克拉瑪依桑枝提取物的抗氧化及抑菌活性研究

李金芳，崔 潔，陳晴晴，郝 治，駢繼鑫*

(1.新疆第二醫(yī)學(xué)院，新疆 克拉瑪依 834000；2.新疆維吾爾自治區(qū)教育廳，新疆 烏魯木齊830000)

桑枝為桑樹的嫩枝，具有清熱祛風(fēng)、生津消渴、降血壓等功效?！侗静菰傩隆分杏涊d桑枝“壯肺氣，燥濕，滋腎水，通經(jīng)”；《本草備要》中記載桑枝“利關(guān)節(jié)，養(yǎng)津液，行水祛風(fēng)”；《醫(yī)部全錄》中記載桑枝“逐濕，令人瘦，過肥者宜久服之”[1]。

桑枝中含有豐富的天然活性物質(zhì)，如揮發(fā)油、多糖、黃酮和生物堿等。桑枝中還富含纖維素，可用作栽培食用菌的原料[2-4]。桑枝中的1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)具有降血糖、降脂、抗腫瘤、抗病毒和抗癌等作用[5-7]，是目前的研究熱點(diǎn)。劉鑫彤等[8]利用大孔樹脂分離純化桑枝多酚，得到桑皮苷A和桑皮黃素，通過DPPH法和ABTS法測(cè)試發(fā)現(xiàn)，其具有較強(qiáng)的抗氧化活性。鐘雪敏等[9]從魯桑枝的90%乙醇提取物中分離得到6個(gè)黃酮類成分，其中3個(gè)黃酮類成分是首次分離得到。王晶潔[10]用桑枝多糖治療2型糖尿病大鼠，發(fā)現(xiàn)桑枝多糖不僅可以降低血糖、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝，還可以保護(hù)心肌及腎功能。黃倩等[11]研究發(fā)現(xiàn)，桑枝多糖預(yù)防性給藥能夠改善小鼠腎缺血再灌注損傷，減輕炎癥。

目前，關(guān)于新疆桑枝提取物活性的研究報(bào)道較少。為此，作者以克拉瑪依桑枝為研究對(duì)象，分別使用水、乙醇提取桑枝的活性成分，通過測(cè)定桑枝提取物對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的清除率及還原能力，評(píng)價(jià)其抗氧化活性；并研究桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，為新疆桑蠶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

桑枝飲片(批號(hào)161116)，安徽百禾堂中藥飲片有限公司；桑枝，采自新疆克拉瑪依。

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基，批號(hào)S21J11M116469)，源葉生物；水楊酸(批號(hào)20180604)、抗壞血酸(VC，批號(hào)20200421)、氯化鈉(批號(hào)20201011)，分析純，天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵(批號(hào)P1622613)、鐵氰化鉀(批號(hào)P1639458)、三氯化鐵(批號(hào)P1606058)、三氯乙酸(批號(hào)P1671997)、過硫酸鉀(批號(hào)P1646704)，分析純，DAMAS-BETA；PBS緩沖溶液(0.01 mol·L-1，pH值7.2～7.4，批號(hào)20201020)，Solarbio；ABTS[2,2′-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽，HPLC純度≥98%，批號(hào)P1849860]，Sigma-Aldrich；無水乙醇(批號(hào)20151008)，分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；酵母浸粉(批號(hào)01-012)、瓊脂粉(批號(hào)01-023)，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白(批號(hào)1462110)，生物試劑，Oxoid。

UV1801G型紫外可見分光光度計(jì)，天津冠澤科技有限公司；LE204E型電子天平(萬分之一)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；YP202N型電子天平(百分之一)，上海菁海儀器有限公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；BGZ-140型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ-700DEX型超聲儀，昆山超聲儀器有限公司；PHSJ-3F型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)股份有限公司；N-1300D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化；FW135型高速萬能粉碎機(jī)，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；Eco-S15UV型實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)，上海和泰儀器公司；THZ-82B型氣浴恒溫振蕩器，金壇開發(fā)區(qū)吉特實(shí)驗(yàn)儀器廠；LDZF-30L型立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 桑枝提取物的制備

桑枝水提物：分別將桑枝飲片和克拉瑪依桑枝進(jìn)行預(yù)處理后，在pH值為2.5、提取溫度為65 ℃、液料比為30∶1 (mL∶g，下同)、提取功率為300 W、提取時(shí)間為30 min的最佳條件下提取其中的活性成分，分別得到桑枝飲片水提物(簡稱Y/水)、克拉瑪依桑枝水提物(簡稱K/水)。

桑枝醇提物：分別將桑枝飲片和克拉瑪依桑枝進(jìn)行預(yù)處理后，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取溫度為60 ℃、液料比為20∶1、提取功率為280 W、提取時(shí)間為30 min的最佳條件下提取其中的活性成分，分別得到桑枝飲片醇提物(簡稱Y/醇)、克拉瑪依桑枝醇提物(簡稱K/醇)。

