鼠尾藻多糖的超聲-微波聯(lián)用提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

劉亞倩，許海燕，王 珊，任曉東

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

鼠尾藻(Sargassumthunbergii)為褐藻門馬尾藻科的一種植物，主要分布在我國遼寧、山東、江浙一帶[1-2]。鼠尾藻營養(yǎng)豐富，藥用與保健價(jià)值較高，是優(yōu)質(zhì)的天然餌料，在醫(yī)藥、化工、廢水處理等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[3-6]。鼠尾藻多糖具有降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[7-8]。鼠尾藻多糖的提取多采用超聲提取法或微波提取法[9-10]，而超聲-微波聯(lián)用技術(shù)具有溶劑用量少、提取時間短、提取率高等特點(diǎn)，應(yīng)用于中藥有效成分提取具有更大的優(yōu)勢[11-12]。鑒于此，作者采用超聲-微波聯(lián)用技術(shù)提取鼠尾藻多糖，通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并通過測定鼠尾藻多糖對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，評價(jià)其抗氧化活性，擬為鼠尾藻的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

鼠尾藻(100目)，山東省長島鴻利餌料有限公司。

D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、維生素C(VC)標(biāo)準(zhǔn)品、ABTS、DPPH，上海源葉生物科技有限公司。

TU-1950型雙光束紫外分析儀，北京普析通用儀器有限公司；XH-300A型電腦微波超聲波組合合成萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；LGJ-12D型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)起航科技有限公司。

1.2 鼠尾藻多糖的提取[13]

稱取適量100目鼠尾藻粉末，按液料比8∶1(mL∶g,下同)加入95%乙醇，于70 ℃下連續(xù)回流提取4 h；過濾，將濾渣低溫干燥，去除脂類及色素等雜質(zhì)后用萬能粉碎機(jī)粉碎，置于具塞錐形瓶中，加入適量純化水，置于電腦微波超聲波組合合成萃取儀內(nèi)，設(shè)置時間、溫度、超聲功率、微波功率等參數(shù)進(jìn)行提??；提取液經(jīng)抽濾后，采用Sevage法去除蛋白[14]；按體積比2∶1向提取液中加入氯仿-正丁醇(5∶1，體積比)混合液，混合后振搖30 min，4 000 r·min-1離心5 min，上清液即為鼠尾藻多糖提取液。

1.3 鼠尾藻多糖提取率的測定

1.3.1 D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.010 8 g，加純化水溶解后移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，得濃度為0.108 mg·mL—1的D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。參照文獻(xiàn)[15]分別精密移取D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL置于25 mL容量瓶中，加入純化水至2 mL，混勻；加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻；快速滴加濃硫酸5 mL，充分搖勻；靜置10 min后，于40 ℃水浴保溫20 min，冷卻至室溫，測定490 nm處吸光度。以2 mL純化水加入相應(yīng)的試劑作為空白。以D-葡萄糖濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程為：A=0.0545c+0.2303，R2=0.9996。表明D-葡萄糖濃度在1.35～20.25 μg·mL—1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.3.2 鼠尾藻多糖提取率的計(jì)算

稱取鼠尾藻粉末1.000 0 g，按1.2方法制備鼠尾藻多糖提取液；精密量取2 mL提取液于100 mL容量瓶中，加純化水定容至刻度，即得鼠尾藻多糖樣品溶液。取樣品溶液，按1.3.1方法測定吸光度，按式(1)計(jì)算鼠尾藻多糖提取率：

(1)

式中：c為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到的多糖濃度，μg·mL—1；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為鼠尾藻粉末質(zhì)量，g。

1.4 超聲-微波聯(lián)用提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)[16-17]

分別考察提取時間(15 min、30 min、45 min、60 min、75 min)、微波功率(150 W、250 W、350 W、450 W、550 W)、超聲功率(200 W、250 W、300 W、350 W、400 W)、液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1)對鼠尾藻多糖提取率的影響。

1.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以鼠尾藻多糖提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert軟件，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化鼠尾藻多糖的超聲-微波聯(lián)用提取工藝。

1.5 抗氧化活性評價(jià)

