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    克拉瑪依桑枝提取物的抗氧化及抑菌活性研究

    2022-09-01 04:53:16李金芳陳晴晴駢繼鑫
    化學(xué)與生物工程 2022年8期
    關(guān)鍵詞:桑枝克拉瑪依蒸餾水

    李金芳,崔 潔,陳晴晴,郝 治,駢繼鑫*

    (1.新疆第二醫(yī)學(xué)院,新疆 克拉瑪依 834000;2.新疆維吾爾自治區(qū)教育廳,新疆 烏魯木齊830000)

    桑枝為桑樹的嫩枝,具有清熱祛風(fēng)、生津消渴、降血壓等功效?!侗静菰傩隆分杏涊d桑枝“壯肺氣,燥濕,滋腎水,通經(jīng)”;《本草備要》中記載桑枝“利關(guān)節(jié),養(yǎng)津液,行水祛風(fēng)”;《醫(yī)部全錄》中記載桑枝“逐濕,令人瘦,過肥者宜久服之”[1]。

    桑枝中含有豐富的天然活性物質(zhì),如揮發(fā)油、多糖、黃酮和生物堿等。桑枝中還富含纖維素,可用作栽培食用菌的原料[2-4]。桑枝中的1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)具有降血糖、降脂、抗腫瘤、抗病毒和抗癌等作用[5-7],是目前的研究熱點(diǎn)。劉鑫彤等[8]利用大孔樹脂分離純化桑枝多酚,得到桑皮苷A和桑皮黃素,通過DPPH法和ABTS法測(cè)試發(fā)現(xiàn),其具有較強(qiáng)的抗氧化活性。鐘雪敏等[9]從魯桑枝的90%乙醇提取物中分離得到6個(gè)黃酮類成分,其中3個(gè)黃酮類成分是首次分離得到。王晶潔[10]用桑枝多糖治療2型糖尿病大鼠,發(fā)現(xiàn)桑枝多糖不僅可以降低血糖、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝,還可以保護(hù)心肌及腎功能。黃倩等[11]研究發(fā)現(xiàn),桑枝多糖預(yù)防性給藥能夠改善小鼠腎缺血再灌注損傷,減輕炎癥。

    目前,關(guān)于新疆桑枝提取物活性的研究報(bào)道較少。為此,作者以克拉瑪依桑枝為研究對(duì)象,分別使用水、乙醇提取桑枝的活性成分,通過測(cè)定桑枝提取物對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的清除率及還原能力,評(píng)價(jià)其抗氧化活性;并研究桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性,為新疆桑蠶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定的研究基礎(chǔ)。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 材料、試劑與儀器

    桑枝飲片(批號(hào)161116),安徽百禾堂中藥飲片有限公司;桑枝,采自新疆克拉瑪依。

    DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基,批號(hào)S21J11M116469),源葉生物;水楊酸(批號(hào)20180604)、抗壞血酸(VC,批號(hào)20200421)、氯化鈉(批號(hào)20201011),分析純,天津盛奧化學(xué)試劑有限公司;硫酸亞鐵(批號(hào)P1622613)、鐵氰化鉀(批號(hào)P1639458)、三氯化鐵(批號(hào)P1606058)、三氯乙酸(批號(hào)P1671997)、過硫酸鉀(批號(hào)P1646704),分析純,DAMAS-BETA;PBS緩沖溶液(0.01 mol·L-1,pH值7.2~7.4,批號(hào)20201020),Solarbio;ABTS[2,2′-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽,HPLC純度≥98%,批號(hào)P1849860],Sigma-Aldrich;無水乙醇(批號(hào)20151008),分析純,天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;酵母浸粉(批號(hào)01-012)、瓊脂粉(批號(hào)01-023),生物試劑,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;胰蛋白(批號(hào)1462110),生物試劑,Oxoid。

