng)Cu2+、Fe3+對(duì)肝素鈉結(jié)構(gòu)的破壞作用，對(duì)肝素鈉成品產(chǎn)生更大影響。

因此，在肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)對(duì)所用粗品、輔料、工藝用水、生產(chǎn)設(shè)備中可能引入的Cu2+、Fe3+進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)控制，必要時(shí)應(yīng)增加Cu2+、Fe3+的去除工藝，以保證肝素鈉產(chǎn)品質(zhì)量。

3 結(jié)論

Cu、Fe的存在會(huì)對(duì)肝素鈉的氧化過(guò)程產(chǎn)生影響，使肝素鈉糖苷鍵斷裂、分子量降低、分子量分布發(fā)生變化、低分子量的糖片段占比增加，同時(shí)，也影響肝素鈉的效價(jià)，使效價(jià)及效價(jià)回收率降低，造成產(chǎn)品質(zhì)量不達(dá)標(biāo)。Cu、Fe對(duì)肝素鈉的影響與其含量有很大關(guān)系。體系中Cu2+、Fe3+含量越多，對(duì)肝素鈉的破壞作用越強(qiáng)，分子量及效價(jià)下降越明顯，且相同含量下Cu2+的破壞作用強(qiáng)于Fe3+；體系中Cu2+、Fe3+的含量越多，肝素鈉二糖ΔⅣA的相對(duì)含量整體越高，主要二糖ΔⅠS的相對(duì)含量則越低。