1.5.1 DPPH自由基清除率的測定

參照文獻(xiàn)[18]配制0.2 mmol·L—1的DPPH自由基溶液。取2 mL不同濃度的鼠尾藻多糖提取液，加入2 mL DPPH自由基溶液，混勻，置于暗室充分反應(yīng)30 min，測定517 nm處吸光度，重復(fù)測定3次，取平均值；以VC為陽性對照。按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率，再通過SPSS軟件計(jì)算半數(shù)清除率(IC50)。

(2)

式中：A0為2 mL DPPH自由基溶液+2 mL無水乙醇的吸光度；A1為2 mL鼠尾藻多糖提取液+2 mL無水乙醇的吸光度；A2為2 mL DPPH自由基溶液+2 mL鼠尾藻多糖提取液的吸光度。

1.5.2 ABTS自由基清除率的測定

參照文獻(xiàn)[19]配制7 mmol·L—1的ABTS自由基溶液及140 mmol·L—1的過硫酸鉀溶液。將5 mL 7 mmol·L—1ABTS自由基溶液與88 μL 140 mmol·L—1過硫酸鉀溶液混勻，避光放置14 h，使用前加水稀釋至734 nm處吸光度為0.7左右，即得ABTS自由基工作液。

參照文獻(xiàn)[20]，取3 mL ABTS自由基工作液與1 mL無水乙醇混勻，振蕩10 s后靜置30 min，作為對照組；將1 mL不同濃度的鼠尾藻多糖提取液與3 mL ABTS自由基工作液混勻，振蕩10 s后靜置6 min，測定734 nm處吸光度，重復(fù)測定3次，取平均值；以VC為陽性對照。按式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率，再通過SPSS軟件計(jì)算IC50。

(3)

式中：A0為3 mL ABTS自由基工作液+1 mL無水乙醇的吸光度；A1為3 mL ABTS自由基工作液+1 mL鼠尾藻多糖提取液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時間對鼠尾藻多糖提取率的影響(圖1)

由圖1可知，隨著提取時間的延長，鼠尾藻多糖提取率逐漸升高，當(dāng)提取時間為30 min時，多糖提取率達(dá)到最高；繼續(xù)延長提取時間，由于超聲空化和機(jī)械力作用，多糖提取率反而降低。因此，選擇30 min為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)提取時間的中心點(diǎn)。

圖1 提取時間對鼠尾藻多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

2.1.2 微波功率對鼠尾藻多糖提取率的影響(圖2)

由圖2可知，隨著微波功率的增大，鼠尾藻多糖提取率逐漸升高，當(dāng)微波功率為350 W時，多糖提取率達(dá)到最高；繼續(xù)增大微波功率，多糖提取率逐漸下降。這是由于，微波作用下鼠尾藻細(xì)胞破裂，多糖溶出，多糖提取率升高；當(dāng)微波功率超過350 W后，由于高溫和高壓的作用，鼠尾藻內(nèi)部出現(xiàn)凝固，抑制多糖溶出，多糖提取率反而降低。因此，選擇350 W為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)微波功率的中心點(diǎn)。

圖2 微波功率對鼠尾藻多糖提取率的影響Fig.2 Effect of microwave power on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

2.1.3 超聲功率對鼠尾藻多糖提取率的影響(圖3)

由圖3可知，隨著超聲功率的增大，鼠尾藻多糖提取率逐漸升高，當(dāng)超聲功率為300 W時，多糖提取率達(dá)到最高；繼續(xù)增大超聲功率，多糖提取率逐漸下降。這是由于，隨著超聲功率的增大，超聲波機(jī)械作用力增強(qiáng)，細(xì)胞破壁加速，多糖溶出增多，多糖提取率相應(yīng)升高；但超聲功率超過300 W后，多糖發(fā)生降解，多糖提取率反而下降。因此，選擇300 W為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)超聲功率的中心點(diǎn)。

圖3 超聲功率對鼠尾藻多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

2.1.4 液料比對鼠尾藻多糖提取率的影響(圖4)

由圖4可知，隨著液料比的增大，即提取溶劑用量的增加，鼠尾藻多糖提取率逐漸升高，當(dāng)液料比為25∶1時，多糖提取率達(dá)到最高；繼續(xù)增加提取溶劑用量，多糖提取率逐漸降低。可能是由于，提取溶劑用量過多時，超聲波受到水的阻力及物質(zhì)平衡原理抑制多糖溶出。因此，選擇25∶1為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)液料比的中心點(diǎn)。