    UV1801G型紫外可見分光光度計(jì),天津冠澤科技有限公司;LE204E型電子天平(萬分之一),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;YP202N型電子天平(百分之一),上海菁海儀器有限公司;DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋,天津泰斯特儀器有限公司;BGZ-140型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;KQ-700DEX型超聲儀,昆山超聲儀器有限公司;PHSJ-3F型pH計(jì),上海儀電科學(xué)股份有限公司;N-1300D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,東京理化;FW135型高速萬能粉碎機(jī),北京永光明醫(yī)療儀器有限公司;Eco-S15UV型實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng),上海和泰儀器公司;THZ-82B型氣浴恒溫振蕩器,金壇開發(fā)區(qū)吉特實(shí)驗(yàn)儀器廠;LDZF-30L型立式高壓蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠。

    1.2 桑枝提取物的制備

    桑枝水提物:分別將桑枝飲片和克拉瑪依桑枝進(jìn)行預(yù)處理后,在pH值為2.5、提取溫度為65 ℃、液料比為30∶1 (mL∶g,下同)、提取功率為300 W、提取時(shí)間為30 min的最佳條件下提取其中的活性成分,分別得到桑枝飲片水提物(簡稱Y/水)、克拉瑪依桑枝水提物(簡稱K/水)。

    桑枝醇提物:分別將桑枝飲片和克拉瑪依桑枝進(jìn)行預(yù)處理后,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取溫度為60 ℃、液料比為20∶1、提取功率為280 W、提取時(shí)間為30 min的最佳條件下提取其中的活性成分,分別得到桑枝飲片醇提物(簡稱Y/醇)、克拉瑪依桑枝醇提物(簡稱K/醇)。

    1.3 桑枝提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)

    1.3.1 樣品溶液的制備

    (1)桑枝飲片水提物溶液的配制:精密稱取桑枝飲片水提物0.050 2 g置于25 mL容量瓶中,加適量蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,得濃度為2.0 mg·mL-1的桑枝飲片水提物儲(chǔ)備液;再用蒸餾水依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的樣品溶液,備用。

    (2)桑枝飲片醇提物溶液的配制:精密稱取桑枝飲片醇提物0.021 0 g置于10 mL容量瓶中,加適量70%乙醇溶解并定容至刻度,搖勻,得濃度為2.1 mg·mL-1的桑枝飲片醇提物儲(chǔ)備液;再用70%乙醇依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的樣品溶液,備用。

    (3)克拉瑪依桑枝水提物溶液的配制:精密稱取克拉瑪依桑枝水提物0.021 2 g置于10 mL容量瓶中,加適量蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,得濃度為2.1 mg·mL-1的克拉瑪依桑枝水提物儲(chǔ)備液;再用蒸餾水依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的樣品溶液,備用。

    (4)克拉瑪依桑枝醇提物溶液的配制:精密稱取克拉瑪依桑枝醇提物0.020 8 g置于10 mL容量瓶中,加適量70%乙醇溶解并定容至刻度,搖勻,得濃度為2.08 mg·mL-1的克拉瑪依桑枝醇提物儲(chǔ)備液;再用70%乙醇依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的樣品溶液,備用。

    (5)VC溶液的配制:精密稱取VC 0.020 0 g置于10 mL容量瓶中,加適量蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,得濃度為2.0 mg·mL-1的VC儲(chǔ)備液;再用蒸餾水依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為1.5、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02的樣品溶液,備用。

    1.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定[12]

    DPPH自由基溶液的配制:精密稱取DPPH粉末8.001 5 g置于100 mL棕色容量瓶中,加適量無水乙醇溶解并定容至刻度,4 ℃保存,備用。

    DPPH自由基清除率的測(cè)定:精密移取不同濃度的樣品溶液各3.00 mL置于10 mL具塞試管中,加入DPPH自由基溶液3.00 mL,混勻,暗處放置30 min,用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定512 nm處吸光度(A1)。以等體積無水乙醇代替樣品溶液,同法操作,測(cè)定其吸光度(A0)。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率:

    (1)

    1.3.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定[13]

    9 mmol·L-1FeSO4·7H2O溶液的配制:精密稱取FeSO4·7H2O 0.125 1 g置于50 mL棕色容量瓶中,加適量蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,4 ℃保存,備用。