1.3 桑枝提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.1 樣品溶液的制備

(1)桑枝飲片水提物溶液的配制：精密稱取桑枝飲片水提物0.050 2 g置于25 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為2.0 mg·mL-1的桑枝飲片水提物儲(chǔ)備液；再用蒸餾水依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的樣品溶液，備用。

(2)桑枝飲片醇提物溶液的配制：精密稱取桑枝飲片醇提物0.021 0 g置于10 mL容量瓶中，加適量70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為2.1 mg·mL-1的桑枝飲片醇提物儲(chǔ)備液；再用70%乙醇依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的樣品溶液，備用。

(3)克拉瑪依桑枝水提物溶液的配制：精密稱取克拉瑪依桑枝水提物0.021 2 g置于10 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為2.1 mg·mL-1的克拉瑪依桑枝水提物儲(chǔ)備液；再用蒸餾水依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的樣品溶液，備用。

(4)克拉瑪依桑枝醇提物溶液的配制：精密稱取克拉瑪依桑枝醇提物0.020 8 g置于10 mL容量瓶中，加適量70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為2.08 mg·mL-1的克拉瑪依桑枝醇提物儲(chǔ)備液；再用70%乙醇依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的樣品溶液，備用。

(5)VC溶液的配制：精密稱取VC 0.020 0 g置于10 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為2.0 mg·mL-1的VC儲(chǔ)備液；再用蒸餾水依次稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為1.5、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02的樣品溶液，備用。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定[12]

DPPH自由基溶液的配制：精密稱取DPPH粉末8.001 5 g置于100 mL棕色容量瓶中，加適量無水乙醇溶解并定容至刻度，4 ℃保存，備用。

DPPH自由基清除率的測(cè)定：精密移取不同濃度的樣品溶液各3.00 mL置于10 mL具塞試管中，加入DPPH自由基溶液3.00 mL，混勻，暗處放置30 min，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定512 nm處吸光度(A1)。以等體積無水乙醇代替樣品溶液，同法操作，測(cè)定其吸光度(A0)。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(1)

1.3.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定[13]

9 mmol·L-1FeSO4·7H2O溶液的配制：精密稱取FeSO4·7H2O 0.125 1 g置于50 mL棕色容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃保存，備用。

8.8 mmol·L-1H2O2溶液的配制：精密移取30%H2O21.5 mL置于50 mL棕色容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃保存，備用。

9 mmol·L-1水楊酸溶液的配制：精密稱取水楊酸0.120 0 g置于100 mL容量瓶中，加適量無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃保存，備用。

羥基自由基清除率的測(cè)定：精密移取不同濃度的樣品溶液各150 μL置于10 mL具塞試管中，依次加入9 mmol·L-1水楊酸溶液100 μL、9 mmol·L-1FeSO4·7H2O溶液100 μL、蒸餾水1 050 μL，搖勻后，再加入8.8 mmol·L-1H2O2溶液100 μL，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定510 nm 處吸光度(A1)。以等體積蒸餾水代替樣品溶液，同法操作，測(cè)定其吸光度(A0)；以等體積蒸餾水代替H2O2溶液，同法操作，測(cè)定其吸光度(A2)；以相同濃度VC溶液作為陽性對(duì)照。按式(2)計(jì)算羥基自由基清除率：

(2)

1.3.4 還原能力的測(cè)定[13]

1%鐵氰化鉀溶液的配制：精密稱取鐵氰化鉀1.000 0 g置于100 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃保存，備用。

0.1%三氯化鐵溶液的配制：精密稱取三氯化鐵0.050 2 g置于50 mL棕色容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃保存，備用。

10%三氯乙酸溶液的配制：精密稱取三氯乙酸5.000 1 g置于50 mL棕色容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃保存，備用。

還原能力的測(cè)定：精密移取不同濃度的樣品溶液各1 mL置于10 mL具塞試管中，依次加入PBS緩沖溶液2 mL、1%鐵氰化鉀溶液1.5 mL，搖勻，50 ℃恒溫水浴20 min，置于冷水中快速冷卻至室溫；再加入10%三氯乙酸溶液1 mL，混勻后，取2 mL置于另一支10 mL具塞試管中，加入0.1%三氯化鐵溶液2 mL，搖勻，立即測(cè)定700 nm處吸光度。以吸光度表征還原能力，吸光度越大，還原能力越強(qiáng)[14]。以蒸餾水代替樣品溶液，同法操作，作為空白對(duì)照；以相同濃度VC溶液作為陽性對(duì)照。

1.3.5 ABTS自由基清除能力的測(cè)定[15]

2.45 mmol·L-1過硫酸鉀溶液的配制：精密稱取過硫酸鉀0.033 1 g置于50 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃保存，備用。