圖4 液料比對鼠尾藻多糖提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(表1)

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到回歸模型方程為：Y=9.18+0.088A+0.053B+0.036C+0.080D-0.075AB+0.018AD+0.010BC-0.055BD-0.043CD-0.48A2-0.15B2-0.34C2-0.11D2。

回歸模型的方差分析見表2。

表2 方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對鼠尾藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對鼠尾藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between various factors on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

由圖5可知，提取時間與微波功率、微波功率與液料比的響應(yīng)曲面陡峭，且等高線圖呈橢圓，顯示二者之間交互作用強(qiáng)，對鼠尾藻多糖提取率的影響顯著，且提取時間的影響大于微波功率、液料比。

2.2.3 最佳工藝的確定及工藝驗(yàn)證

根據(jù)回歸模型得到超聲-微波聯(lián)用提取鼠尾藻多糖的最佳工藝條件為：提取時間31.37 min、微波功率359.24 W、超聲功率301.65 W、液料比26.73∶1?？紤]實(shí)際操作的可行性，將最佳工藝調(diào)整為：提取時間31 min、微波功率359 W、超聲功率302 W、液料比27∶1，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到鼠尾藻多糖平均提取率為9.19%，與預(yù)測值(9.20%)的相對誤差為0.11%，說明優(yōu)化的提取工藝切實(shí)可行。

2.3 不同提取方法的比較

分別采用微波、超聲、超聲-微波聯(lián)用方法提取鼠尾藻多糖，結(jié)果見表3。

表3 不同提取方法的比較(n=3)

由表3可知，采用超聲-微波聯(lián)用方法提取鼠尾藻多糖，多糖提取率達(dá)到9.19%，明顯高于單一微波提取和超聲提取，分別較微波提取和超聲提取提高了13.60%和25.03%。

2.4 抗氧化活性評價(jià)

2.4.1 DPPH自由基清除能力(圖6)

圖6 鼠尾藻多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of DPPH free radicals of polysaccharides from Sargassum thunbergii

由圖6可知，鼠尾藻多糖對DPPH自由基有一定的清除能力，且清除率隨鼠尾藻多糖濃度的增加逐漸升高，在濃度為0.4 mg·mL-1時，清除率達(dá)到60%以上；繼續(xù)增加濃度，DPPH自由基清除率變化不大。VC對DPPH自由基的清除能力略高于鼠尾藻多糖，當(dāng)濃度為0.4 mg·mL-1時，清除率達(dá)到90%以上。鼠尾藻多糖、VC對DPPH自由基的IC50值分別為0.311 mg·mL—1、0.001 mg·mL—1。

2.4.2 ABTS自由基清除能力(圖7)

圖7 鼠尾藻多糖對ABTS自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of ABTS free radicals of polysaccharides from Sargassum thunbergii

由圖7可知，鼠尾藻多糖對ABTS自由基的清除率隨鼠尾藻多糖濃度的增加逐漸升高，當(dāng)濃度為1.0 mg·mL-1時，清除率達(dá)到80%以上；繼續(xù)增加濃度，ABTS自由基清除率升幅趨緩。VC對ABTS自由基的清除能力略高于鼠尾藻多糖，在濃度為0.2 mg·mL-1時，清除率達(dá)到90%以上。鼠尾藻多糖、VC對ABTS自由基的IC50值分別為0.288 mg·mL—1、0.035 mg·mL—1。由此可見，鼠尾藻多糖在一定濃度范圍內(nèi)對ABTS自由基有較強(qiáng)的清除能力，且優(yōu)于對DPPH自由基的清除能力。

3 結(jié)論

以鼠尾藻多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化鼠尾藻多糖的超聲-微波聯(lián)用提取工藝，并通過測定鼠尾藻多糖對 DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，評價(jià)其抗氧化活性。確定鼠尾藻多糖的最佳提取工藝為：提取時間31 min、微波功率359 W、超聲功率302 W、液料比27∶1(mL∶g)，在此條件下，鼠尾藻多糖提取率可達(dá)9.19%。鼠尾藻多糖具有一定的抗氧化活性，對ABTS自由基的清除能力(IC50=0.288 mg·mL—1)優(yōu)于對DPPH自由基的(IC50=0.311 mg·mL—1)。