    8.8 mmol·L-1H2O2溶液的配制:精密移取30%H2O21.5 mL置于50 mL棕色容量瓶中,加適量蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,4 ℃保存,備用。

    9 mmol·L-1水楊酸溶液的配制:精密稱取水楊酸0.120 0 g置于100 mL容量瓶中,加適量無水乙醇溶解并定容至刻度,搖勻,4 ℃保存,備用。

    羥基自由基清除率的測(cè)定:精密移取不同濃度的樣品溶液各150 μL置于10 mL具塞試管中,依次加入9 mmol·L-1水楊酸溶液100 μL、9 mmol·L-1FeSO4·7H2O溶液100 μL、蒸餾水1 050 μL,搖勻后,再加入8.8 mmol·L-1H2O2溶液100 μL,37 ℃恒溫反應(yīng)15 min,用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定510 nm 處吸光度(A1)。以等體積蒸餾水代替樣品溶液,同法操作,測(cè)定其吸光度(A0);以等體積蒸餾水代替H2O2溶液,同法操作,測(cè)定其吸光度(A2);以相同濃度VC溶液作為陽性對(duì)照。按式(2)計(jì)算羥基自由基清除率:

    (2)

    1.3.4 還原能力的測(cè)定[13]

    1%鐵氰化鉀溶液的配制:精密稱取鐵氰化鉀1.000 0 g置于100 mL容量瓶中,加適量蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,4 ℃保存,備用。

    0.1%三氯化鐵溶液的配制:精密稱取三氯化鐵0.050 2 g置于50 mL棕色容量瓶中,加適量蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,4 ℃保存,備用。

    10%三氯乙酸溶液的配制:精密稱取三氯乙酸5.000 1 g置于50 mL棕色容量瓶中,加適量蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,4 ℃保存,備用。

    還原能力的測(cè)定:精密移取不同濃度的樣品溶液各1 mL置于10 mL具塞試管中,依次加入PBS緩沖溶液2 mL、1%鐵氰化鉀溶液1.5 mL,搖勻,50 ℃恒溫水浴20 min,置于冷水中快速冷卻至室溫;再加入10%三氯乙酸溶液1 mL,混勻后,取2 mL置于另一支10 mL具塞試管中,加入0.1%三氯化鐵溶液2 mL,搖勻,立即測(cè)定700 nm處吸光度。以吸光度表征還原能力,吸光度越大,還原能力越強(qiáng)[14]。以蒸餾水代替樣品溶液,同法操作,作為空白對(duì)照;以相同濃度VC溶液作為陽性對(duì)照。

    1.3.5 ABTS自由基清除能力的測(cè)定[15]

    2.45 mmol·L-1過硫酸鉀溶液的配制:精密稱取過硫酸鉀0.033 1 g置于50 mL容量瓶中,加適量蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,4 ℃保存,備用。

    ABTS自由基工作液的配制:精密稱取ABTS粉末0.096 0 g置于裝有25 mL 2.45 mmol·L-1過硫酸鉀溶液的燒杯中,溶解后,轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,室溫避光靜置24 h,即得ABTS自由基儲(chǔ)備液;將ABTS自由基儲(chǔ)備液用無水乙醇稀釋至734 nm處吸光度為0.70±0.05,即得ABTS自由基工作液。

    ABTS自由基清除率的測(cè)定:精密移取不同濃度的樣品溶液各1.00 mL置于10 mL具塞試管中,加入ABTS自由基工作液6.00 mL,混勻,室溫靜置6 min,用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定734 nm處吸光度(A1)。用等體積蒸餾水代替樣品溶液,同法操作,測(cè)定其吸光度(A0);用等體積蒸餾水代替ABTS自由基工作液,測(cè)定其吸光度(A2);以相同濃度VC溶液作為陽性對(duì)照。按式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率:

    (3)

    1.4 桑枝提取物的抑菌活性評(píng)價(jià)