ABTS自由基工作液的配制：精密稱取ABTS粉末0.096 0 g置于裝有25 mL 2.45 mmol·L-1過硫酸鉀溶液的燒杯中，溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，室溫避光靜置24 h，即得ABTS自由基儲(chǔ)備液；將ABTS自由基儲(chǔ)備液用無水乙醇稀釋至734 nm處吸光度為0.70±0.05,即得ABTS自由基工作液。

ABTS自由基清除率的測(cè)定：精密移取不同濃度的樣品溶液各1.00 mL置于10 mL具塞試管中，加入ABTS自由基工作液6.00 mL，混勻，室溫靜置6 min，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定734 nm處吸光度(A1)。用等體積蒸餾水代替樣品溶液，同法操作，測(cè)定其吸光度(A0)；用等體積蒸餾水代替ABTS自由基工作液，測(cè)定其吸光度(A2)；以相同濃度VC溶液作為陽性對(duì)照。按式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率：

(3)

1.4 桑枝提取物的抑菌活性評(píng)價(jià)

分別稱取各提取物100 mg溶于1 mL相應(yīng)的提取溶劑中，配制成濃度為100 mg·mL-1的樣品溶液。將滅菌后的圓形濾紙片(直徑6 mm)放入樣品溶液中浸泡30 min，取出后放在稱量紙上晾干，置于紫外燈下。

采用濾紙片法測(cè)量各提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑。用移液槍吸取 200 μL菌液，均勻涂布于培養(yǎng)基表面；用鑷子將濾紙片呈四邊形形狀鋪在培養(yǎng)基表面；將培養(yǎng)皿置于37 ℃生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，平行測(cè)量3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 桑枝提取物對(duì)DPPH自由基的清除率(圖1)

圖1 桑枝提取物對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH free radicals by Ramulus mori extracts

由圖1可知，桑枝提取物對(duì)DPPH自由基的清除率隨著提取物濃度的增加逐漸升高，其中桑枝水提物對(duì)DPPH自由基的清除率升幅較快，而桑枝醇提物的升幅較慢；相同濃度下，桑枝提取物對(duì)DPPH自由基的清除率低于VC；在0.4～1.4 mg·mL-1范圍內(nèi)，克拉瑪依桑枝水提物對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于桑枝飲片水提物。

2.2 桑枝提取物對(duì)羥基自由基的清除率(圖2)

圖2 桑枝提取物對(duì)羥基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of hydroxyl free radicals by Ramulus mori extracts

由圖2可知，桑枝提取物對(duì)羥基自由基的清除率隨著提取物濃度的增加逐漸升高；在0.7～2.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，桑枝水提物對(duì)羥基自由基的清除率高于VC，其中，克拉瑪依桑枝水提物對(duì)羥基自由基的清除能力最強(qiáng)，在濃度為1.5 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到70.4%。

2.3 桑枝提取物的還原能力(圖3)

圖3 桑枝提取物的還原能力Fig.3 Reducing ability of Ramulus mori extracts

由圖3可知，桑枝提取物具有一定的還原能力，且隨著提取物濃度的增加逐漸增強(qiáng)；相同濃度下，克拉瑪依桑枝醇提物的還原能力強(qiáng)于其它3種提取物，但均弱于VC。

2.4 桑枝提取物對(duì)ABTS自由基的清除率(圖4)

圖4 桑枝提取物對(duì)ABTS自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS free radicals by Ramulus mori extracts

由圖4可知，相同濃度下，桑枝提取物對(duì)ABTS自由基的清除率均低于VC；克拉瑪依桑枝水提物對(duì)ABTS自由基的清除率高于桑枝飲片水提物，克拉瑪依桑枝醇提物對(duì)ABTS自由基的清除率整體高于桑枝飲片醇提物；當(dāng)濃度為0.20 mg·mL-1時(shí)，克拉瑪依桑枝醇提物對(duì)ABTS自由基的清除能力與VC接近。

2.5 桑枝提取物的抑菌活性

100 mg·mL-1桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，抑菌圈直徑如表1所示。

a,b,c.大腸桿菌 d,e,f.金黃色葡萄球菌

表1 桑枝提取物的抑菌圈直徑/mm

由表1可知，當(dāng)濃度為100 mg·mL-1時(shí)，克拉瑪依桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性，抑菌圈直徑最小值為7.6 mm，最大值為9.0 mm；克拉瑪依桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性接近或優(yōu)于桑枝飲片提取物。

3 結(jié)論

克拉瑪依桑枝提取物對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基均具有較強(qiáng)的清除能力；當(dāng)濃度為1.5 mg·mL-1時(shí)，克拉瑪依桑枝水提物對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到70.4%，清除能力優(yōu)于VC；當(dāng)濃度為100 mg·mL-1時(shí)，克拉瑪依桑枝提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性，抑菌圈直徑最小值為7.6 mm，最大值為9.0 mm?？死斠郎Ｖμ崛∥锏目寡趸钚约耙志钚越咏騼?yōu)于桑枝飲片提取物，為新疆蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了理論依據(jù)。