    分別稱取各提取物100 mg溶于1 mL相應(yīng)的提取溶劑中,配制成濃度為100 mg·mL-1的樣品溶液。將滅菌后的圓形濾紙片(直徑6 mm)放入樣品溶液中浸泡30 min,取出后放在稱量紙上晾干,置于紫外燈下。

    采用濾紙片法測(cè)量各提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑。用移液槍吸取 200 μL菌液,均勻涂布于培養(yǎng)基表面;用鑷子將濾紙片呈四邊形形狀鋪在培養(yǎng)基表面;將培養(yǎng)皿置于37 ℃生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑,平行測(cè)量3次,取平均值。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 桑枝提取物對(duì)DPPH自由基的清除率(圖1)

    圖1 桑枝提取物對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH free radicals by Ramulus mori extracts

    由圖1可知,桑枝提取物對(duì)DPPH自由基的清除率隨著提取物濃度的增加逐漸升高,其中桑枝水提物對(duì)DPPH自由基的清除率升幅較快,而桑枝醇提物的升幅較慢;相同濃度下,桑枝提取物對(duì)DPPH自由基的清除率低于VC;在0.4~1.4 mg·mL-1范圍內(nèi),克拉瑪依桑枝水提物對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于桑枝飲片水提物。

    2.2 桑枝提取物對(duì)羥基自由基的清除率(圖2)

    圖2 桑枝提取物對(duì)羥基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of hydroxyl free radicals by Ramulus mori extracts

    由圖2可知,桑枝提取物對(duì)羥基自由基的清除率隨著提取物濃度的增加逐漸升高;在0.7~2.0 mg·mL-1范圍內(nèi),桑枝水提物對(duì)羥基自由基的清除率高于VC,其中,克拉瑪依桑枝水提物對(duì)羥基自由基的清除能力最強(qiáng),在濃度為1.5 mg·mL-1時(shí),清除率達(dá)到70.4%。

    2.3 桑枝提取物的還原能力(圖3)

    圖3 桑枝提取物的還原能力Fig.3 Reducing ability of Ramulus mori extracts

    由圖3可知,桑枝提取物具有一定的還原能力,且隨著提取物濃度的增加逐漸增強(qiáng);相同濃度下,克拉瑪依桑枝醇提物的還原能力強(qiáng)于其它3種提取物,但均弱于VC。

    2.4 桑枝提取物對(duì)ABTS自由基的清除率(圖4)

    圖4 桑枝提取物對(duì)ABTS自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS free radicals by Ramulus mori extracts

    由圖4可知,相同濃度下,桑枝提取物對(duì)ABTS自由基的清除率均低于VC;克拉瑪依桑枝水提物對(duì)ABTS自由基的清除率高于桑枝飲片水提物,克拉瑪依桑枝醇提物對(duì)ABTS自由基的清除率整體高于桑枝飲片醇提物;當(dāng)濃度為0.20 mg·mL-1時(shí),克拉瑪依桑枝醇提物對(duì)ABTS自由基的清除能力與VC接近。

    2.5 桑枝提取物的抑菌活性

    100 mg·mL-1桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,抑菌圈直徑如表1所示。

    a,b,c.大腸桿菌 d,e,f.金黃色葡萄球菌

    表1 桑枝提取物的抑菌圈直徑/mm

    由表1可知,當(dāng)濃度為100 mg·mL-1時(shí),克拉瑪依桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性,抑菌圈直徑最小值為7.6 mm,最大值為9.0 mm;克拉瑪依桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性接近或優(yōu)于桑枝飲片提取物。

    3 結(jié)論

    克拉瑪依桑枝提取物對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基均具有較強(qiáng)的清除能力;當(dāng)濃度為1.5 mg·mL-1時(shí),克拉瑪依桑枝水提物對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到70.4%,清除能力優(yōu)于VC;當(dāng)濃度為100 mg·mL-1時(shí),克拉瑪依桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性,抑菌圈直徑最小值為7.6 mm,最大值為9.0 mm??死斠郎Vμ崛∥锏目寡趸钚约耙志钚越咏騼?yōu)于桑枝飲片提取物,為新疆蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了理論依據(jù)。

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